大鼠肌源性干细胞体外转分化为胰岛素分泌细胞

目的 探讨体外自体肌源性干细胞(MDSCs)定向诱导分化为胰岛素分泌细胞团的可行性。方法 用差速贴壁的方法对SD大鼠MDSCs进行分离和培养,加入联合诱导剂培养7～12d。通过形态学观察、双硫腙(DTZ)染色、免疫细胞化学染色、葡萄糖刺激实验和RT-PCR,对诱导细胞进行体外结构和功能鉴定。 结果 联合诱导后12d有典型的胰岛样结构出现;诱导后第12天细胞团表达胰岛素,而未诱导组细胞不表达;诱导后第7天检测到胰岛素 (INS)、胰高血糖素(GLU)和生长抑素(SS)基因的表达。 结论 体外诱导大鼠肌源性干细胞可定向分化为胰岛素分泌细胞存在可行性,本实验将可能为临床糖尿病干细胞治疗提供新的途径。     

胰腺干细胞体外培养扩增的方法

背景：胰腺干细胞在体外培养时极易分化,很难获得足够数量的胰腺干细胞。 目的：探讨一种简便易行的胰腺干细胞体外扩增培养方法。 方法：分离新生昆明小鼠胰腺,原代培养三四天,成纤维细胞中出现呈集落生长的胰腺干细胞后,以0.02%EDTA消减成纤维细胞的数量,降低其比例后继续培养,待细胞铺满培养瓶底的80%时,重复三四次,逐渐提高胰腺干细胞的数量。检测胰腺干细胞特异性标志Nestin。尼克酰胺诱导胰腺干细胞分化;双硫腙染色对胰岛样细胞团进行检测。 结果与结论：消减胰腺成纤维细胞的数量及比例后,胰腺干细胞可持续表现出活跃的分裂增殖能力,胰腺干细胞的数量显著增加;细胞保持球形、单个大核、细胞质折光性强、表达(Nestin)。扩增的胰腺干细胞,以尼克酰胺诱导后分化为胰岛样细胞团,双硫腙染色阳性。提示,减少共培养中成纤维细胞的比例和数量,有利于胰腺干细胞的增殖,获得较多数量的胰腺干细胞。扩增后的胰腺干细胞仍保持未分化状态,在适当的体外诱导条件下能分化为胰岛样结构,具有一定的分化潜能。     

兔脂肪干细胞体外诱导分化为胰岛β样细胞的可行性

背景：胚胎干细胞、胰腺干细胞、肝卵圆细胞、小肠上皮干细胞和骨髓间充质干细胞均可以在体外诱导分化为胰岛β样细胞,那么脂肪干细胞是否也可以呢？ 目的：探讨兔脂肪干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性。 方法：以常规方法从兔脂肪抽吸物中分离、培养脂肪干细胞;传2代后,用高浓度葡萄糖(25 mmol/L)培养液DMEM以及碱性成纤维生长因子和尼克酰胺诱导兔脂肪干细胞向胰岛β样细胞分化。 结果与结论：第2代兔脂肪干细胞经过高糖诱导后,细胞形成细胞团;并且形成了双硫腙染色阳性的细胞团;免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性。说明兔脂肪干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能。     

体外定向诱导小鼠胰腺干细胞分化形成胰岛样结构

目的体外探讨胰腺干细胞形成胰岛样结构并对其进行相关检测,探寻胰腺干细胞分化为胰岛样结构可行性及初步鉴定的技术方法。方法从新生小鼠胰腺组织中通过原位传代扩增培养获得富足数量PSC,以尼克酰胺定向诱导PSC,观察细胞的形态变化、形成的细胞团双硫腙染色、免疫荧光组织化学染色及Mallory染色鉴定。结果PSC集落分布,细胞为单个大核、胞质折光透亮,巢蛋白(nestin)及碱性磷酸酶(AKP)染色阳性;诱导后聚集成团,最终形成具被膜包裹的细胞团;双硫腙染色阳性,胰岛素免疫荧光染色可见胞质被激发出绿色荧光的胰岛素阳性细胞;细胞团中央β样细胞及周围α样细胞,形成类似正常胰岛细胞组成的胰岛样结构。结论胰腺干细胞在适宜条件下可定向分化,形成胰岛样结构。     

大鼠胰腺提取液体外诱导肌源性干细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的:探讨大鼠胰腺提取液(RPE)对大鼠肌源性干细胞(MDSCs)定向诱导分化为胰岛素分泌细胞的作用.方法:RPE诱导MDSCs通过形态学观察、双硫腙(DTZ)染色、免疫细胞化学显色、葡萄糖刺激实验和RT-PCR,对诱导细胞进行体外结构和功能鉴定.结果:RPE诱导后第5日有胰岛样结构出现;免疫细胞化学显示,诱导后第12日细胞团表达胰岛素、胰高血糖素,而未诱导组细胞不表达上述蛋白;RT-PCR结果表明.诱导后第6日检测到PDX-1的表达,诱导后第12日检测到胰岛素1、胰岛素2、胰高血糖素和葡萄糖转运体2基因的表达.结论:体外经RPE诱导,大鼠肌源性干细胞可定向分化为胰岛素分泌细胞.     

Conophylline与尼克酰胺联合诱导脂肪源干细胞为功能性类胰岛细胞

背景：1型糖尿病的胰岛移植治疗一直面临供体来源不足与免疫排斥两大关键问题,寻找一种自体来源的种子细胞通过组织工程方法制备类胰岛组织可以提供充足新型供体、降低异基因供体移植的不良反应。 目的：分析成人脂肪干细胞体外分化为对葡萄糖敏感、可分泌胰岛素的功能性胰岛样细胞团的能力,探索体外制备类胰岛组织的技术路线。 方法：首先分离纯化人体脂肪干细胞,采用新型植物诱导剂Conophylline与其他诱导因子的不同组合将脂肪干细胞诱导分化为胰岛样细胞团,观察不同组合的诱导分化效率,并利用特异性染色、RT-PCR,免疫细胞化学等方法对诱导分化后的细胞团在基因水平与蛋白水平上进行鉴定,最后用ELISA法检测细胞团在不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌情况。 结果与结论：脂肪干细胞具有多能干细胞特性,可诱导分化为具有胰岛素分泌和葡萄糖浓度反应性类胰岛细胞团;Conophylline与尼克酰胺联合诱导可大幅度提高诱导分化效率。     

尼克酰胺与胰腺损伤提取物诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素产生细胞的比较

目的 探讨诱导小鼠骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣs）分化为胰岛素产生细胞较好的方法。 方法 大鼠胰腺提取物和尼克酰胺分别诱导小鼠的BMSCs分化,经免疫组织化学、双硫腙染色、放射免疫学方法和RT-PCR技术（Ins-1、Ins-2、Glut-2、GK）鉴定两种诱导方法诱导细胞的分化程度。 结果 两种方法诱导后的细胞均可以表达胰岛素。双硫腙染色和胰岛素免疫组织化学的染色结果发现,两种分化后的细胞无明显差异。放射免疫学检测胰岛素及C肽片段：两种分化后的细胞表达的胰岛素随25mmol/L葡萄糖刺激时间的延长产生的胰岛素分泌曲线有明显差别,尼克酰胺分化的小鼠BMSCs产生的胰岛素产生细胞（IPCs）与正常小鼠胰岛细胞的曲线一致性欠佳,而大鼠胰腺损伤提取物分化的小鼠骨髓间充质干细胞产生的胰岛素产生细胞的分泌曲线一致性很好。尼克酰胺分化后的细胞不能产生C肽片段,而大鼠胰腺损伤提取物能够表达C肽片段。RT-PCR结果显示,尼克酰胺与大鼠胰腺提取物均可以表达胰岛细胞相关的几个mRNA（Ins-1、Ins-2、Glut-2、GK）。 结论 大鼠胰腺提取物与尼克酰胺相比,可能是一种较好的诱导BMSCs分化成熟产生胰岛素的诱导剂。     

体外PLGA三维支架上诱导小鼠骨髓干细胞向胰岛样细胞分化

目的 研究聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）三维支架在骨髓干细胞向胰岛样细胞诱导分化中的作用.方法 分别在平面和PLGA三维支架上对小鼠骨髓干细胞向胰岛样细胞进行诱导分化,对2组诱导分化的胰岛样细胞进行形态学观察和功能检测,对照组为小鼠胰岛细胞.结果 2组诱导分化的胰岛样细胞均呈双硫腙（DTZ）染色阳性,胰岛素、C肽双染阳性,胰高血糖素阳性和生长抑素阳性;在高糖刺激下,PLGA三维支架组的胰岛素分泌量较平面组显著提高（P＜0.01）.电镜提示诱导分化的胰岛样细胞具有类似β细胞的超微结构且与支架有良好的相容性.结论 PLGA三维支架有益于提高骨髓干细胞诱导分化的胰岛样细胞功能,且与胰岛样细胞具有良好的相容性.     

大鼠骨髓间质干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的实验研究

目的研究体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）横向分化为胰岛素分泌细胞的可能性,并了解该细胞是否具备分泌胰岛素和胰高血糖素的功能.方法从健康成年大鼠骨髓中分离BMSCs,通过传代对细胞进行纯化和扩增.采用两期诱导方案,用诱导液1使BMSCs向巢蛋白（nestin）阳性的祖细胞分化;用诱导液2使nestin阳性的祖细胞向胰岛素分泌细胞分化.用双硫腙染色鉴定胰岛素分泌细胞团;免疫细胞化学法检测诱导前后nestin、胰岛素及胰高血糖素蛋白的表达;采用放射免疫分析法检测葡萄糖刺激后上清中胰岛素的量.结果BMSCs经第一期诱导5d可分化成nestin阳性的祖细胞,双硫腙染色阳性.免疫细胞化学显示,经两期,诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素等激素.放射免疫分析结果显示,诱导后的细胞团可以分泌胰岛素,糖反应性较弱.结论健康成年大鼠骨髓间质干细胞在体外可以被诱导分化为胰岛样细胞团,且具有可重复性.     

体外诱导人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞的分化

背景:体外实验中人们发现,常规诱导骨髓间充质干细胞分化的胰岛β样细胞由于种种原因限制了其进一步的应用。关于人脐带间充质干细胞是否可以成功诱导的胰岛β样细胞尚未见系统报道。目的:进一步验证人脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的可行性。方法:采用胶原酶消化法分离人脐带细胞进行贴壁培养;传2代后,用高浓度葡萄糖(25mmol/L)培养液DMEM(含体积分数为10%胎牛血清)以及碱性成纤维细胞和尼克酰胺诱导脐带间充质干细胞向胰岛β样细胞分化。倒置显微镜下观察间充质干细胞诱导后的形态变化,用胰岛β细胞特异染色方法双硫腙染色鉴定诱导后细胞游离锌离子浓度;免疫细胞化学鉴定诱导后细胞内是否储存有胰岛素。结果与结论:第2代脐带间充质干细胞经过高糖诱导后,间充质干细胞形成细胞团;并且形成了双硫腙染色阳性的细胞团;免疫细胞化学表明诱导后细胞内的细胞胰岛素染色阳性。结果表明人脐带分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛β样细胞,这种胰岛β样细胞具有表达、储存胰岛素的功能。