pcDNA3.1(-)/tPA-交联明胶微球复合物体外基因转染的实验研究

目的:检测交联明胶微球结合和缓释pcDNA3.1(-)/tPA的能力及其转染体外培养人脐静脉内皮细胞的瞬时转染效率。方法:采用紫外分光光度法检测交联明胶微球结合pcDNA3.1(-)/tPA的最大包封率和体外缓释规律;采用免疫荧光染色法检测pcDNA3.1(-)/tPA-交联明胶微球复合物缓释的pcDNA3.1(-)/tPA转染内皮细胞的瞬时转染效率。结果:交联明胶微球能有效结合pcDNA3.1(-)/tPA,最大包封率为62.75±3.31%;且在体外能持续缓释质粒DNA超过4周。pcDNA3.1(-)/tPA-交联明胶微球复合物缓释的pcDNA3.1(-)/tPA能被转移进入人脐静脉内皮细胞中并有效表达,瞬时转染效率为12.74±2.53%。结论:交联明胶微球能良好结合和缓释pcDNA3.1(-)/tPA,并能成功进行体外基因转染。     

含人血栓调节蛋白基因重组质粒的构建和表达

目的:构建hTM真核表达质粒,并导入脐静脉内皮细胞(HUVECs)中表达,为临床血栓病的基因治疗提供实验依据和物质基础。方法:PCR法扩增hTM基因的全长表达片段,HindⅢ/EcoRⅠ酶切后与pcDNA3.1(+)/neo质粒连接成pcDNA3.1/hTM。经鉴定正确后,由阳离子脂质体包裹转染HUVECs,免疫组化检测转染后细胞hTM的表达。结果:双酶切及测序鉴定均证实hTM基因被成功克隆。pcDNA3.1/hTM经脂质体介导能有效地转染内皮细胞,转染效率约为10%左右。结论:成功构建pcDNA3.1/hTM重组质粒,并且能在内皮细胞中高效表达。为进一步的基因治疗提供物质基础。     

pcDNA3.1-成骨生长肽真核表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

背景：成骨生长肽具有明显的促进成骨细胞增殖、分化、成熟的作用。 目的：观察成骨生长肽基因转染兔骨髓基质干细胞后的表达及表达产物对骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响。 方法：构建重组真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,并在脂质体介导下,将其导入兔骨髓基质干细胞。通过G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR方法检测成骨生长肽基因在骨髓基质干细胞内的表达,并观察转染pcDNA3.1-成骨生长肽后骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的情况。 结果与结论：实验成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-成骨生长肽,转染pcDNA3.1-成骨生长肽的骨髓基质干细胞可见成骨生长肽mRNA的表达,同时羟脯氨酸的分泌水平增加,碱性磷酸酶活性增高。证实经pcDNA3.1-成骨生长肽转染的兔骨髓基质干细胞不仅可以表达成骨生长肽,而且具有向成骨细胞分化的特性。     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)可抑制血管内皮细胞凋亡。 目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢(H₂O₂)诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。 方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF 基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组(转染pcDNA3.1)、过氧化氢组(转染pcDNA3.1+ H₂O₂)和bFGF转染+过氧化氢组(转染pcDNA3.1-bFGF-GFP+H₂O₂),流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。 结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加(P < 0.01),而bFGF 转染+过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低(P < 0.01)。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

人sTNFR1真核表达载体构建及体外抑制TNF-α细胞毒效应

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因(sTNFR1)的真核表达载体,研究sTNFR1对TNF-α细胞毒效应的抑制作用。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1(-)-sTNFR1瞬时转染QSG7701细胞,半定量PT-PCR法检测sTNFR1mRNA的表达,MTT法检测sTNFR1对TNF-α细胞毒效应的抑制作用。结果人sTNFR1基因被正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-);通过与3-磷酸甘油醛(GAPDH)比较,pcDNA3.1(-)-sTNFR1转染的QSG7701细胞中sTNFR1mRNA表达量明显高于空载体对照组和空细胞对照组(P<0.05);pcDNA3.1(-)-sTNFR1瞬时转染QSG7701细胞,TNF-α对其细胞毒性作用受到抑制,当TNF-α浓度为100μg/L时pcDNA3.1(-)-sTNFR1/QSG7701的细胞毒性较QSG7701下降64.8%。结论成功地构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-sTNFR1,TNF-α对瞬时转染pcDNA3.1(-)-sTNFR1/QSG7701的细胞株细胞毒性作用受到抑制。     

心外膜脂肪组织转染人apM1基因抑制兔冠状动脉粥样硬化的形成**☆

背景：心外膜脂肪分泌的脂联素水平下降可能是导致冠状动脉粥样硬化的主要原因之一。 目的：观察人脂联素基因apM1转染至兔心外膜脂肪组织对高脂喂食兔冠状动脉粥样硬化形成的影响。 方法：向兔心包腔内注射脂质体包裹的pEGFP-apM1重组质粒50 μL,分别于注射后2,7,28 d观察转染效率。采用高脂喂食方法制备兔冠状动脉粥样硬化模型,并按上述方法转染apM1基因,于转染后4周取材。 结果与结论：心包腔内转染apM1基因2 d后即可检测到兔心外膜脂肪组织apM1基因高表达,并可持续至28 d。心外膜脂肪转染apM1基因对高脂喂食引起的外周血脂联素、肿瘤坏死因子α、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇水平无显著影响,但可使心包腔液中脂联素水平显著增加、肿瘤坏死因子α水平显著降低(P < 0.01),冠状动脉内膜/中膜厚度比减小40.66%。说明经心包腔注射可将apM1基因有效转染入心外膜脂肪组织,并可在局部通过抑制高脂诱导的炎性因子释放而抑制冠状动脉粥样硬化的形成。     

pcDNA3.1-MORC2重组质粒的构建及其在胃癌细胞SGC-7901中的表达和定位

目的 构建真核表达载体pcDNA3.1-MORC2并瞬时转染人胃癌细胞SGC-7901,观察融合蛋白在细胞内表达及定位.方法 以人MORC2 cDNA为模板,PCR扩增MORC2全长编码基因,亚克隆至pcDNA3.1-hisA表达载体.将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,提取细胞蛋白进行Wester...     

雌激素受体2对前列腺癌细胞系PC-3M增殖的影响

目的： 构建带有人雌激素受体2（ESR2）全长cDNA的重组质粒pcDNA3.1-hERβ,转染人前列腺癌PC-3M细胞株,观察ESR2对细胞增殖能力的影响。 方法：RT-PCR方法从人正常卵巢组织中获取ESR2全长cDNA,利用基因重组技术与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hERβ;瞬时转染前列腺癌PC-3M细胞株,应用细胞计数、MTT法及流式细胞术检测细胞增殖能力的改变;半定量RT-PCR法及Western blotting法分别检测增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1 mRNA及蛋白表达。 结果：DNA测序结果显示扩增的ESR2序列与GenBank（NM_001437）所公布的序列完全一致。重组质粒pcDNA3.1-hERβ瞬时转染人PC-3M细胞48 h后,与质粒对照组相比：RT-PCR法及Western blotting法显示,ESR2基因在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显增加;细胞计数及MTT结果发现,细胞数目减少,细胞增殖活性下降（P<0.01）;流式细胞实验显示,G0/G1期细胞比例增加（P<0.05）,S期及G2/M期细胞比例减少（P<0.05）;RT-PCR及Western blotting结果还发现cyclinD1的表达减弱,而P21Cip1的表达增强。 结论：成功构建pcDNA3.1-hERβ重组质粒;带有ESR2全长基因的重组质粒转染PC-3M细胞后,细胞的增殖活性受到抑制;RSR2可能通过影响细胞增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1的表达抑制细胞的增殖。     

PAI-1反义RNA对内皮细胞中PAI-1和血小板源生长因子的影响(简报)PAI-1反义RNA对内皮细胞中PAI-1和血小板源生长因子的影响

纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)可以促进动脉粥样硬化(AS)的发展。本实验构建PAI-1反义RNA重组质粒,将其转导入离体培养的主动脉内皮细胞(EC)中,观察其对PAI-1表达的作用及对血小板源生长因子(PDGF)的影响。 　　体外培养猪主动脉内皮细胞,免疫组化显示CD31抗体染色阳性。取第1～2代细胞进行实验。在PAI-1基因翻译起始位点第二外显子处设计一对引物,进行PAI-1特异片段扩增。PCR纯化产物与克隆载体pGEM-T连接。ApaⅠ和PstⅠ对pGEM-PAI-1重组质粒和pcDNA3.1(-)质粒进行双酶切。电泳回收目的基因片段和载体片段,T4连接酶连接。转化入感受态细菌,扩增培养,提取目的片段,进行DNA循环测序。pcDNA3.1PAI-1表达质粒与转染试剂FuGene6混合后转染细胞。设立未转染EC作为空白对照。在转染后第3天、第5天和第7天收获转染细胞。用3种方法检测PAI-1表达情况。ELISA检测细胞培养液中PAI-1含量。免疫组化法和Western blot检测细胞中PAI-1蛋白表达。免疫荧光法检测反义RNA对EC中PDGF的作用。     

外源性A20基因对缺氧诱导的内皮细胞E-选择素表达的影响

目的:探讨外源性A20基因在缺氧培养条件下对内皮细胞E-选择素表达的影响。方法:培养原代人脐静脉内皮细胞,将细胞分组建立缺氧模型。采用脂质体转染法将质粒pcDNA3.1EHA20转染培养的内皮细胞,筛选出抗G418的阳性克隆,经免疫荧光鉴定A20表达。采用免疫组化和原位杂交的方法检测内皮细胞E-选择素的表达。结果:缺氧能诱导人内皮细胞E-选择素的高表达。外源性A20基因抑制80%以上由缺氧诱导的内皮细胞E-选择素的表达。结论:外源性A20基因能够显著抑制缺氧诱导的人内皮细胞的活化,有效抑制E-选择素的表达。     

激活素受体样激酶1促进人脐静脉内皮细胞增殖和迁徙

目的： 研究激活素受体样激酶1（ALK1）对人脐静脉内皮细胞的作用。 方法： 体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs），RT-PCR分析ALK1和ALK5在HUVEC激活状态下表达的变化。脂质体转染pcDNA3.1+ALK1到HUVECs，流式细胞仪检测HUVECs增殖的改变，boyden小室检测ALK1对HUVECs迁徙的影响。 结果： ALK1在HUVEC安静状态高表达，ALK1能促进HUVECs的增殖和迁徙。 结论： ALK1通过促进内皮细胞的增殖和迁徙在血管重塑中发挥作用。     

人MUC1与GM-CSF基因融合真核表达质粒的构建与表达

目的：构建人MUC1重复序列串联体基因与GM-CSF基因重组的真核共表达质粒pcDNA3.1（＋）-MUC1-GM-CSF,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达。方法：将信号肽及编码MUC1基因片段合成、合成的片段经退火等方法获得MUC1基因重复序列串联体,酶切鉴定及序列分析后,与GM-CSF基因克隆入pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建真核共表达质粒pcDNA3.1（＋）-MUC1-GM-CSF。以重组质粒转染COS-7细胞,通过间接免疫荧光法及ELISA检测目的基因的表达。结果：酶切鉴定及序列分析表明,重组质粒含有人MUC1重复序列串联体与GM-CSF的融合基因,在COS-7细胞中可检测到MUC1表达,重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗GM-CSF抗体。结论：人MUC1重复序列串联体与GM-CSF基因重组的真核共表达质粒的成功构建,为对其免疫原性、生物学特性及免疫治疗的进一步研究奠定了基础。     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因乳腺定位表达载体的构建及表达

目的:将人α-防御素-1(α-HNP-1)基因与山羊β-乳球蛋白(Beta-Lac-toglobulin,BLG)基因5’调控区序列融合,构建α-HNP-1基因的乳腺定位表达载体并对其进行检测。方法:用PCR方法获得α-HNP-1基因片断并克隆于pMD18-T载体,经DNA测序证实α-HNP-1基因序列无误后,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1-HNP-1重组质粒。用PCR方法扩增出BLG基因5’区调控序列并克隆到pcD-NA3.1-HNP-1中,构建乳腺定位表达载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1,该载体经脂质体包裹后,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠乳腺中进行表达。结果:经酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1构建正确,经ELISA检测,大鼠乳汁中有α-HNP-1表达,其48h表达量为27.67ng/ml,72h表达量为49.00ng/ml。结论:成功构建了α-HNP-1基因乳腺定位表达载体并最终在乳腺获得一定量表达,说明乳腺导管注入法是一种较理想的评价乳腺特异表达载体的可行性方法。     

杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

目的：构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（alllastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin，并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法：提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3．1（＋）中，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin。以pcDNA3．1-amastin转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3．1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果：在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光，表明pcDNA3．1-amastin成功地转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后，用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因，表明获得了稳定表达。结论：成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒，并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。     

可溶性血管内皮生长因子受体1真核克隆表达及其对血管内皮细胞增殖的影响

本研究旨在构建可溶性血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受体1(soluble fmslike tyosine kinase-1,sFlt-1)的真核表达质粒pcDNA3.1-sFlt-1,并观察sFlt-1对血管内皮细胞增殖的影响。提取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)总RNA,扩增Flt-1基因胞外1-3结构域,构建真核表达质粒pcDNA3.1-sFlt-1,测序鉴定基因序列。将重组质粒转染Lewis肺癌细胞,采用RT-PCR和SDS-PAGE检测sFlt-1在基因及蛋白水平的表达情况。MTT法检测sFlt-1对VEGF诱导的HUVECs生长的影响。结果显示:①插入片段序列正确;②sFlt-1在基因水平成功表达且转染后的Lewis肺癌细胞能分泌表达sFlt-1;③含sFlt-1的细胞上清液可明显抑制VEGF诱导的HUVECs增殖。本研究成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-sFlt-1,sFlt-1,在基因和蛋白水平均获得有效表达,且表达的蛋白可明显抑制由VEGF诱导...     

丙型肝炎病毒核心蛋白在QSG7701细胞中的表达和鉴定

目的：进行丙型病毒肝炎核心蛋白真核表达载体的构建，并在人源肝细胞QSC7701中进行表达与鉴定。方法：从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM／HCV1—3011质粒中扩增出HCV核心（core）基因片段，构建peDNA3．1（-）／core重组真核表达质粒。然后采用阳离子多聚体将其转染人肝细胞QSG7701，用免疫组织化学SP法检测丙型肝炎病毒核心蛋白的表达，再通过Western blot印迹法进行鉴定。结果：所克隆的core片段大小正确，序列正确；成功的构建了pcDNA3．1（-）／core重组表达质粒，瞬时转染QSG7701细胞，用SP免疫组化检测到了核心蛋白的表达，Western blot印迹法显示其分子量约为21000。结论：丙型病毒肝炎核心蛋白的真核表达载体pcDNA3．1（-）／core在人肝细胞中能有效表达HCV核心蛋白，从而为进一步研究和解析核心蛋白在肝细胞癌变机制中的所起的作用提供了良好的核心蛋白表达系统，同时也为开发丙型肝炎DNA疫苗提供了前期条件。     

HCV-C蛋白抗原在人肝细胞株中的表达和鉴定

目的:构建HCV-C蛋白基因的真核表达载体,并在正常人肝细胞HL-7702中表达与鉴定。方法:从含有丙肝病毒全长基因的重组质粒pBRTM/HCV1-3011质粒中,扩增HCVcore基因片段,构建pcDNA3.1(-)/core重组真核表达质粒。然后采用阳离子多聚体将其转染人正常肝细胞HL-7702,用免疫组化染色(SP)法检测HCVC蛋白的表达,并通过Westernblot进行鉴定。结果:所克隆的HCV-C基因片段的大小为573bp,序列正确。成功地构建了pcDNA3.1(-)/core重组表达质粒。以其转染HL-7702细胞后,用SP免疫组化染色法检测到了C蛋白的表达。Westernblot显示,其相对分子质量(Mr)约为21000。结论:构建的真核表达载体pcD-NA3.1(-)/core在人肝细胞中能有效表达HCV-C蛋白,为以后相应抗体的制备打下了基础。     

空肠弯曲菌DNA疫苗构建及其疫苗免疫程序研究

目的:构建空肠弯曲菌peb1A基因真核表达载体,探讨DNA疫苗不同免疫程序的免疫效果。方法:以重组pET28a(+)-peb1A质粒为模板,将空肠弯曲菌peb1A基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染COS-7细胞中表达,Western blot鉴定表达蛋白;昆明小鼠随机分组:设空白对照组、空载体对照组、pcDNA3.1(-)-peb1A实验组,用ELISA法检测免疫后的昆明小鼠血清IgG和IgM抗体水平。结果:重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A经双酶切和PCR鉴定,构建正确。peb1A基因测序结果与GenBank中peb1A基因序列一致。重组质粒成功转染COS-7细胞,并能正确表达重组蛋白。裸DNA组IgG水平均高于两对照组,有显著性差异(P<0.05)。同一剂量短时间(0、10、20天)免疫程序优于长时间(0、15、25、35天)免疫程序(P<0.05)。结论:成功构建空肠弯曲菌真核表达重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A,其经肌肉注射免疫小鼠,具有较好的免疫原性,短时间免疫程序免疫效果好。