二代测序技术在病原学检测中的价值

感染是儿童常见的疾病谱,精准、快速的病原体诊断能帮助临床医师有的放矢地进行治疗,改善患儿预后。传统的病原体诊断方法存在耗时长、灵敏度低等缺陷,近些年来二代测序技术不断发展并应用于临床,成为病原学诊断的新方法。其中宏基因二代测序技术应用最多,它可以无偏移地将标本中所有病原体的核酸都检测出来,此技术包括了样本采集、核酸提取、文库制备、高通量测序、生物信息分析和报告解读几个基本步骤。由于整个流程涉及临床、微生物、生物信息多个领域,故对于报告结果的判读需要临床医生结合患者及其他辅助诊断手段仔细斟酌反复求证。临床医生需要了解二代测序的优势和局限性,才能更好地利用这项技术服务于患者。     

脑脊液二代测序对5例结核性脑膜炎患儿精准诊断价值研究

目的 探讨脑脊液病原菌二代测序(NGS)技术在结核性脑膜炎(TBM)早期精准诊断中的应用价值.方法 收集华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院神经内科2019-01-01-2019-12-15确诊的TBM 5例患儿,5例均检验了脑脊液病原菌NGS 1～2次,分析相关临床资料、血液及脑脊液检验结果、结核相关检验指标、颅脑...     

二代测序技术在杜氏肌营养不良症家系中的分子诊断应用

对22例临床拟诊断为杜氏肌营养不良症（DMD）患儿的家系临床资料进行分析,探讨二代测序（NGS）技术在DMD患者分子诊断中的临床应用价值。先证者同时送检遗传性神经肌肉病相关panel行NGS检测和Dystrophin基因多重连接探针扩增术（MLPA）检测,分析两种方法检出的Dystrophin基因外显子缺失/重复突变结果,Dystrophin基因点突变经Sanger测序验证。通过NGS测序,22例先证者均检出Dystrophin基因突变,其中外显子缺失/重复型突变14例,点突变及微小变异8例。MLPA检测结果与NGS检测结果一致。Sanger测序结果显示NGS检测出的点突变及微小变异是正确的。1例错义突变c.6290G>T,1例无义突变c.3487C>T,4例微小缺失导致的移码突变c.1208delG、c.7497_7506delGGTGGGTGAC、c.9421_9422delAA、c.8910_8913delTCTC在人类基因突变数据库中均未见报道,为Dystrophin基因新突变。该研究结果显示NGS技术可全面检测Dystrophin基因外显子缺失/重复、点突变、微小缺失和内含子突变等变异,在DMD患者分子诊断中的临床应用有一定价值,值得推广。     

串联质谱检测和高通量测序对青海地区新生儿出生缺陷筛查和诊断的横断面调查

目的 运用串联质谱检测和高通量测序(NGS)技术,初步分析青海高海拔地区新生儿出生缺陷的发病率及病种情况,探讨青海地区行串联质谱检测+NGS对新生儿出生缺陷防治的价值。方法 对2018年1月8日至10月18日青海部分地区活产新生儿足跟血行串联质谱遗传代谢病筛查(包含20种氨基酸代谢病、12种脂肪酸代谢病和17种有机酸代谢病),对串联质谱筛查结果异常的新生儿人群及串联质谱筛查人群中具有特殊面容、结构畸形新生儿,母亲有不良孕产史的新生儿行NGS检测,考察串联质谱+NGS筛查(包含2 742个已知致病基因)新生儿出生缺陷的作用和价值。结果研究期间共收集新生儿干血滴滤纸片4 016份(例),男性2 125例(51.6%),汉族2 332例(58.1%),藏族755例(18.8%),回族659例(16.4%),串联质谱筛查提示代谢异常59例(1.47%),提示遗传代谢病(IMD)可能5例,继发改变可能54例。经NGS基因分析确诊3例IMD,包括氨基酸代谢病2例(高苯丙氨酸血症2例)以及脂肪酸代谢病1例(原发性肉碱缺乏症),遗传代谢病总发病率为1/1 339。NGS检测基因变异8例(含3例IMD),拷贝数变异6例。青海地区汉、藏、回民族新生儿血氨基酸及肉碱水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论 青海高原地区新生儿串联质谱IMD筛查阳性率较国内平原地区高;NGS不仅可以从基因水平确诊质谱筛查提示的阳性病例,还可以诊断高危新生儿串联质谱筛查无法检出的其他新生儿出生缺陷。     

串联质谱检测和高通量测序对青海地区新生儿出生缺陷筛查和诊断的横断面调查

目的 运用串联质谱检测和高通量测序(NGS)技术,初步分析青海高海拔地区新生儿出生缺陷的发病率及病种情况,探讨青海地区行串联质谱检测+NGS对新生儿出生缺陷防治的价值。方法 对2018年1月8日至10月18日青海部分地区活产新生儿足跟血行串联质谱遗传代谢病筛查(包含20种氨基酸代谢病、12种脂肪酸代谢病和17种有机酸代谢病),对串联质谱筛查结果异常的新生儿人群及串联质谱筛查人群中具有特殊面容、结构畸形新生儿,母亲有不良孕产史的新生儿行NGS检测,考察串联质谱+NGS筛查(包含2 742个已知致病基因)新生儿出生缺陷的作用和价值。结果研究期间共收集新生儿干血滴滤纸片4 016份(例),男性2 125例(51.6%),汉族2 332例(58.1%),藏族755例(18.8%),回族659例(16.4%),串联质谱筛查提示代谢异常59例(1.47%),提示遗传代谢病(IMD)可能5例,继发改变可能54例。经NGS基因分析确诊3例IMD,包括氨基酸代谢病2例(高苯丙氨酸血症2例)以及脂肪酸代谢病1例(原发性肉碱缺乏症),遗传代谢病总发病率为1/1 339。NGS检测基因变异8例(含3例IMD),拷贝数变异6例。青海地区汉、藏、回民族新生儿血氨基酸及肉碱水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论 青海高原地区新生儿串联质谱IMD筛查阳性率较国内平原地区高;NGS不仅可以从基因水平确诊质谱筛查提示的阳性病例,还可以诊断高危新生儿串联质谱筛查无法检出的其他新生儿出生缺陷。     

外周血宏基因二代测序技术诊断儿童广州管圆线虫脑膜炎2例分析

目的 探讨基于外周血宏基因二代测序(mNGS)技术诊断儿童广州管圆线虫脑膜炎的可行性.方法 回顾分析确诊为广州管圆线虫脑膜炎患儿的临床资料和mNGS检测结果.结果 男女各1例,分别为11和20月龄.均有未熟淡水水产品接触史,病情危重,经历较长时间重症监护室治疗.外周血和脑脊液的嗜酸性粒细胞比值均明显升高.颅脑磁共振成像...     

宏基因组二代测序技术在儿童细菌性脑膜炎病原诊断中的价值北大核心CSCD

目的:探讨宏基因组二代测序技术在儿童细菌性脑膜炎病原诊断中的应用价值。方法:回顾性分析2019年1月1日至2020年12月31日复旦大学附属儿科医院住院诊断为“细菌性脑膜炎”或“化脓性脑膜炎”或“中枢神经系统感染”的189例患儿的病原学检测结果。分别采用培养和宏基因二代测序检测方法检测细菌性脑膜炎患儿的脑脊液,分析2种检测方法病原检出率的差异。根据就诊时患儿年龄分为新生儿组(≤28日龄)和非新生儿组(>28日龄),采用χ^(2)检验进行组间比较。以脑脊液培养为金标准,分析宏基因组二代测序技术在儿童细菌性脑膜炎诊断中的灵敏度和特异度。结果:189例细菌性脑膜炎患儿中男116例、女73例。血和(或)脑脊液培养共检出76株病原菌,其中革兰阳性菌50株(65.8%),检出率较高的致病菌有无乳链球菌18株(23.7%)、大肠埃希菌17株(22.4%)、肺炎链球菌15株(19.7%)。非新生儿组革兰阳性菌感染率高于新生儿组[76.0%(38/50)比50.0%(13/26),χ^(2)=5.24,P=0.020]。48例患儿脑脊液同时送检宏基因二代测序检测和培养,宏基因二代测序检测的病原检出率高于培养方法[20例(41.7%)比12例(25.0%),χ^(2)=16.45,P<0.001]。脑脊液宏基因二代测序和培养检测结果的一致性为79.2%(38/48),其中同时阳性的11例患儿均检出同一种病原菌。以脑脊液培养结果为金标准,宏基因组二代测序技术在细菌性脑膜炎的诊断中的灵敏度为91.7%,特异度为75.0%。结论:宏基因组二代测序技术可提高儿童细菌性脑膜炎的病原检出率,且与脑脊液培养检出结果一致性较高。在诊断细菌性脑膜炎时,尤其在疑似诊断患儿中传统病原学无法明确病原时应尽早完善宏基因二代测序检测。     

免疫缺陷并发重症肺炎患儿应用宏基因组二代测序的病原学分析

目的:探讨宏基因组二代测序(mNGS)在免疫缺陷并发重症肺炎患儿中的应用,了解病原体分布,为临床经验性预防和治疗提供参考。方法:收集2019年7月至2020年7月在我院PICU确诊为重症肺炎的免疫缺陷患儿的一般临床资料、传统检测方法报告及mNGS结果,评估两者与临床判断的一致性。结果:23例患儿中,男15例,女8例,年...     

宏基因组二代测序技术协助诊断3例无焦痂儿童恙虫病北大核心CSCD

目的对3例无焦痂恙虫病患儿的病原宏基因组二代测序技术(mNGS)检测结果进行分析,探讨其在临床的应用价值。方法回顾性分析。2018年6月至2019年10月温州医科大学附属第二医院、育英儿童医院收治的3例重症无焦痂儿童恙虫病的临床资料,2例为5岁男童,1例为6岁女童。3例患儿的外周血均进行mNGS检测。结果3例患儿经mNGS检测后均提示恙虫病东方体感染,且未并其他病原感染。例1死亡,例2和例3治愈出院。结论无焦痂恙虫病患儿早期诊断困难。对于临床感染性疾病,特别是早期无法确诊的疑难危重性感染性疾病,mNGS能够提供快速准确的病原学诊断支持,为精准治疗提供帮助。     

Prenatal diagnosis of Gaucher disease using next‐generation sequencing

In the prenatal diagnosis of Gaucher disease (GD), glucocerebrosidase (GBA) activity is measured with fetal cells, and gene analysis is performed when pathogenic mutations in GBA are identified in advance. Herein is described prenatal diagnosis in a family in which two children had GD. Although prior genetic information for this GD family was not obtained, next‐generation sequencing (NGS) was carried out for this family because immediate prenatal diagnosis was necessary. Three mutations were identified in this GD family. The father had one mutation in intron 3 (IVS2 + 1), the mother had two mutations in exons 3 (I[‐20]V) and 5 (M85T), and child 1 had all three of these mutations; child 3 had none of these mutations. On NGS the present fetus (child 3) was not a carrier of GD‐related mutations. NGS may facilitate early detection and treatment before disease onset.     

Use of targeted next‐generation sequencing for molecular diagnosis of craniosynostosis: Identification of a novel de novo mutation of EFNB1

Craniofrontonasal syndrome (CFNS; MIM#304110) is characterized by asymmetric facial features with hypertelorism and a broad bifid nose due to synostosis of the coronal suture. CFNS shows a unique X‐linked inheritance pattern (most affected patients are female and obligate male carriers exhibit a mild manifestation or no typical features at all) associated with the ephrin‐B1 gene (EFNB1) located in the Xq13.1 region. In this study, we performed targeted, massively parallel sequencing using a next‐generation sequencer, and identified a novel EFNB1 mutation, c.270_271delCA, in a Japanese female patient with craniosynostosis. Because subsequent Sanger sequencing identified no mutation in either parent, this mutation was determined to be de novo in origin. After obtaining molecular diagnosis, a retrospective clinical evaluation confirmed the clinical diagnosis of CFNS in this patient. Comprehensive molecular diagnosis using a next‐generation sequencer would be beneficial for early diagnosis of the patients with undiagnosed craniosynostosis.     

基因捕获联合高通量测序技术在甲基丙二酸血症诊断中的应用

目的 探讨新一代基因测序平台(HiSeq2000)在甲基丙二酸血症(MMA)诊断中的价值.方法 1.采集已经临床确诊的9例MMA患儿外周血并提取DNA,将设计好的基因捕获探针与患儿DNA文库混合,然后利用基因捕获联合高通量测序分析技术对有机酸代谢相关的48个基因全部外显子区域进行测序.2.获得原始数据,去除接头和过滤低质量数据,对数据进行SNP、InDel等分析,并采用Sanger测序方法对异常位点进行测序验证.3.气相色谱-质谱联用分析技术对尿液标本的有机酸测定及其他辅助检查.结果 1.突变基因:7例存在MMACHC基因突变,7例患儿中共检测出7种突变,包括c.482G＞A、c.567_568insT、c.609G＞A、c.440_ 441del、c.80A＞G、c.315C＞G、c.90G＞A,其中c.440_441 del为未见报道突变;1例存在甲基丙二酰辅酶A变位酶(MUT)基因突变,均为内含子异常,分别是c.754-1G＞C、c.1677-1G＞A,其中c.754-1G＞C为未见报道突变;1例未检测到突变.2.临床症状:9例患儿均存在智力运动发育迟缓,伴抽搐3例,反复顽固性代谢性酸中毒、头痛及面瘫、反复性溶血各1例.脑电图异常9例,头颅磁共振异常8例,尿液中甲基丙二酸水平均升高(273.4 ～146 022.8倍),血同型半胱氨酸水平增高8例(27.13～ 396.84 μmol/L,正常＜20 μmol/L).3.Sanger测序验证:均符合新一代测序平台结果,无假阳性存在.结论 1.进一步证明c.609G＞A突变位点为中国MMA合并同型半胱氨酸血症患儿的热点突变位点.MMA基因突变类型较多,与临床症状无明显相关性.2.推测MMACHC基因c.440_441 del突变及MUT基因c.754-1G＞C突变为新发突变.3.基因捕获联合高通量基因测序技术一次性捕获突变基因数量大,获取疾病的遗传信息量广,具有高通量、高灵敏度、高效等特点,适合于MMA患儿检测,也可为其他儿科临床常见遗传性疾病的检测提供参考.     

Beyond screening for chromosomal abnormalities: Advances in non-invasive diagnosis of single gene disorders and fetal exome sequencing

Emerging genomic technologies, largely based around next generation sequencing (NGS), are offering new promise for safer prenatal genetic diagnosis. These innovative approaches will improve screening for fetal aneuploidy, allow definitive non-invasive prenatal diagnosis (NIPD) of single gene disorders at an early gestational stage without the need for invasive testing, and improve our ability to detect monogenic disorders as the aetiology of fetal abnormalities. This presents clinicians and scientists with novel challenges as well as opportunities. In addition, the transformation of prenatal genetic testing arising from the introduction of whole genome, exome and targeted NGS produces unprecedented volumes of data requiring complex analysis and interpretation. Now translating these technologies to the clinic has become the goal of clinical genomics, transforming modern healthcare and personalized medicine. The achievement of this goal requires the most progressive technological tools for rapid high-throughput data generation at an affordable cost. Furthermore, as larger proportions of patients with genetic disease are identified we must be ready to offer appropriate genetic counselling to families and potential parents. In addition, the identification of novel treatment targets will continue to be explored, which is likely to introduce ethical considerations, particularly if genome editing techniques are included in these targeted treatments and transferred into mainstream personalized healthcare. Here we review the impact of NGS technology to analyse cell-free DNA (cfDNA) in maternal plasma to deliver NIPD for monogenic disorders and allow more comprehensive investigation of the abnormal fetus through the use of exome sequencing.     

复旦大学附属儿科医院高通量测序数据一体化全流程闭环分析系统及临床应用案例分析

背景：目前的临床遗传诊断中,外显子组捕获测序(ES)和全基因组测序(WGS)均有广泛的应用场景且在综合性价比和变异检测范围等方面各有优势;建立支持两种不同建库策略测序方案的整合性遗传诊断流程,是进一步提高遗传诊断敏感性和检测效率的关键。 目的整合ES以及WGS场景下的多变异类型分析、遗传病复杂临床表型的标准化与结构化、表型导向的遗传变异分析系统,建立从临床检测申请到遗传报告反馈的一体化流程。 设计：流程开发。 方法：(1)建立复旦大学附属儿科医院高通量测序数据一体化全流程闭环分析系统（复旦流程3.0）各个模块：①病史处理,②结构化遗传表型,③测序实验,④变异检测,⑤变异解读,⑥质控复核,⑦基因型表型联合分析。(2)代表性病例重测分析：根据结论性变异的类型和诊断难度选择代表性病例,展示代表性病例从病史处理开始到报告草稿为止各模块的运行情况。 主要结局指标：代表性病例分析过程中的结构化表型、数据质控、变异检测及解读、最终诊断。 结果：对3例代表性病例的重分析中,分别进行了经济版家系WGS、先证者WGS以及ES;病史成功提取结构化表型;FastQ及BAM文件结果数据质控良好;检测到的变异经解读之后进行基因型表型联合分析,分别检测出3例病例的复杂遗传模式。例1：ANTXR2基因点突变NM_058172:c.1294C>T与4q21.22 约13 kb的结构变异缺失形成隐性纯合致病;例2：线粒体MT ND6基因致病变异m.14459G>A,异质性>99.5%;例3：SMN1基因纯合致病变异NM_000344: c.863G>T合并SMN1基因单拷贝缺失。 结论：复旦流程3.0可整合ES和WGS数据,处理不同类型的变异结果,最终形成遗传诊断,且对复杂变异类型有高效处理能力。