柠檬酸合成酶对卵巢癌SKOV3细胞上皮间质转化的影响

目的:探讨柠檬酸合成酶（citrate synthase,CS）对上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）细胞SKOV3上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）及生物学行为的影响。方法:利用Lipofectamine 2000体外瞬时转染化学法合成的CS siRNA,通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Western blot检测转染效率;Transwell实验检测转染前后SKOV3细胞侵袭和迁移能力的变化;Western blot检测转染前后上皮标记分子E-cadherin、间质标记分子Vimentin蛋白水平和Wnt通路关键分子β-catenin蛋白水平,实时荧光定量PCR检测转染前后EMT相关转录因子Slug、Snail和Twist的mRNA水平。结果:siRNA干扰序列显著降低SKOV3细胞中CS表达;CS低表达显著抑制SKOV3细胞的侵袭和迁移能力,促进上皮标记分子E-cadherin表达,抑制间质标记分子Vimentin表达,降低Wnt通路关键分子β-catenin表达;EMT相关转录因子Snail和Twist表达显著降低(P＜0.001,P＜0.01),Slug表达下降不显著(P＞0.05)。结论:CS低表达显著抑制卵巢癌SKOV3细胞EMT,其机制可能是通过降低Snail和Twist转录因子实现的,为卵巢癌的转移治疗提供初步的实验及理论基础。     

CD59 RNAi逆转录病毒载体转染卵巢癌细胞株A2780的构建

目的获得携带针对人CD59基因p SUPER retro RNAi逆转录病毒载体的卵巢癌细胞株A2780。方法设计能转录产生靶向CD59小发夹RNA(sh RNA)转染逆转录病毒载体p SUPER retro neo+gfp质粒,构建p SUPER-si CD59重组质粒,将重组质粒导入卵巢癌细胞株A2780内。鉴定转染后细胞株能形成稳定的扩增。结果重组质粒经PCR凝胶电泳、核苷酸测序证实与设计序列一致;重组质粒转染卵巢癌细胞株A2780,可稳定表达绿色荧光蛋白。结论携带针对人CD59基因p SUPER retro RNAi逆转录病毒载体的卵巢癌细胞株A2780的建立为深入进行肿瘤细胞研究奠定了基础。     

Short hairpin RNA-mediated MDR1 gene silencing increases apoptosis of human ovarian cancer cell line A2780/taxol

Objective: Recurrent ovarian cancer is often resistant to drugs such as paclitaxel. Short hairpin RNA (shRNA) targeting MDR1, a gene involved in the process of drug resistance, may be a promising strategy to overcome drug resistance. Methods: Construction and identification of eukaryotic expression plasmid of shRNA targeting on MDR1 gene. The plasmid was transiently transfected into human ovarian cancer cell line A2780/Taxol. Apoptosis was determined by flow cytometry using annexin V-FITC/PI double labeling. Expression of MDR1 mRNA was detected by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and P-glycoprotein expression was detected using Western blot. Results: The IC50 of paclitaxel in MDR1 shRNA-transfected group was significantly reduced (1.986±0.153) μmol/ml as compared with that in negative control (5.246±0.107) μmol/ml and empty vector-transfected group (5.212±0.075) μmol/ml (P<0.05). The percent of the relative reverse sensitivity to paclitaxel on A2780/Taxol cells was 67.1%, and the apoptotic rate was significantly increased [(6.977±0.333)%] compared with control [(1.637±0.111)%] and empty vector-transfected group [(1.663±0.114)%] (P<0.05). Expressions of MDR1 mRNA and P-glycoprotein were significantly reduced compared with control (P<0.05). Conclusion: The present study demonstrated that the eukaryotic expression plasmid of shRNA targeting on MDR1 inhibited the expression of MDR1 effectively, thus enhance the sensitivity of A2780/Taxol cells to paclitaxel.     

Twist下调影响卵巢癌细胞株A2780顺铂敏感性的研究

目的:探讨Twist对卵巢癌细胞株A2780顺铂敏感性及细胞增殖凋亡的影响。方法:通过Western blot筛选细胞株,构建小干扰RNA,qPCR筛选Twist-siRNA,将构建成功的Twist-siRNA逆转录于上皮性卵巢癌细胞株A2780中,通过CCK-8细胞术及流式细胞术,研究下调Twist对卵巢癌细胞株的增殖、凋亡及对化疗药物顺铂的影响。结果:选择人卵巢癌细胞株A2780,引入小干扰RNA后,Twist表达降低;细胞的增殖能力下降,凋亡增加（P＜0.05）,差异有统计学意义。si-Twist组相比对照组Twist基因的表达量明显降低, 且呈现一定的顺铂浓度依懒性差异(P<0.05）。结论:下调Twist可抑制卵巢癌细胞A2780的增殖,促进其凋亡;下调Twist卵巢癌细胞A2780对顺铂的敏感性增加。     

AP-4基因表达下调抑制子宫内膜癌细胞侵袭和迁移能力

目的:观察靶向抑制激活增强子结合蛋白-4(AP-4)基因的表达对子宫内膜癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法:用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测人子宫内膜癌细胞株HEC-1A、RL-952、HEC-1B、ishikawa中AP-4基因的表达水平。采用脂质体介导的细胞转染法将AP-4 siRNA转染至HEC-1A细胞,同时设置转染对照。转染48 h后,采用qRT-PCR和蛋白印迹法(Western blot)检测转染后各组HEC-1A细胞中AP-4的表达水平,通过细胞划痕实验观察转染后各组细胞迁移情况,采用Transwell实验检测转染后各组细胞侵袭能力。采用Western blot检测转染后各组细胞中上皮细胞标志分子E-钙粘蛋白(E-cadherin)和间充细胞标志分子N-钙粘素(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达水平。结果:AP-1基因在四株子宫内膜癌细胞中均有表达,在HEC-1A细胞中相对表达水平最高(P<0.05),用于后续转染实验。qRT-PCR和Western blot结果均显示转染AP-4 siRNA能够成功抑制HEC-1A细胞中AP-1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。Transwell实验显示转染AP-4 siRNA后HEC-1A细胞侵袭能力明显受到抑制(P<0.05)。划痕实验显示转染AP-4 siRNA后HEC-1A细胞迁移能力明显受到抑制(P<0.05)。Western blot结果显示转染AP-4 siRNA后HEC-1A细胞中N-cadherin和Vimentin蛋白水平降低,E-cadherin蛋白水平升高,抑制了上皮间质转化(EMT)过程(P<0.05)。结论:AP-4基因表达下调能够有效抑制子宫内膜癌细胞的侵袭和迁移能力,该过程可能与逆转细胞EMT过程有关。     

hPTTG1基因沉默下调bFGF表达并抑制A2780细胞侵袭的研究

目的：探讨RNAi技术沉默卵巢癌细胞A2780细胞内hPTFG1表达对其侵袭性的影响及调控机制。方法：利用阳离子转染试剂将hPTTG1siRNA转染A2780细胞．荧光实时定量PCR检测hPTTG1及bFGF表达水平;MTT基质黏附实验检测细胞黏附能力;细胞侵袭重建基底膜实验测定细胞体外侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力;Western blot检测bFGF蛋白表达水平。结果：hPTTG1siRNA转染组hPTTG1mRNA表达下降,抑制率为（76．8±4．1）％;转染hPTTG1siRNA后细胞黏附、侵袭和迁移能力降低;hPTTG1干扰后bFGFmRNA及蛋白表达下降。结论：hPTTG1siRNA能够抑制A2780细胞侵袭,可能是通过下调bFGF表达实现的。     

干扰FBXO2表达对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移及EMT的影响

目的：探讨F框蛋白2（F-box only protein 2,FBXO2）基因在人胃癌细胞系中表达及其对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT 的影响。方法：选择胃癌细胞系 MGC-803、AGS、SGC-7901、MKN-28以及正常胃黏膜上皮细胞株 GES-1,qPCR 法检测细胞中FBXO2 mRNA表达水平。设计靶向抑制FBXO2表达的特异siRNA,并瞬时转染MGC-803细胞,转染siRNA无义序列的为阴性对照。qPCR法检测转染48 h后MGC-803细胞中FBXO2 mRNA表达水平;用MTT法、细胞划痕愈合法、Transwell小室法检测降低 FBXO2表达对细胞增殖、迁移和侵袭的影响,WB 法检测细胞中 EMT 相关蛋白 E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表达。结果：4种胃癌细胞中FBXO2 mRNA表达水平显著高于胃黏膜上皮细胞GES-1（P<0.05或P<0.01）。与阴性对照组相比,siRNA[1]FBXO2组MGC-803细胞中FBXO2 mRNA表达下调（P<0.01）,该细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到显著抑制（P<0.05或P<0.01）,E-cadherin蛋白表达明显升高（P<0.01）,N-cadherin、vimentin蛋白表达显著降低（均 P<0.01）。结论：低表达的 FBXO2可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,该抑制作用可能与EMT过程有关。     

沉默S100A10基因对卵巢癌SKOV-3和A2780细胞周期的影响

目的 探讨沉默S100钙结合蛋白A10(S100A10)对卵巢癌SKOV-3和A2780细胞周期的影响及其相关分子机制.方法 将针对S100A10基因的shRNA转染至SKOV-3和A2780细胞中,获S100A10敲降稳转SKOV-3和A2780细胞系,采用CCK8方法检测细胞增殖能力,采用流式细胞技术检测细胞周期变...     

短发卡状RNA抑制AKT2基因表达增强卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的研究

目的：构建AKT2基因特异性短发卡状RNA（shRNA）真核表达载体,观察RNA干扰（RNAi）技术,对人卵巢癌A2780和SKOV3细胞中AKT2蛋白激酶表达的抑制作用,并探讨其促进细胞凋亡的机制。方法：运用基因工程技术,设计合成针对AKT2mRNA的特异性shRNA,构建真核表达载体pAKT2-shRNA。将pAKT2-shRNA经脂质体（Lipofectamine^TM 2000）包裹转染人卵巢癌A2780和SKOV3细胞,荧光显微镜观察细胞内DsRed红色荧光蛋白的表达,计算转染效率,半定量RT—PCR（Semi-quantitative RT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）检测AKT2的表达及干扰效率,流式细胞学检测法（FACS）检测细胞凋亡率,比较抑制AKT2基因前后卵巢癌细胞抵抗凋亡能力。结果：成功构建了PAKT2-ShRNA载体。A2780和SKOV3细胞转染pAKT2-shRNA后,荧光显微镜下观察转染效率约40％;Semi-quantitative RT-PCR和Western blot检测结果示,转染后AKT2 mRNA和蛋白表达均显著降低。FACS检测结果显示,转染pAKT2-shRNA后,紫杉醇25nmol／L处理细胞12h,与空白对照组和阴性对照组相比,细胞凋亡率显著增加,P〈0．05。结论：构建的pAKT2-shRNA真核表达载体能有效抑制AKT2基因表达;运用RNAi技术,降低卵巢癌细胞中AKT2基因表达水平,能增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,促进肿瘤细胞凋亡。     

Twist调控对卵巢癌细胞侵袭和转移的影响及其机制探讨

目的:探究Twist调控对卵巢癌细胞侵袭和转移的影响及其机制。方法:从我院2016年3月至2017年3月间确诊的卵巢癌患者中选择75例作为研究组,其中早期14例,中期42例,晚期19例;另随机选择同期来我院体检的健康人75例作为对照组。收集两组患者的卵巢组织,用免疫组化的方法检测Twist、N-cadherin与E-cadherin和MMP-9蛋白的表达情况,用RT-PCR法检测Twist、N-cadherin与E-cadherin、细胞凋亡相关基因（Bcl-2、Bax）mRNA表达水平。结果:研究组患者卵巢组织中的Twist、MMP-9蛋白阳性表达率显著高于对照组患者（P<0.05）;研究组患者卵巢组织中N-cadherin蛋白阳性表达率显著高于对照组患者（P<0.05）,而对照组患者E-cadherin蛋白阳性表达率显著高于研究组患者（P<0.05）;研究组患者卵巢组织中Twist、N-cadherin mRNA表达水平显著高于对照组患者（P<0.05）,对照组患者E-cadherin mRNA表达水平显著高于研究组患者（P<0.05）;研究组患者卵巢组织中Bcl-2 mRNA表达水平显著高于对照组患者（P<0.05）,对照组患者Bax mRNA表达水平显著高于研究组患者（P<0.05）。 结论:Twist在卵巢癌的侵袭与转移中发挥了重要的作用,其参与了上皮间质转化的过程。     

SOCS3对人肝癌MHCC97-H细胞上皮间质转化的影响

目的:研究细胞因子信号转导抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3）对人肝癌细胞MHCC97-H细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响。方法:体外培养人肝癌高转移细胞株MHCC97-H,应用25 nmol/L的SOCS3 siRNA瞬时转染细胞（阳性转染组）,同时使用空质粒转染细胞（阴性对照组）。24 h后用荧光显微镜观察转染后的细胞荧光表达情况。48 h后,应用倒置显微镜观察细胞形态变化情况,采用细胞免疫荧光染色法检测MHCC97-H 细胞中EMT的上皮标志物E-cadherin和间质标志物α-SMA的表达情况。结果:与阴性对照组相比,SOCS3 siRNA成功转染的MHCC97-H细胞显示出绿色荧光。SOCS3 siRNA瞬时转染后肝癌细胞从呈现上皮样特征的鹅卵石形态,向具有间质细胞形态的纺锤形和梭形特征发生转变。免疫细胞荧光检测E-cadherin和α-SMA的表达结果显示,SOCS3 siRNA阳性转染组上皮标志物E-cadherin的免疫荧光表达明显减弱,而细胞的间质标志物α-SMA的免疫荧光表达显著增强。结论:本实验研究显示,下调肝癌细胞的SOCS3表达,其通过改变细胞的EMT表型分子及表型特征,促进肝癌的增殖,提示SOCS3可能在肝癌细胞的EMT中发挥着重要作用。调控SOCS3表达水平可以抑制肝癌的发生发展,为临床防治肝癌提供了新思路。     

DNA-PKcs短发夹RNA载体的构建及其表达

目的构建DNA-PKcsshRNA表达载体,观察该基因的抑制对A2780细胞增殖活性的影响。方法将针对人DNA-PKcs基因的不同部位设计的shRNA插入到真核表达质粒并转染人卵巢A2780细胞,RT-PCR和WesterBlot检测其对该基因mRNA和蛋白水平的抑制效率,MTT法测定DNA-PKcs基因的抑制对肿瘤细胞增殖活性的影响。结果 DNA测序分析证实DNA-PKcs shRNA表达载体pSIRENDNA-PKcs shRNA构建成功并在细胞中表达,转染重组载体的A2780细胞DNA-PKcs的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降;重组载体转染细胞增殖活性明显降低。结论成功构建DNA-PKcs shRNA表达载体为进一步研究DNA损伤修复基因DNA-PKcs奠定了基础;DNA-PKcs表达的抑制可能会导致肿瘤细胞增殖活性降低。     

Pituitary tumor transforming gene induces epithelial to mesenchymal transition by regulation of Twist, Snail, Slug, and E-cadherin

Pituitary tumor-transforming gene (PTTG) is an oncogene with its expression levels correlating with tumor development and metastasis. Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a crucial step in tumor progression and metastasis. Using ovarian epithelial tumor cell line (A2780) for loss-of-function or gain-of-function of PTTG in our experiments, we observed up regulation of TGF-β, Twist, Snail, Slug, vimentin and down regulation of E-cadherin on infection of cells with Ad-PTTG cDNA. In contrast reverse phenomena was observed on depletion of PTTG on infection of cells with Ad-PTTG siRNA, suggesting an important role of PTTG in induction of EMT in ovarian cancer cells.     

hPTTG1基因沉默下调bFGF表达并抑制A2780细胞侵袭的研究

目的:探讨RNAi技术沉默卵巢癌细胞A2780细胞内hPTTG1表达对其侵袭性的影响及调控机制。方法:利用阳离子转染试剂将hPTTG1 siRNA转染A2780细胞,荧光实时定量PCR检测hPTTG1及bFGF表达水平;MTT基质黏附实验检测细胞黏附能力;细胞侵袭重建基底膜实验测定细胞体外侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力;Western blot检测bFGF蛋白表达水平。结果:hPTTG1siRNA转染组hPTTG1mRNA表达下降,抑制率为(76.8±4.1)%;转染hPTTG1siRNA后细胞黏附、侵袭和迁移能力降低;hPTTG1干扰后bFGFmRNA及蛋白表达下降。结论:hPTTG1siRNA能够抑制A2780细胞侵袭,可能是通过下调bFGF表达实现的。     

XIAP基因对食管癌细胞黏附、侵袭和迁移能力的影响

目的:探讨沉默X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）基因表达对食管癌细胞黏附、侵袭和迁移能力的影响及机制。方法:参照LipofectamineTM2000说明将设计合成的XIAP特异性siRNA（si-XIAP）转染人食管癌EC9706细胞,将转染阴性对照siRNA(NC组）和仅加入脂质体的空白细胞作为两个对照组,siRNA转染48 h,通过Western blotting检测XIAP、AKT、p-AKT、E-cadherin和MMP-2蛋白表达;通过MTT法、Transwell法分别检测细胞黏附、侵袭和迁移能力;MTT法检测转染siRNA后24 h、48 h和72 h的细胞增殖。结果:XIAP特异性siRNA转染后,EC9706细胞XIAP表达明显降低,与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）。与空白组比较,si-XIAP组细胞增殖明显降低,黏附率明显升高,侵袭和迁移能力明显降低,p-AKT和MMP-2表达明显降低,E-cadherin表达明显升高（P<0.05）。结论:沉默XIAP基因可增强食管癌细胞黏附率,抑制侵袭和迁移能力,机制与抑制PI3K/AKT信号通路有关。     

Twist在胃癌黏膜组织的表达及在上皮间质转化中的作用

目的:观察上皮间质转化因子Twist在胃癌中的表达情况以及与胃癌恶性生物学行为的相关性。方法:采用免疫组化SP法检测59例胃癌组织中Twist,上皮源性标记物E-cadherin,间叶源性标记物Vimentin的表达,并分析与各临床病理因素之间的关系。结果:59例胃癌组织中Twist阳性表达率为74.6%(44/59),29例观察到E-cadherin表达的降低,同时7例观察到Vimentin表达上调。Twist的表达与淋巴结转移密切相关(P<0.05);而且Twist表达与E-cadherin表达降低(P<0.05)和Vimentin的表达上调(P<0.05)之间都存在相关性。结论:Twist可能通过调控上皮间质转化从而在胃癌的侵袭转移过程中发挥作用。     

两位点短发卡状RNA诱导AKT2基因沉默在卵巢癌细胞紫杉醇敏感性中的应用研究

目的：探讨AKT2基因在肿瘤细胞对紫杉醇敏感性中的作用。方法：分别构建2个针对同一AKT2基因不同位点的短发卡状RNA（shRNA）载体，转染人卵巢癌细胞A2780、SKOV3，荧光显微镜观察细胞内荧光蛋白的表达及转染效率，运用RT—PCR、蛋白质免疫印迹（western blotting）方法比较单独转染的抑制瘤和共转染对AKT2表达的沉默效率；抑制AKT2表达后，流式细胞仪（FACS）检测肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性。结果：构建的2种shRNA表达载体均可抑制AKT2mRNA和蛋白的表达，共转染的抑制率明显高于分别单独转染的抑制率（P〈0．05）；FACS结果显示，共转染沉默AKT2基因后，细胞凋亡率明显增加（P〈0．05）。结论：共转染针对AKT2基因不同位点的2个shRNA真核表达载体，对AKT2基因的抑制效率高于单独转染1个载体；抑制卵巢癌细胞中AKT2基因表达，能增强其对紫杉醇的敏感性。     

RNAi抑制Layilin表达对肺腺癌A549细胞体外侵袭和荷瘤鼠体内淋巴转移的影响

背景与目的：透明质酸参与了多种肿瘤细胞的侵袭行为，Layilin是一种新发现的特异性透明质酸受体。本研究在发现Layilin表达于人肺腺癌A549细胞株的前期工作基础上，观察用RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术抑制Layilin表达后，对人肺腺癌A549细胞体外侵袭和体内淋巴道转移的影响。方法：构建能表达针对Layilin的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）的RNAi质粒（Layilin siRNA plasmid）和表达不针对任何已知mRNA的siRNA的阴性对照RNAi质粒（control siRNA plasmid），分别转染A549细胞，新霉素抗性筛选得到Layilin表达受抑制的A549-siLayilin细胞和Layilin表达未受影响的A549-siControl细胞。针对非转染（A549-nontransfection）、A549-siLayilin、A549-siControl3组细胞，分别采用RT—Realtime PCR和Western blot技术检测Layilin表达，用Boyden小室实验检测细胞体外侵袭能力，用爪垫皮下种植淋巴结转移模型检测淋巴转移能力。结果：与A549-nontransfection组和A549-siControl组相比，A549-siLayilin组细胞Layilin表达减少，体外侵袭能力降低，体内淋巴转移率下降。结论：通过RNAi抑制Layilin表达后，能有效抑制透明质酸所诱导的A549细胞体外侵袭和裸鼠移植瘤淋巴转移。本研究为通过RNAi手段抑制Layilin表达，进而抑制肺腺癌淋巴转移提供了有益的思路．     

桥接整合因子1在上皮性卵巢癌组织和细胞中的表达及其临床意义

目的：探讨桥接整合因子1(BIN1)在上皮性卵巢癌(EOC)组织中的表达及其临床意义,以及BIN1对EOC细胞A2780增殖、迁移和侵袭的影响。方法：收集2017年7月至2018年1月河北医科大学第四医院手术切除的67例EOC患者的肿瘤组织及同期因其他妇科疾病手术切除的30例非肿瘤患者的卵巢组织(正常对照组)标本。用免疫组织化学染色法检测EOC组织和非肿瘤卵巢组织中BIN1蛋白的表达水平,χ²检验分析BIN1表达与患者临床病理特征之间的关联,Kaplan-Meier法分析BIN1表达与患者的无病生存期(DFS)和总生存期(OS)之间的关系。用qPCR和WB法检测EOC细胞SKOV3、A2780和人卵巢上皮细胞IOSE80中BIN1 m RNA和蛋白的表达水平。利用基因转染技术将BIN1质粒CMV-MCS-GFP-SV40-NeomycinBIN1和空载体质粒CMV-MCS-GFP-SV40-Neomycin分别转染到A2780细胞以构建过表达BIN1细胞及其对照,用qPCR和WB法分别检测转染细胞中BIN1 mRNA和蛋白的表达水平,CCK-8、划痕愈合和Tran...