诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立

背景：目前,大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立,但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。 目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。 方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞,获得了诱导多能性干细胞;在诱导分化体系中添加了Y-27632,克服干细胞扩增中的凋亡现象;运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。 结果与结论：①前3代细胞克隆传代时,诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多,很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断ROCK活化的抑制剂,能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在OP9细胞条件培养液作用下,经过体外诱导分化,形成CD34+造血祖细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

造血干细胞移植治疗地中海贫血

背景：造血干细胞移植是目前根治地中海贫血的最佳方法,造血干细胞移植包括骨髓移植、脐血移植、宫内造血干细胞移植、外周血造血干细胞移植。 目的：利用SCI数据库文献检索和深度分析功能,对造血干细胞移植的研究文献进行多层次探讨分析。 方法：以“造血干细胞(hematopoietic stem cell or HSC);移植(transplantation);地中海贫血(thalassaemia or thalassemia);β型地中海贫血(beta thalassaemia or beta thalassemia or β thalassaemia or β thalassemia)”为关键词,检索SCI数据库2002-01/2011-12的相关文献,并将分析结果及资料导出,以文字和图表的形式进行统计和计量分析,描述其分布特征。纳入标准：检索与造血干细胞移植治疗地中海贫血相关的文献。文献类型包括：①研究原著。②会议摘要。③综述。④会议文章。⑤快报。⑥编辑素材。⑦勘误。⑧章节。⑨新闻。排除标准：①与文章目的无关的文献。②大于10年较陈旧的文献。③未发表的文章。 结果与结论：SCI数据库2002/2011共检索到8 981篇造血干细胞移植相关的文献,研究原著以4 922篇位居首位,其中有7篇可以确定为经典文献,文献数量在2002/2011呈总体上升趋势,Blood《血液》杂志发表文献量最多, 1 515篇,占全部文献的16.87%。通过文献计量学方法对来源于SCI数据库关于造血干细胞移植的文献进行分析,可为了解该领域的现状、趋势和研究者进一步确定热点难点提供有价值的参考。     

外周血造血干细胞移植治疗3例重型β地中海贫血和1例特发性溶血性贫血

目的探讨异基因外周血造血干细胞移植(allogeneic peripheral blood stem cell transplantation,Allo-PBSCT)治疗遗传性溶血性贫血(hereditary haemolytic     

诱导性多能干细胞体外定向诱导分化的研究进展

胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究已成为发育生物学和细胞移植治疗学的研究热点,但伦理及免疫排斥问题一直阻碍胚胎干细胞（ES）的研究和临床应用。近两年,科学家成功地从多种成体细胞获得了诱导性多能干细胞（iPS细胞）,iPS细胞具有和胚胎干细胞相似的特性,由于其可来自自体成体细胞,因而可避开伦理及免疫排斥问题,是胚胎干细胞良好的替代材料,具有广阔的应用前景。iPS只有诱导分化为成熟的功能细胞才能用于疾病的治疗。主要介绍iPS细胞向成熟细胞分化的研究现状及目前存在的一些问题。     

地中海贫血患儿血清特异性PRA影响脐血造血干细胞增殖、分化能力的观察

目的： 探讨反复输血地中海贫血患儿血清中特异性群体反应性抗体（PRA）对脐血造血干/祖细胞增殖、分化能力的影响。 方法： 采用1×105脐血单个核细胞（MNC）与实验血清（健康儿童AB血清50 μL、PRA血清 0 μL、50 μL、100 μL）、补体联合孵育后半固体集落培养，倒置显微镜下观察并计数第7 d、第14 d总集落数和各种集落数。结果： 脐血造血干/祖细胞受PRA血清作用后，在半固体集落培养第7 d，总集落数、CFU-GM分别为A组88.20±9.41、79.00±11.39和B组88.60±9.12、79.20±10.44，显著高于C组20.60±7.39、15.20±4.66和D组4.00±2.05、1.40±0.51，P<0.01；其余各组的各种集落数两两比较，差异无显著（P>0.05）。A组与E组比较：两组的各种集落数比较均无显著差异（P>0.05）。在半固体集落培养第14 d，总集落数、CFU-GM分别为A组216.00±31.10、117.40±24.80和B组213.20±31.06、116.00±19.75，显著高于C组97.80±14.43、32.80±8.10和D组31.40±13.41、8.40±4.30，P<0.01;第14 d CFU-GEMM分别为A组45.60±8.51和B组42.60±7.03，显著高于C组20.80±6.96和D组7.80±6.06，P<0.05；第14 d BFU-MK分别为A组12.80±4.42、B组11.00±2.74，显著高于D组1.00±0.55，P<0.05；B组第 14 d CFU-E17.20±4.03显著高于D组5.60±2.87，P<0.05。A组与E组比较：两组的各种集落数比较差异均无显著（P>0.05）。PRA血清量与各种集落数目之间的Kendall相关分析：PRA血清量与第7 d的总集落数及CFU-GM、第14 d的总集落数、CFU-GM、CFU-GEMM、BFU-E、BFU-MK呈负相关（tau-b分别为-0.793、-0.849、-0.808、-0.804、-0.645、-0.674、-0.624，P<0.01；与第14 d CFU-MK呈负相关（tau-b为 -0.466，P<0.05）。结论： 特异性PRA对脐血造血干/祖细胞的增殖、分化能力具有抑制作用；在一定浓度下其抑制作用与PRA剂量有相关性：PRA剂量越大，抑制作用越强。     

乙醇诱导小鼠导致骨髓多能干细胞成脂分化

实验证明乙醇可引起股骨头内脂肪积聚,导致骨坏死,其作用机制尚不清楚。本研究旨在观察乙醇对骨髓多能干细胞（D1细胞）的直接作用,进一步阐明乙醇性骨坏死的发病机制。     

阿尔茨海默病患者尿液细胞向诱导多能干细胞及神经细胞的诱导转化

目的:获得阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)患者来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)。方法:选取3例临床诊断明确的AD病例,收集病人尿液,分离出尿路上皮细胞,对所得细胞进行原代培养。利用电转染的方法将带有Oct4、Sox2、Klf4和SV40LT的质粒导入原代细胞内,将其重编程为i PS细胞。随后利用双向抑制Smad通路的方式继续诱导其神经分化。结果:AD病人尿液来源的细胞(以下称为尿液细胞)均成功诱导成i PS细胞,其诱导效率与正常人来源的细胞无明显差异。且病人的i PS细胞可成功分化为神经细胞,分化效率亦与正常人来源细胞相近。结论:阿尔茨海默症患者来源的尿液细胞可重编程为i PS细胞,所得到的i PS细胞可成功分化成有功能的神经元以及神经胶质细胞。     

一种人诱导多能干细胞向内皮细胞定向分化方案的建立及鉴定

背景：人诱导多能干细胞是一种与胚胎干细胞性状高度类似的多能干细胞,其具备三胚层分化潜能和持续自我更新能力,因此能够为临床细胞替代治疗提供足量目的细胞。目的：构建并鉴定一种高效的基于人诱导多能干细胞的内皮细胞定向分化实验方案。方法：采用免疫荧光技术对人诱导多能干细胞干性和增殖活性进行鉴定。采用转录因子重组蛋白和小分子化合物时序性调控系列信号通路,即在第0,1,2,5天顺序加入激活素A、GSK通路抑制剂CHIR99021/骨形态发生蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子/血管内皮生长因子/骨形态发生蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子/血管内皮生长因子/CHIR99021,人诱导多能干细胞经历心脏中胚层、内皮前体细胞命运转变并最终分化成为有功能的内皮细胞。采用明场显微镜、实时定量PCR、免疫荧光动态观察不同阶段细胞形态特征和分子标记物,采用血管成环实验验证内皮细胞的体外血管形成功能。结果与结论：(1)人诱导多能干细胞内源性高表达诱导多能干细胞干性特异标记物(OCT4、NANOG、SSEA4)和增殖标记物(Ki67);(2)开始分化后的人诱导多能干细胞经历了诱导多能干细胞、心脏中胚层、内皮前体细胞、内皮细...     

应用双胎羊水多能干细胞建立诱导分化的内对照模型

目的 快速重编程羊水细胞为多能干细胞,建立诱导分化研究的内对照模型.方法 应用逆转录病毒介导4种基因(Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4)诱导双胎羊水细胞,筛选羊水诱导性多能干细胞(human amniotic fluid-derived cells induced pluripotent stem cells,hAFDCs-iPSCs),对其进行多能性、体内外分化能力、核型等鉴定.结果 双胎hAFDC-iPSCs能维持自我更新状态,在蛋白和mRNA水平上高表达全能性的标志基因,具有体内外分化潜能,在体外长期培养能维持正常核型.结论 双胎hAFDCs-iPSCs遗传背景相一致,可以为iPSCs的诱导分化研究提供很好的内对照模型,并为胎儿的细胞自体移植治疗提供理想来源.     

维生素C体外诱导多能干细胞向心肌细胞的分化

背景：诱导多能干细胞治疗缺血性心脏病被认为是极具前景的方法,但目前仍未找到一种理想的诱导方式。 目的：观察维生素C作为诱导剂对多能干细胞体外分化为心肌细胞的影响。 方法：复苏小鼠诱导多能干细胞,传代培养后,采用直接悬浮培养法使小鼠诱导多能干细胞形成拟胚体,用含10-3,10-4,10-5,10-6 mol/L 4种不同浓度维生素C的分化培养基对其进行诱导分化,以不添加任何诱导剂作为对照组,观察各组出现搏动拟胚体的数量,计算分化比率。 结果与结论：维生素C诱导小鼠诱导多能干细胞分化为心肌细胞的最佳浓度为10^-4 mol/L,有(57.00±3.20)%的拟胚体出现搏动,显著高于不添加任何诱导剂的对照组(5.13%±0.55)%(P < 0.01)。诱导而来的心肌细胞表达心肌特异性蛋白cTnT以及α-actin。提示最佳的维生素C诱导分化条件能够促进小鼠诱导多能干细胞向心肌细胞分化,提高其分化效率。     

小鼠诱导型多潜能干细胞定向分化为功能性肝细胞

目的:探讨在体外诱导型多潜能干细胞(IPS)能否遵循正常肝脏发育途径定向分化为具备良好生理功能的肝细胞。方法:根据正常肝脏体内发育的规律,序贯应用肝脏发育所需的生长因子,设计特色培养基,诱导IPS细胞遵循正常发育途径定向高效分化为肝细胞:首先将IPS细胞定向分化为前层确定性内胚层细胞(ADE),再进一步分化为肝细胞。结果:在本研究中IPS细胞在体外可循正常发育通路定向诱导为肝细胞:先分化为前层内胚层细胞,再继续分化为肝细胞。分化的各时段实时定量RT-PCR检测显示:在mRNA表达的水平,IPS细胞经历了肝细胞在体内从胚胎干细胞的发育过程,内胚层细胞特异性RNA如CXCR4、Sox17和FOXA2在分化的早期明显升高,而早期肝细胞特异性RNA如HNF4和AFP在分化的中期开始升高,肝细胞成熟特异性RNA如白蛋白在分化的晚期才达高峰,同时IPS细胞的未分化标记RNA如OCT4在早期就明显下调。同mRNA表达一致,在分化的第20d,大部分的肝脏细胞表达甲胎蛋白和白蛋白(阳性率80%)。更为重要的是IPS来源肝细胞在体外具有典型成熟肝细胞的功能,能够摄取和释放靛青绿(ICG)并具有药物代谢酶细胞色素P450酶的活性。结论:IPS细胞在体外能够遵循正常肝脏发育通路,序贯表达肝脏发育各阶段的特色基因和蛋白,能够高效分化为有功能的肝细胞,本研究可能为临床终末期肝病进行细胞治疗提供肝细胞。     

小鼠诱导性多能干细胞的神经细胞分化与突触连接的建立及其功能分析

目的探讨小鼠诱导性多能干细胞(i PSCs)在体外某些因素的诱导下能否分化成功能性的神经细胞,以及神经细胞之间突触的发生与建立。方法首先将i PSCs悬浮培养形成拟胚体,利用维甲酸(RA)将其诱导分化成神经前体细胞,最后撤去RA贴壁培养,利用免疫荧光染色技术观察小鼠i PSCs在体外分化成神经细胞以及神经细胞之间突触发生的形态特征,利用FM1-43染色技术分析突触末端的功能活性。结果小鼠i PSCs能够在RA的诱导下向神经细胞分化,这些神经细胞可以被成熟神经元与胶质细胞标记物标记,新分化的神经元还可以观察到树突棘及突触连接的形成,在去极化刺激下突触活动增强,表现为轴突末端大量FM1-43阳性内吞颗粒。结论由小鼠i PSCs分化而来的神经细胞在体外形成突触连接的过程,提示其可以进一步分化为功能性的神经元和神经胶质细胞。     

人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的方法探讨

目的:探讨人诱导性多能干细胞(iPS细胞)体外定向分化为神经干细胞(NSCs)的方法。方法:人iPS细胞悬浮培养4 d形成的拟胚体(EB)经维甲酸(RA)诱导4 d,诱导后的EB在无血清培养基中筛选并扩增培养。倒置显微镜下观察诱导后细胞的形态变化,RT-PCR检测iPS细胞多能性基因Nanog、Oct4和Sox2的表达,免疫荧光法检测NSCs特异性标志物Nestin、神经元标志物β-tubulinⅢ和神经胶质细胞标志物GFAP的表达。结果:(1)人iPS细胞在饲养层细胞上稳定传代,表达多能性基因Nanog、Oct4和Sox2,去除饲养层后悬浮培养能形成球形EB;(2)经RA诱导后的EB在无血清培养基中筛选培养第1 d贴壁生长,周围爬出细胞;第3 d,在高倍镜下可见中央聚集的细胞呈环形的rosette结构,rosette结构增多到第7 d达高峰。对照组未观察到rosette结构。随后大部分rosette细胞脱离瓶壁悬浮生长,形成神经球样克隆。免疫荧光显示神经球呈nestin阳性表达。贴壁培养的神经球能分化成β-tubulinШ和GFAP阳性细胞。结论:RA诱导结合无血清培养基筛选法能诱导iPS细胞高效分化为NSCs。     

重编程诱导多功能干细胞的研究进展

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been first induced from mouse fibroblasts since 2006, and the research on iPSCs has made great progress in the following years. iPS cell lines were established from different somatic cells through DNA, RNA, protein, and small molecule compounds and various methods of transduction, making the induction of iPSCs more secure and effective, and more attractive prospect of clinical application. In this review, different somatic cell reprogramming, different levels of reprogramming, different transduction pathways, and prospect of application are discussed.     

质粒重编程诱导多潜能干细胞及定向分化神经干细胞

目的 　探讨游离质粒载体重编程诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)为非整合型诱导多潜能干细胞,并在体外定向分化为神经干细胞(neural stem cells, NSCs), 为神经干细胞移植治疗神经损伤提供稳定、安全的细胞来源。 方法　使用电转仪将质粒pEP4-EO2S-ET2K转入小鼠MEFs, 经诱导培养重编程为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs), iPSCs在不同诱导培养基中经2次悬浮及贴壁培养分化为NSCs,在体内及体外实验鉴定iPSCs多向分化潜能特性及NSCs特性。 结果　体内外实验显示iPSCs具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)相似的多向分化潜能, 且不整合外源性基因。iPSCs进一步分化的NSCs其相关标志基因表达与野生型NSCs相近,且较iPSCs显著增加,免疫荧光显示NSCs高表达NSC标志物 NESTIN及PAX6,在体外存活能分化为神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞。 结论　游离质粒能重编程诱导非整合型iPSCs, 并定向分化为神经干细胞及神经元, 是神经损伤修复的理想种子细胞。     

A graphene-based platform for induced pluripotent stem cells culture and differentiation

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) hold great promise as a cell source for regenerative medicine yet its culture, maintenance of pluripotency and induction of differentiation remain challenging. Conversely, graphene (G) and graphene oxide (GO) have captured tremendous interests in the fields of materials science, physics, chemistry and nanotechnology. Here we report on that G and GO can support the mouse iPSCs culture and allow for spontaneous differentiation. Intriguingly, G and GO surfaces led to distinct cell proliferation and differentiation characteristics. In comparison with the glass surface, iPSCs cultured on the G surface exhibited similar degrees of cell adhesion and proliferation while iPSCs on the GO surface adhered and proliferated at a faster rate. Moreover, G favorably maintained the iPSCs in the undifferentiated state while GO expedited the differentiation. The iPSCs cultured on both G and GO surfaces spontaneously differentiated into ectodermal and mesodermal lineages without significant disparity, but G suppressed the iPSCs differentiation towards the endodermal lineage whereas GO augmented the endodermal differentiation. These data collectively demonstrated that the different surface properties of G and GO governed the iPSCs behavior and implicate the potentials of graphene-based materials as a platform for iPSCs culture and diverse applications.     

人诱导性多能干细胞定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 观察人诱导性多能干细胞（iPS细胞）定向分化为神经干细胞（NSCs）的潜能。方法 用维甲酸（RA）诱导人iPS细胞向NSCs分化。倒置显微镜下观察iPS细胞的形态变化,RT-PCR检测NANOG, OCT4, SOX2的表达;免疫组织化学方法检测NESTIN、SOX2、β-TUBULIN Ш和GFAP的表达。结果RA诱导后第4天,贴壁的拟胚体出现了早期神经祖细胞特有的神经管样结构并不断增多,细胞表达神经巢蛋白NESTIN,而对照组未观察到神经管样结构。神经管样结构内的细胞能分化为β-TUBULIN Ш阳性的神经元,但GFAP阳性的星形胶质细胞少见。结论 人iPS细胞具有定向分化为NSCs的潜能,并能模拟神经发育过程。     

小鼠来源诱导多能干细胞定向分化为神经元的体外实验研究*

 目的： 探讨源于小鼠的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）体外定向分化为神经元的方法,为大量稳定地获得神经元及提供种子细胞治疗脊髓损伤奠定体外实验基础。方法: 源于小鼠的iPSCs在不同的诱导培养基中经悬浮、贴壁、再悬浮和再贴壁培养。免疫荧光检测iPSCs多能性标志物、神经干细胞及其分化细胞标志物的表达。RT-PCR检测神经元及胶质细胞基因表达并行神经元基因测序鉴定,流式细胞术检测iPSCs定向分化为神经干细胞及进一步分化为神经元的比例。结果: 源于小鼠的iPSCs表达干细胞多能性标志物Sox2、Oct4和SSEA1。悬浮培养可以形成类球形拟胚体;经诱导及机械分离后的细胞可形成神经球,神经球经诱导后可分化为神经元。免疫荧光显示iPSCs可诱导出表达nestin的神经球,贴壁培养的神经球可分化为分别表达微管相关蛋白2（MAP-2）、胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）及髓磷脂碱性蛋白(MBP)的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。RT-PCR及基因鉴定结果显示形成小鼠神经元;流式细胞术检测结果显示分化细胞中神经干细胞和神经元的比例分别为63.93%±1.47%和21.40%±1.70%。结论: 源于小鼠的诱导多能干细胞能够稳定地在体外定向分化为神经元,为脊髓损伤的治疗提供了一个可靠的细胞来源。