汉坦病毒G2糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其在免疫诊断中的应用

目的构建汉坦病毒(HV）Z10株包膜糖蛋白G2基因的重组表达载体，探索其在昆虫细胞中的表达及在免疫荧光诊断中的应用。方法以质粒pUCm—Z10M为模板设计引物，用聚合酶链反应(PCR)扩增Z10株G2基因片段，将G2片段克隆入pUCm—T质粒载体，碱法提取质粒pUCm-Z10-G2，酶切后将回收片段插入杆状病毒转移载体pFastBacHTa，构建重组体pFastBacHTa-Z10-G2，重组体转化感受态细胞E．coli DH10Bac后，经2轮筛选，提取重组质粒转染昆虫细胞sf9，并用间接免疫荧光技术检测表达的G2蛋白。结果获得含有编码HV Z10株的包膜糖蛋白G2基因的重组质粒，转染昆虫细胞表达出G2蛋白，与肾综合征出血热(HFRS)阳性血清反应，昆虫细胞内呈现特异性环状荧光。检测40份HFRS血清，与全病毒细胞抗原片的符合率为95％。结论成功构建HV Z10株包膜糖蛋白G2基因的表达载体，并在昆虫细胞中表达。可利用重组G2蛋白检测HV感染。     

汉坦病毒核蛋白的重组表达及其免疫印迹法在肾综合征出血热血清抗体检测中的应用

目的 应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达汉坦病毒（HV）S基因,表达产物作为诊断抗原,用于检测血清中抗HV特异性抗体IgG。方法 PCR扩增HV-Z10株N蛋白（NP）编码基因,基因工程方法构建NP编码基因昆虫表达系统 rBAC-Z10S-TN。间接荧光法了解重组NP（rNP）表达及与特异性免疫反应情况,SDS-PAGE观察重组蛋白表达情况。建立免疫印迹法检测肾综合征出血热（HFRS）患者血清样品,并与常规间接免疫荧光法进行比较。结果 rBAC-Z10S-TN高效表达rNP,SDS-PAGE显示rNP的蛋白表达带,此抗原仅与HFRS患者血清起反应。经双盲试验,两法检测血清143份,HFRS阳性符合率为97.67%。结论 成功构建了HV-Z10株NP编码基因高效真核表达系统。所建立的免疫印迹法可作为HFRS简便、安全、敏感、特异的血清学诊断新方法。     

SARS荧光免疫诊断技术研究

目的应用基因工程技术,在昆虫细胞中表达SARS核蛋白基因,产生无感染性的核蛋白抗原,利用此蛋白制备抗原片,用于检测血清中SARS特异性抗体.方法从非典型性肺炎病人血清中提取病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增出SARS核蛋白基因片段,将核蛋白基因插入杆状病毒,构建重组昆虫杆状病毒,转染昆虫细胞,收获细胞,经丙酮固定,制成SARS抗原片,建立了SARS荧光免疫方法(IFA).结果用此抗原片检测多份血清,仅与SARS病人血清起反应,而与正常人及其它发热病人血清不起反应.结论利用该方法制备抗原片,不需要P3实验室,操作简便,为诊断与研究SARS提供了方便而安全的方法.     

北海道型汉坦病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的 构建北海道型汉坦病毒(HOKV)核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于HOKV的检测及诊断.方法 应用RT-PCR方法扩增HOKVFusong-Cr-247株的NP基因,并将该基因片段克隆到PCR[R]2.1TA载体,转化到One ShortTM TOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用Kpn I和Not I双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast PUUV-S重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后.转化到DH10BacTM E.coli 感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Baemid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h后收获细胞.用间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定和分析.结果 实验应用Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统,成功构建了含普马拉类汉坦病毒核蛋白基因的重组杆状病毒表达载体.并在昆虫细胞中获得表达.IFA结果显示,感染细胞的胞浆中有亮绿色荧光颗粒,SDS-PAGE和Western blot检测细胞表达产物的50×103(M)的蛋白条带,证实重组病毒感染昆虫细胞后表达了相应的重组核蛋白,与预计的结果相符.并能与抗汉坦病毒抗体结合.结论 成功表达具有HOKV免疫原性及反应性的重组核蛋白,为研制HOKV的诊断试剂奠定了基础.     

抗体制备ELISA试剂诊断肾综合征出血热

目的研究汉坦病毒重组抗原及其单克隆抗体制备双抗夹心酶联免疫吸附（ELISA）试剂早期诊断肾综合征出血热（HFRS）.方法将汉坦病毒76118株S1.3kb基因克隆于pET28a质粒,诱导大肠埃希菌表达出48kd的汉坦病毒核蛋白抗原.以此抗原免疫Balb/c小白鼠,取其B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞株,小鼠腹腔接种,制备单克隆抗体.用重组抗原及其单克隆抗体,制备ELISA诊断试剂,并与美国产汉坦病毒重组抗原ELISA诊断试剂和间接免疫荧光法（IFA）比较.结果自产重组抗原及其单克隆抗体制备的双抗夹心ELISA试剂与美国产抗原ELISA试剂在87例HFRS和56例非HFRS诊断中完全吻合.结论自产ELISA试剂可用于早期诊断HFRS,且意义重大.     

汉坦病毒Z10疫苗株M片段的克隆及在昆虫细胞表达的研究

汉坦病毒 (HTNV)Z10株是从患者血清中分离到[1] ,现已用于生产肾综合征出血热 (HFRS)Ⅰ型疫苗的毒株。自 1995年投产供应市场后 ,已在全国二十几个省市推广应用 ,目前该疫苗已接种 10 0 0余万人份 ,为控制HFRS的流行起了很好的作用。我们应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法成功地扩增出Z10株全长M基因 ,进行核苷酸序列测定 ,并与HTN型及SEO型病毒的核苷酸序列进行比较 ,从分子水平证实它与HTN血清型病毒具有很高的同源性。将M基因插入重组杆状病毒 ,感染昆虫细胞 ,成功地表达了M基因膜蛋白 ,为进一步开发基因工程疫苗打下…     

浙江省2008-2011年啮齿动物中汉坦病毒的分离及鉴定

目的 分析浙江省肾综合征出血热(HFRS)疫区鼠形动物携带汉坦病毒状况及其型别.方法 应用直接免疫荧光试验和RT-PCR方法检测汉坦病毒抗原和核酸,阳性者用长爪沙鼠和Vero-E6细胞进行病毒分离,对分离株的M片段基因进行序列测定和分析.结果 2008-2011年在浙江省HFRS疫区捕获的鼠形动物中以黑线姬鼠为优势鼠种;从该鼠鼠肺中共分离到6株汉坦病毒,序列分析表明分离株均为汉滩型汉坦病毒,其中Z521、524、534为H7亚型,TT-27、T-43、R88可能为新亚型;6株分离株之间的基因同源性较高,并与以往浙江省分离株具有较高同源性.结论 2008-2011年浙江省HFRS疫区鼠间存在汉滩型汉坦病毒流行.     

汉坦病毒重组蛋白检测血清中特异性IgA抗体动态变化的研究

目的探讨重组蛋白检测血清中特异性IgA抗体的动态变化及其诊断价值。方法用杆状病毒表达的汉坦病毒重组核蛋白(rNP)和糖蛋白(rGP)为抗原,检测14例61份急性期SEO型病人系列血清中的特异性IgA抗体,寻找肾综合征出血热(HFRS)病人IgA抗体的动态变化规律。结果几乎所有HFRS病人早期即有强烈的IgA应答,尤其是针对rNP的抗体出现早且滴度高,抗rGP出现亦早,但滴度偏低。结论应用rNP和rGP为抗原,在发病早期检测IgA抗体,具有较好的特异性诊断价值,特别是对HFRS早期临床表现不典型的病例。     

浙江省岱山县工业园肾综合征出血热疫情特征及基因分析

目的:分析浙江省岱山县工业园内肾综合征出血热(HFRS)疫情特征及病毒基因序列,为当地HFRS防控提供线索与依据。方法:根据《全国肾综合征出血热监测方案》中的个案调查表,对涉疫工业园内HFRS报告病例开展一般情况及流行病学调查,采集病例和同生活环境内人群、宿主动物的血清样本,进行汉坦病毒抗体或核酸检测以及M、S基因的扩...     

汉坦病毒核蛋白基因表达及产物抗原活性的研究

为了制备肾综合征出血热（ ＨＦＲＳ） 诊断用基因工程抗原,构建了合汉坦病毒７６１１８ 株编码核蛋白（ ＮＰ） 基因片段的重组质粒ｐＢＶ２２０Ｈ１－３Ｓ, 经转化大肠杆菌和诱导表达,ＳＤＳＰＡＧＥ 显示菌体中有分子量约为４８ ＫＤ 的新蛋白质生成。用经包含体纯化获得的表达产物做抗原,以间接酶联免疫（ＥＬＩＳＡ） 检测了４８ 份疑似出血热患者的血清特异性ＩｇＧ,其结果与经典的间接免疫荧光（ＩＦＡ） 检测的阴性、阳性及总符合率分别为１００ ％ 、９２－８６ ％ 和９３－７５ ％ 。证实该重组ＮＰ 具有良好的生物活性和诊断抗原价值     

双抗原夹心法ELISA在肾综合征出血热诊断中的应用

目的建立一种敏感、特异的检测肾综合征出血热(HFRS)血清总抗体的双抗原夹心法ELISA。方法应用重组汉坦病毒(HV)NP抗原e1.3S作为包被抗原和e6-119-HRP作为酶标抗原建立双抗原夹心法ELISA,检测血清总抗体,并与间接免疫荧光法(IFA)相比较。结果共检测188份人血清和378份鼠血清标本,2种方法的总符合率为97.70%。以IFA为参照标准,双抗原夹心法ELISA的敏感性为97.54%,特异性为97.87%。结论双抗原夹心法ELISA检测HFRS血清总抗体具有很高的敏感性和特异性,适用于大规模的流行病学调查。     

厦门市肾综合征出血热宿主动物感染情况调查

目的调查厦门市肾综合征出血热(HFRS,出血热),出血热宿主动物及其自然感染汉坦病毒状况,明确主要传染源种类,为预防和控制出血热提供科学依据。方法应用笼夜法捕鼠,计算鼠密度及鼠种构成,对鼠肺检测出血热病毒抗原,血清检测抗体。结果 2008-2009年厦门市鼠形动物总捕获率为8.02%,属于2目2科6种,以褐家鼠(45.14%)为优势种。宿主动物血清阳性率为13.45%,褐家鼠血清阳性率为21.52%;宿主动物带毒率为2.52%,带毒指数为0.037 77。宿主动物带毒率调查阳性均为褐家鼠,全市褐家鼠带毒率为2.63%,此次监测结果与厦门市20世纪80年代宿主动物调查结果无差别(P>0.05)。结论厦门市存在以褐家鼠为主要传染源的出血热疫源地,提示应根据褐家鼠的生态特点采取有针对性的综合防控措施,有效控制以褐家鼠为主的鼠密度,降低出血热发生和流行的危险。     

A major outbreak of hantavirus infection in Belgium in 1995 and 1996.

Haemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) is a human disease characterized by flu-like symptoms, renal dysfunction, and in severe cases, haemorrhagic manifestations. The causative agents of HFRS are Hantaan (HTN), Seoul (SEO), Puumala (PUU) and Dobrava (DOB) hantaviruses. Hantavirus infections are of increasing importance in Europe. Outbreaks occur in Belgium with a 3- to 4-year interval with an increasing number of cases. We describe the largest outbreak so far in Belgium with 217 serologically and clinically confirmed cases in the period between October 1995 and December 1996. We demonstrated that the use of viral antigen derived from a local PUU-strain was able to detect significantly more sera positive for IgM in an immunofluorescence assay. Furthermore, although in some cases SEO, HTN and DOB antibody-reactivities were detected by ELISA, only PUU infections could be confirmed by neutralization test. The presence of an unknown hantavirus serotype circulating in Belgium should be considered.     

广西肾综合征出血热宿主动物及其病毒感染状况

目的调查广西壮族自治区（广西区）肾综合征出血热（HFRS）宿主动物及其自然感染汉坦病毒状况。方法用夹夜法在室内及室外捕鼠,捕获鼠经分类鉴定后无菌取血清及肺组织,用ELISA法检测血清汉坦病毒抗体及肺组织抗原,对汉坦病毒抗原阳性的肺组织标本用RT-PCR检测汉坦病毒核酸及分型。结果 2006-2008年共捕获宿主动物17种1984只,以小型啮齿动物为主,宿主动物感染汉坦病毒总抗体阳性率为14.51%;褐家鼠肺组织汉坦病毒抗原阳性标本6份,经核酸检测和测序证实为汉城型病毒。结论广西区广泛存在以褐家鼠为主要宿主的HFRS家鼠型疫源地,并存在汉城型汉坦病毒的流行。     

湖南省2006年肾综合征出血热监测研究

目的掌握湖南省HFRS疫源地范围、类型、人群分布和流行规律以及宿主动物种类、带病毒率等情况,为防制HFRS提供科学依据。方法按照2006年《湖南HFRS监测实施方案》,在全省7个监测点系统开展HFRS的流行病学和病原学监测。采用直接免疫荧光法（DFA）检测宿主动物肺组织汉坦病毒（HV）抗原,了解自然感染汉坦病毒情况,并从HV阳性鼠肺标本中提取病毒RNA,应用HV型特异性引物进行RT-PCR扩增及核苷酸序列测定,并进行基因分型。结果2006年共报告病例560例,发病率0.89/10万。共捕获654只宿主动物,总鼠密度为3.15%,鼠带毒率为1.31%,在浏阳市、邵东县室内捕获的7只褐家鼠、黑线姬鼠、小家鼠、黄胸鼠肺标本中均发现携带汉城型（SEO）病毒,双峰县室外捕获的1只黑线姬鼠肺标本则携带汉坦型（HTN）病毒。结论湖南省为SEO型和HTN型混合型疫区,以SEO型为主。防制HFRS应以灭鼠、免疫高危人群、开展健康教育等的综合防制措施。     

2007-2009年四川省肾综合征出血热监测结果分析

目的了解四川省肾综合征出血热(HFRS)疫情及宿主动物动态,为HFRS的防制提供科学依据。方法收集全省2007-2009年疫情资料;在监测点采用夹夜法捕鼠,将鼠肺冷冻切片,用免疫荧光法检测汉坦病毒抗原。结果 2007-2009年全省累计发病284例,死亡2例,主要发病地区为凉山州、南充市、广安市和达州市;在凉山州盐源县、达州市开江县和南充市3个监测点共捕获鼠10种2046只,总鼠密度10.29%,居民区以褐家鼠和小家鼠为优势鼠种,野外以四川短尾鼩和高山姬鼠为优势鼠种。鼠间汉坦病毒带病毒率为2.22%。结论褐家鼠和黑线姬鼠仍是四川省HFRS的主要宿主动物,盐源县为家鼠型出血热疫区,四川省的其他发病地区为以姬鼠型为主的混合型疫区。监测结果提示四川省今后2～3年本病可能仍将在低发状态波动,今后应继续加强监测工作。     

2005年云南省肾综合征出血热监测研究

目的进一步掌握云南省‘肾综合征出血热（HFRS）的流行特点，为防治提供依据。方法收集全省HFRS疫情资料，并在监测点采集人群血清、鼠血清和鼠类肺脏做汉坦病毒抗体和抗原榆测。结果2005年全省共报告HFRS46例，年发病率为0．103／10万，无死亡病例。主要发病地区为大理州、昆明市、红河州。在国家级监测点泸西县、省级监测点寻甸县和永胜县捕获鼠类8种713只，其中居民区以黄胸鼠和褐家鼠为优势鼠种，野外以高山姬鼠为优势鼠种；鼠间带汉坦病毒率为3．22％（23／713），带病毒鼠种为褐家鼠、黄胸鼠、高山姬鼠、大绒鼠、臭朐鼯；采集鼠血清262份、人血清407份进行抗体检测，阳性率分别为4．96％（13／262）和3．19％（13／407）。其中，泸西县春夏季健康人群隐性感染率为3．00％（3／100），秋季为5．13％（4／78），秋季感染率明显高于春夏季。结论进一步证实云南省存在以褐家鼠和黄胸鼠为主要宿主的家鼠型HFRS疫源地，也存在着以高山姬鼠和大绒鼠为主的姬鼠型疫源地。近几年发病率的上升与较高的鼠密度和鼠间汉坦病毒普遍感染有关。     

2008～2011年山东省肾综合征出血热流行状况及其防治对策

[目的]通过对2008～2011年山东省肾综合征出血热疫情分析,了解现阶段山东省HFRS流行规律,为防治制定策略。[方法]采用Excel和Epidata 8对山东省各地2008～2011年HFRS发病和死亡时间、病例构成变化及对疫情的影响进行分析;采用间接免疫荧光检测鼠肺汉坦病毒抗原。[结果]自2008年起山东省HFRS进入第五个流行周期,疫情东移倾向进一步明确,病例分布呈现既分散又相对集中的特点,发病以鲁东南丘陵地区和胶莱平原部分地区为主,鲁西北平原和鲁中南山区呈下降趋势;2008～2011年山东省HFRS发病以农民为主,占发病例数的83.20%,男女之比2.79∶1;以25～65岁年龄组发病较多;汉坦病毒(HV)宿主室内外均以褐家鼠和小家鼠为主,春季和秋季HV抗原阳性率分别为2.06%和1.89%。[结论]应继续采取防鼠灭鼠、预防接种和健康教育为主的防治对策,抓好重点地区HFRS防治。     

汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

目的 将编码汉坦病毒76-118株核蛋白的S基因片段克隆到真核表达载体DTARGET TM，构建含汉坦病毒核蛋白S基因的重组真核表达质粒pTARGET-hans，并在体外进行瞬间表达。方法 采用PCR产物直接克隆方法，将核蛋白S基因插入到真核表达载体pTARGE TM中；酶切鉴定；用电穿孔法将重组质粒转染入Vero-E6细胞；用间接免疫荧光法检测其表达产物。结果 酶切鉴定证实S基因已被正确地插入pTARGET TM中；在部分转染重组质粒的Vem-E6细胞胞质内观察到中等强度的特异性荧光。结论 重组的真核表达载体pTARGET-hans已被成功地构建并可在体外表达．为下一步基因免疫打下基础。