利用MLST技术对浙江省大肠杆菌O157的分子流行病学研究

目的对浙江省2005-2010年大肠杆菌O157分离株进行分子分型研究,了解菌株间的遗传进化关系,为浙江省大肠杆菌O157监测及爆发疫情的控制提供基础。方法选择Pasteur大肠杆菌多位点序列分型（Multilocus SequenceTyping,MLST）方案,对大肠杆菌O157分离株及882364菌株进行MLST分型,确定菌株序列型（Sequence type,ST）;采用DNAsp、eBURST、START2等软件进行分析。结果 30株菌中,27株O157∶H7菌株具备相同序列型（ST-284）,占90%（27/30）,其他3株菌序列型分别为ST-367、ST-125、ST-296。8个管家基因核苷酸多态性（Pi）范围为0.00119（polB）～0.00648（uidA）,putP基因多态性位点比例最高（4.6%）,trpA基因多态性位点比例最低（0.4%）。进化分析结果显示,这些序列型分别属于Group 1及Group 11群。结论浙江省动物源性大肠杆菌O157∶H7的主要序列型为ST-284,与江苏省病人株882364（ST-296）具有同一个进化祖先,提示应加强浙江省大肠杆菌O157病原学监测。     

牦牛携带的产志贺毒素大肠杆菌分离株的多位点序列分型研究

目的 对牦牛携带的产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)进行多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)分析,了解菌株的遗传进化关系及致病潜力。方法 根据E. coli MLST数据库(http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli)提供的MLST方案,对青海玉树牦牛中分离的54株STEC分离株的7个管家基因进行PCR扩增并测序,通过序列比对确定其等位基因及菌株序列型(Sequence type,ST),并使用BioNumerics软件构建最小生成树(Minimum spanning tree,MST),分析牦牛ST型与HUSEC及人源主要流行血清群STEC菌株ST型间的进化关系。结果 54株牦牛STEC菌株呈现高度遗传多态性,可分为31个ST型别,其中包括7个新的等位基因型和17个新的ST型,并存在与HUSEC及主要流行血清群STEC亲缘关系相同或相近的ST型别。结论 青藏高原牦牛携带的STEC具有遗传多样性及一定的特异性,部分菌株具有对人致病的潜力。     

美国《Emerging Infectious Diseases》2011年第2期有关人兽共患病论文摘译

P180 2000—2009年瑞士人感染非0157产志贺毒素大肠杆菌／／Ursula Kappeli,Herbert Hachler,Nicole Giezendanner,等 我们分析瑞士国家参比实验室的97株从2000-2009年病人中分离列的非O157产志贺毒素（stx）大肠杆菌的特征。     

浙江省O157大肠杆菌监测及其分子生物学特性

目的了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7和其他O157大肠杆菌在浙江省动物、人群中的分布、流行以及PFGE分型、毒力基因携带状况。方法按全国O157∶H7监测方案在5-10月份肠道传染病高发季节,采集全省各地(市)肠道门诊腹泻病人粪便,进行O157大肠杆菌分离培养,并用免疫磁珠分离法对浙江省5个监测点的宿主动物进行O157∶H7分离培养、鉴定,可疑菌株以PCR法检测O157∶H7抗原、志贺样毒素(stx1和stx2)、粘附抹平因子(eaeA)及溶血素(hly)4种毒力基因。用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法进行同源性分析,同时选择14种抗生素进行药敏试验,并将分析结果与本省首株患者粪便中分离的产志贺样毒素的O157∶H7菌株进行比较。结果全省5个监测点2006年共监测动物粪便标本2377份,分离到4株O157∶H7菌株,阳性率为0.17%;同时在绍兴、舟山肠道门诊腹泻病人粪便中分离到2株O157:H?菌株。4株O157∶H7菌株,stx2、Hly、eaeA均阳性,stx1均阴性;2株O157∶H?菌株仅1株携带eaeA毒力基因。脉冲场凝胶电泳分型显示,4株O157∶H7菌株分3个型,除金华地区2006年分离所得2株完全相似外,其它相同地区不同年代分离的O157∶H7菌株及相同年代不同地区分离的O157∶H7菌株则完全不相似。2株O157∶H?菌株1株PF-GE电泳条带降解,另1株与其它O157∶H7菌株电泳条带差异明显。结论浙江省大肠杆菌0157菌株在动物中以携带stx2毒力基因的O157∶H7菌株为主,但在腹泻患者中则以不带志贺样毒素的O157∶H?菌株为主。不同地区分离的O157∶H7菌株PFGE分型差异明显。羊、奶牛是携带stx2毒力基因的O157∶H7大肠杆菌的主要宿主。各级疾控应加强对宿主动物和腹泻病人大肠杆菌O157的分离监测和流行病学调查。     

上海地区2006-2009年分离的大肠埃希菌O157特征分析研究

目的分析2006年至2009年在上海地区各监测点从病人、动物粪便及食品中分离的13株大肠埃希菌O157（E.coliO157）携带毒力基因的情况,分子分型特征及各菌株之间的相关性。方法利用聚合酶链反应（PCR）和脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术,结合生化鉴定、血清学分型的表型分析方法及Vero细胞毒性试验对上海地区分离的13株E.coliO157进行研究。结果 PCR结果显示有9株菌株的菌体抗原基因O157,鞭毛抗原基因H7及毒力基因stx2,hly,eaeA检测结果均为阳性,其中1株食品分离株的stx1基因检测结果也为阳性;9株菌均对Vero细胞有毒性作用。其余4株牛粪分离株,除O157基因检测结果为阳性外,其他检测结果均为阴性。13株上海分离株可分成6个PFGE型别。其中1株食品分离株与同样带有stx1基因的德国分离株的图谱最为接近;2株腹泻病人分离株属于同一PFGE型别;6株牛粪分离株的PFGE型别相同或高度相似。其余4株不携带毒力基因的牛粪分离株为不相关菌株。结论上海地区从病人、动物粪便和食品中都分离获得了能产生stx毒素的E.coliO157,提示需加强对该菌的监测。     

江苏省肠出血性大肠埃希菌O157的基因PCR-RFLP分型研究

目的对历年从江苏省不同地区分离的肠出血性大肠埃希菌O157（以下简称：O157）进行分型分析。方法采用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）方法对108株O157分子分型,比较不同地区、不同年份菌型差异。结果根据EcoRV限制性酶切图谱可将菌株分成JS01-JS10十个不同的型别。主要菌型JS01占64.9%,JS02型与JS01型菌株酶切图谱相似度很高,JS03和JS04型菌株数目较少（12株）,但近一半属于人源菌株。从时间方面看,1999年分离的菌型最多;从地区方面看,铜山县分离到的菌株型别最为多样化。结论不同菌型之间的致病性存在差异,菌株与地理来源的关系密切。PCR-RFLP方法操作简便、重复性好,为O157的流行病学研究提供了一条全新途径。     

O157大肠埃希菌食品分离株的特征研究

目的掌握福建省E.coliO157∶H7和O157∶H?食品分离株的毒力基因携带状况、PFGE分型特征、抗生素的药敏谱以及产志贺毒素的E.coliO157∶H7菌株的细胞毒性状况。方法分离菌株经VITEK全自动生化系统鉴定;O157和H7单克隆诊断血清凝集;PCR法检测O157、H7抗原基因及毒力因子基因;菌株的分型用PFGE方法进行;采用CLSI推荐的K-B法对菌株进行15种抗生素的药敏试验;对产志贺毒素的分离株用Vero细胞和Cyto Tox 96R○试剂盒进行细胞毒性检测。结果2株E.coliO157∶H7,其O157、H7及Stx2、Hly、eaeA毒力基因均阳性,Stx1基因均阴性;另3株E.coliO157∶H?,其O157基因阳性,H7和Stx1、Stx2、Hly、eaeA毒力基因均阴性;5株菌的PFGE带型各不相同,2株E.coliO157∶H7的同源性较高,达81%;菌株对15种常用抗生素较为敏感,链霉素、甲氧苄啶敏感率稍低为40%,其余敏感率达60%～100%。2株产志贺毒素的菌株对Vero细胞有毒性作用,细菌细胞比位50:1时细胞毒性百分比分别为61.25%和67.80%。结论本省在外环境动物性食品中存在产志贺毒素的E.coliO157∶H7菌株,提示应加强E.coliO157∶H7的监测,预防该菌在本省人间的感染和流行。     

我国羊种3型布鲁氏菌的多位点序列分型研究

目的对2004-2009年从病人标本中分离的羊种3型布鲁氏菌进行遗传多态性分析,了解菌株的遗传特征及遗传进化关系。方法采用多位点序列分型（Multiple locus sequence typing,MLST）技术,对47株布鲁氏菌菌株的7个管家基因、1个外膜蛋白基因及1个基因间区的序列进行测定,将各个基因的序列与标准菌株的等位基因型进行比对,确定其等位基因谱型及菌株序列型（STS）,分析与其它ST型间的遗传关系。结果 47株布鲁氏菌中,19株omp25基因与目前已有的等位基因型不同,被定义为1个新的等位基因型,即ST28。其余28株与已知的ST8型的各等位基因型一致。结论我国流行的羊种布鲁氏菌主要是羊3型菌株,国内的菌株与国外菌株遗传背景上有差异。MLST分型可以作为研究布鲁氏菌进化关系的重要手段之一。     

应用多重PCR方法检测大肠埃希菌O157：H8的初步研究

目的 研究一种快速、特异的检测大肠埃希菌（以下称大肠杆菌）O157：H7的复合PCR方法。方法 选用针对大肠杆菌O157：H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ）和溶血素（Hly)基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157：H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果 除质粒缺失株（933）外,其余11株O157：H7大肠杆菌均在361bp处有溶血素基因产物出现;而12株O157：H8大肠杆菌扩增后的两条志贺样毒素基因产物存在差异,其中6株在210bp、484bp处出现两条相应产物,3株仅有210bp一条SLT－Ⅰ基因产物,另3株仅有484bp的SLT－Ⅱ基因产物。其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌的扩增结果均为阴性。结论 本复合PCR方法具有较高的特异性,可迅速、有效地将O157：H7大肠杆菌与其它常见致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌相鉴别,通过进一步研究有望应用于临床大肠杆菌O157：H7感染的辅助诊断。     

杭州地区单核细胞增生李斯特菌食品分离株分子型别研究

目的研究杭州地区单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)食品分离株的分子分型情况,了解当地流行株的型别特征。方法用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)的方法对单核细胞增生李斯特菌进行分子分型。PFGE结果进行聚类分析,并绘制MLST数据的最小生成树。结果 6个血清型组成的133株杭州食品分离株共获得19个MLST型别,并发现1个新的ST型ST767。ST9和ST121是数量最多的型别。用AscI和ApaI酶切分别获得33和45个PFGE带型。结论杭州地区单核细胞增生李斯特菌食品分离株分子型别分布广泛,大部分菌株是可引起人李斯特菌病的Lineage I和Lineage II菌株。食品中单核细胞增生李斯特菌的污染比较严重,应加强监测与管理以防食源性疾病的发生。     

非O157产志贺毒素大肠埃希菌研究进展

产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)是一类能产生一种或一种以上志贺毒素的大肠埃希菌的总称,包括400余种血清型,其中以O157∶H7血清型为主。近年来,非O157STEC在世界范围内引起散发感染和暴发的报道明显增加,但由于非O157STEC血清型多样,菌株间表型差异较大,目前尚无一种有效的能用于所有非O157STEC菌株分离的方法,因此非O157STEC的流行情况可能被低估。本文就非O157STEC的病原学、致病机制、流行病学特征、实验室诊断、治疗和预防等方面的研究进展做一简要综述。     

Shigella and Shiga toxin-producing Escherichia coli causing bloody diarrhea in Latin America

In Latin America, Shigella and shiga toxin-producing Escherichia coli are the two leading agents in the cause of bloody diarrhea. The already high and increasing antimicrobial resistance of Shigella also is a significant problem. Shiga toxin-producing E. coli is an emerging disease with life-threatening complications: hemolytic uremic syndrome. Although E. coli O157:H7 remains the most commonly recognized serotype, recently emerging, non-O157 bacteria may be the cause of a similar spectrum of disease in humans.     

The United States National Prospective Hemolytic Uremic Syndrome Study: microbiologic, serologic, clinical, and epidemiologic findings

The frequency of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) serotypes associated with postdiarrheal hemolytic uremic syndrome (HUS) cases among children and adults in the United States and the proportion with IgM or IgG lipopolysaccharide antibodies to E. coli O157 were determined by use of a nationwide sample from January 1987 through December 1991. Among 83 patients, STEC were isolated from 30 (43%) of 70 whose stool cultures yielded bacterial growth (25 E. coli O157 isolates and 5 non-O157 STEC isolates). Fifty-three (80%) of 66 patients with serum samples had positive O157 lipopolysaccharide antibody titers. Of the 83 patients, 60 (72%) had evidence of STEC infection, including 6 of 8 adults whose illnesses also met criteria for thrombotic thrombocytopenic purpura. Data from a subset of patients suggest that E. coli O157 was the cause of > or = 80% of the STEC infections. All 3 women who were postpartum had evidence of E. coli O157 infection. STEC infection should be considered the likely cause for all persons with postdiarrheal HUS.     

Non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli infections in the United States, 1983-2002

BACKGROUND: Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O157:H7 is a well-recognized cause of bloody diarrhea and hemolytic-uremic syndrome (HUS). Non-O157 STEC contribute to this burden of illness but have been underrecognized as a result of diagnostic limitations and inadequate surveillance. METHODS: Between 1983 and 2002, 43 state public health laboratories submitted 940 human non-O157 STEC isolates from persons with sporadic illnesses to the Centers for Diseases Control and Prevention reference laboratory for confirmation and serotyping. RESULTS: The most common serogroups were O26 (22%), O111 (16%), O103 (12%), O121 (8%), O45 (7%), and O145 (5%). Non-O157 STEC infections were most frequent during the summer and among young persons (median age, 12 years; interquartile range, 3-37 years). Virulence gene profiles were as follows: 61% stx(1) but not stx(2); 22% stx(2) but not stx(1); 17% both stx(1) and stx(2); 84% intimin (eae); and 86% enterohemolysin (E-hly). stx(2) was strongly associated with an increased risk of HUS, and eae was strongly associated with an increased risk of bloody diarrhea. STEC O111 accounted for most cases of HUS and was also the cause of 3 of 7 non-O157 STEC outbreaks reported in the United States. CONCLUSIONS: Non-O157 STEC can cause severe illness that is comparable to the illness caused by STEC O157. Strains that produce Shiga toxin 2 are much more likely to cause HUS than are those that produce Shiga toxin 1 alone. Improving surveillance will more fully elucidate the incidence and pathological spectrum of these emerging agents. These efforts require increased clinical suspicion, improved clinical laboratory isolation, and continued serotyping of isolates in public health laboratories.     

Bacterial genetic determinants of non-O157 STEC outbreaks and hemolytic-uremic syndrome after infection

Although O157:H7 Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) are the predominant cause of hemolytic-uremic syndrome (HUS) in the world, non-O157:H7 serotypes are a medically important cause of HUS that are underdetected by current diagnostic approaches. Because Shiga toxin is necessary but not sufficient to cause HUS, identifying the virulence determinants that predict severe disease after non-O157 STEC infection is of paramount importance. Disease caused by O157:H7 STEC has been associated with a 26-gene pathogenicity island known as O island (OI) 122. To assess the public-health significance of this pathogenicity island, we examined the association between OI122 genes and outbreaks and HUS after non-O157 STEC infection. We found that a subset of OI122 genes is independently associated with outbreaks and HUS after infection with non-O157 STEC. The presence of multiple virulence genes in non-O157 serotypes strengthened this association, which suggests that the additive effects of a variable repertoire of virulence genes contribute to disease severity. In vivo, Citrobacter rodentium mutants lacking outbreak- and HUS-associated genes were deficient for virulence in mice; in particular, nleB mutant bacteria were unable to cause mortality in mice. The present study shows that virulence genes associated epidemiologically with outbreaks and HUS after non-O157 STEC infection are pivotal to the initiation, progression, and outcome of in vivo disease.     

多位点序列分型(MLST)在艾伯特埃希菌鉴定中的应用

目的探讨多位点序列分型技术在新病原艾伯特埃希菌发现与鉴定中的应用。方法采用MLST技术对生鲜肉中分离的30株疑似艾伯特埃希菌的7个管家基因进行PCR扩增、测序、DNAstar软件分析,核酸序列上传至大肠杆菌MLST数据库进行比对,确定其等位基因编号及基因序列型(ST型),并利用MEGA6.0软件Neighbor-joining法构建遗传进化树,与大肠埃希菌、志贺氏菌、艾伯特埃希菌和伤寒沙门氏菌参考菌株进行亲缘性分析。结果30株菌可分为7种新序列型(16株)和4种已知序列型(14株),N-J分析显示与艾伯特埃希菌参考菌株具有高度亲缘性,而与大肠埃希菌、志贺氏菌、弗格森埃希菌和鼠伤寒沙门氏菌存在较大差异。结论MLST在管家基因水平上准确地确定艾伯特埃希菌的种属关系,首次在国内发现艾伯特埃希菌的存在。     

中国汉赛巴尔通体分离株的多位点序列分型分析

目的 了解中国汉赛巴尔通体的遗传背景和流行的常见亚型。方法 对分离到的汉赛巴尔通体应用多位点序列分型方法（Multilocus sequence typing, MLST）,分析它们的分子流行病学特征和系统发育情况。结果 80株汉赛巴尔通体一共分为3个序列型（sequence type, ST）,其中ST1占90% (72/80),ST9占8.75% (7/80),另一个序列型为仅包含一株细菌的ST30;所有3个序列型均属于克隆群1 （clonal complex 1）。结论 与国外汉赛巴尔通体多位点序列分型结果相比,中国的序列型相对集中,说明中国汉赛巴尔通体的变异度和多样性较低,提示其进化相对缓慢。