TA-SOD融合蛋白表达载体的构建

目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性.方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化人肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达.表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性.结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25 000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%.纯化的蛋白浓度为700 mg/L,活性为197.54 U/L.结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体.     

TAT-SOD融合蛋白表达载体的构建

目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性。方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性。结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%。纯化的蛋白浓度为700mg/L,活性为197.54U/L。结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂衍生物在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达重组人组织型纤溶酶原激活剂衍生物(rPAm),并检测rPAm的活性。方法用PCR从质粒pLFrGGI上扩增出目的蛋白(rPAm)基因,再亚克隆到酵母表达载体pMEX9K中,转化到宿主菌GS115,菌落PCR鉴定转化子,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物,再通过层析法纯化目的蛋白,用溶圈法测定目的蛋白的活性。结果表达的重组蛋白分子量约为50kD。纯化后的目的蛋白的纯度可达到95%。Western-blot显示能与抗tPA抗体特异性结合,纯化后rPAm比活性为5.02×105IU/mg,比活性与t-PA相当。结论成功构建了rPAm酵母表达工程菌,建立了对目的蛋白的纯化方法。     

基于重组组织因子凝血活酶试剂的研究进展

在20世纪90年代出现可纯化TF之前,凝血活酶试剂由人或动物组织粗提物制成。近年来,已经使用高度纯化的重组组织因子（rTF）或者可溶性组织因子（sTF）来制备凝血活酶试剂。本文综述国内外基于重组组织因子的凝血酶原试剂研发技术的发展历程,归纳出重组凝血活酶试剂优于组织提取物试剂的特点,分析了凝血活酶的发展趋势,并指出高灵敏性和稳定性重组凝血活酶是未来凝血活酶的发展方向。     

人血管抑素K1-3在毕赤酵母胞内表达的研究

目的:构建人血管抑素K1-3的重组酵母胞内表达质粒PHIL-D2/K1-3,获得重组目的蛋白.方法:从胎儿肝脏组织用RT-PCR方法扩增人血管抑素K1-3目的基因,克隆至酵母胞内表达质粒PHIL-D2中,线性化后转化到毕赤酵母GS115胞内,经PCR和Sourthern杂交筛选出阳性转化子,并用甲醇诱导表达.表达产物进行SDS-PAGE(12%)和Western blot检测,经赖氨酸亲和层析柱纯化后,用Lowry法测定蛋白含量,并进行生物活性测定.结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示,表达蛋白质的相对分子量为30kd左右,低糖基化.Lowry法测定蛋白表达量为6.8mg/L.活性测定实验表明重组血管抑素能特异抑制人血管内皮细胞的增殖.结论:在毕赤酵母GS115胞内成功表达了人血管抑素K1-3重组蛋白.     

重组人中期因子的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的：表达和纯化具有生物学活性的重组人中期因子蛋白。方法：应用RT—PCR从人肝细胞癌组织总RNA中扩增中期因子cDNA,将其克隆到表达载体pET-24a,在大肠杆菌中诱导表达,经肝素-琼脂糖亲和层析柱纯化,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹和细胞增殖试验对纯化产物进行分析鉴定。结果：构建的重组质粒pET—HMK能在大肠杆菌中高表达,诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中,经肝素琼脂糖柱亲和层析后纯化产物呈单一条带,特异性抗体反应证实是重组人中期因子,细胞增殖试验显示其能育效促进NIH3T3细胞生长,并且具有剂量依赖性。结论：原核系统表达的重组人中期因子蛋白纯品具有刺激细胞增殖的活性。     

犬钩虫抗凝肽AcaNAP8的原核表达及其抗凝活性

目的在大肠杆菌中重组表达犬钩虫抗凝肽AcaNAP8基因,并检测表达产物抗凝活性。方法设计引物,将AcaNAP8成熟肽编码序列克隆、连接到原核表达载体pET32a,构建重纽表达质粒;成功构建的重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中用IPTG诱导表达,SDS—PAGE分析表达情况;诱导表达的重组蛋白用Ni亲和层析进行纯化;用凝血酶原时间（PT）和活化的部分凝血活酶时间（aPTT）检测重组产物体外抗凝活性。结果成功构建了pET32a／AcaNAP8原核表达重组质粒,在大肠杆菌中成功表达并获得了重组AcaNAP8,表达产物能明显延长PT及aPTT。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP8融合蛋白,表达产物具有显著抗凝活性。该实验为进一步探讨AcaNAP8的作用机制及应用奠定了基础。     

重组人可溶性DR5 蛋白的表达、制备及其生物活性检测

目的：纯化毕赤酵母GS115菌株表达的重组人可溶性死亡受体5(DR5)蛋白，并研究其对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)所诱导细胞凋亡的阻断效应。方法：大量扩增可溶性DR5酵母表达载体转化阳性的毕赤酵母GS115菌株，收集上清，利用ProBond^TM亲和层析柱纯化获得重组可溶性DR5蛋白，用SDS-PAGE、Western Blot检验纯化产物的特异性和纯度。用MTT法检测纯化的可溶性DR5蛋白对TRAIL诱导人宫颈癌细胞系Hela细胞凋亡作用的阻断效应。结果：转化阳性的毕赤酵母GSll5菌株可成功表达分子量为26kD的可溶性DR5蛋白，经ProBond^TM亲和层析柱纯化。SDS-PAGE、Western Blot鉴定，结果显示获得了高纯度的重组人可溶性DR5蛋白，蛋白产量达20斗g／ml；体外活性检测结果显示，纯化的可溶性DR5蛋白可部分阻断TRAIL诱导的Hela细胞的凋亡，阻断率最高达53．6％。结论：经纯化后的重组人可溶性DR5蛋白可有效阻断TRAIL诱导的细胞凋亡反应。     

NDRG2蛋白的毕赤酵母可溶表达与纯化

目的：酵母表达并纯化可溶性NDRG2蛋白。方法：从pRSET-A-ndrg2重组质粒中扩增出6his-ndrg2融合基因，克隆入酵母表达载体pPIC3.5K；酵母重组表达载体pPIC3.5K-6his-ndrg2电转化入毕赤酵母GS115，并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选；对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达，可溶性表达产物经Ni-NTA亲合层析纯化。结果：构建得到酵母融合重组表达载体pPIC3.5K-6his-ndrg2；经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体以上的重组酵母表达菌株；诱导后表达得到6his-NDRG2融合蛋白，并成功纯化得到可溶性表达产物。结论：表达并纯化得到可溶性NDRG2蛋白，为进一步研究NDRG2的结构与功能打下了必要的基础。     

重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中的高效表达

目的:在大肠杆菌中高效表达重组人可溶性VEGI,纯化重组蛋白并分析其生物学活性.方法:采用PCR方法对编码人VEGI全基因进行修饰,获得编码成熟蛋白第29～174位氨基酸的C端胞外区基因片段,将PCR产物亚克隆到 pMD-18T中,经DNA测序证实后亚克隆入高表达载体pLOU-1,转化大肠杆菌BL21,获得高表达菌株.经IPTG诱导获得高表达,纯化表达产物并检测其对内皮细胞ECV304增殖的抑制活性 .结果:重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中获得高效表达,约占细菌总蛋白的40％;纯化的重组蛋白经复性后具有直接抑制内皮细胞增殖的活性.结论: 重组人可溶性VEGI在大肠杆菌中获得高效表达,且表达的重组蛋白具有抑制内皮细胞生长作用,为研究其抗肿瘤作用打下了基础.     

人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的：利用巴斯德华赤（Pichia pastoris）酵母真核表达系统,构建真核表达载体pPIC9K与人溶菌酶基因（humanlysozyme,hLY）的重组质粒pPIC9K-hLY,表达出具有活性的人溶菌酶。方法：此项研究在本实验室构建的人溶菌酶（hLY）基因与pUC19的重组质粒pUC19-hLY的基础上,通过设计一对引物,用多聚酶链式反应（PCR）扩增出人溶菌酶全基因片段后,将其克隆到巴斯德毕赤酶母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重建质粒pPIC9K-hLY,经Bg1Ⅱ酶切线性化后,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内。通过G418筛选,选到的高拷贝转化子经PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合,阳性克隆经甲醇诱导进行表达。结果：序列测定,经PCR扩增后的人溶菌酶基因与献发表的序列相比,缺失4个碱基。我们决定采用重组PCR法予以纠正,经序列测定结果正确。用PCR检测,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合。用甲醇诱导表达并以SDS－PAGE分析,在Mr为15000左右出现一条蛋白带,表达量约占上清总蛋白的0．47。Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性。用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表态产物具有人溶菌酶的活性。结论：成功的构建了重组质粒pPIC9K-hLY并在毕赤醇母中表达了人溶酶基因。     

重组融合蛋白rTMP-GH在巴斯德毕赤酵母中表达的研究

目的 实现TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)与人生长激素(human growth hormone,hGH)的重组融合蛋白rTMP-GH在巴氏毕赤酵母中的高效表达.方法 以含有rTMP-GH核苷酸序列的原核质粒为模板,PCR方法获得rTMP-GH的编码序列,并亚克降至载体pPIC9K中,将所构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒转化酵母宿主细胞GS115,MD/MM平板及G418抗性筛选高表达株,然后进行试管补料分批表达,Western blot对表达产物进行鉴定,通过巨核细胞集落形成能力对其,圭物学活性进行初步检测.结果 成功构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒,筛选到高表达rTMP-GH重组融合蛋白的巴氏毕赤酵母细胞株,初步证实所表达产物具有刺激巨核细胞集落形成的能力.结论 成功实现了rTMP-GH融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达.     

重组sCR1在毕赤酵母细胞中的表达、纯化及鉴定

目的:酵母细胞SMD 1168表达人sCR1,并对重组蛋白进行纯化。方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD 1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及W estern b lot鉴定,并通过N i2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果:经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48~72 h sCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为M r大于31 KDa的蛋白区带,在W estern b lot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经N i2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

人补体受体1型活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的 实现人补体受体1型(complement receptor type 1,CR1)活性片段SCR15-18在毕赤酵母中的分泌表达.方法 用PCR从原核表达质粒pET32a-sCR1-SCR15-18上扩增CR1-SCR15-18的编码基因,并克隆到毕赤酵母分泌表达质粒pPIC9,构建重组质粒pPIC9-CR1-SCR15-18,鉴定后测序;重组质粒电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,菌落PCR技术筛选阳性转化株;经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白的表达;Ni2*-NTA agarose亲和层析纯化目的蛋白,并用体外抑制补体溶血反应实验测定目的蛋白的生物活性.结果 成功构建重组表达质粒pPIC9-CR1-SCR15-18;SDS-PAGE和Western blot证实目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达;表达产物经镍柱快速纯化后,能够明显抑制补体的体外溶血.结论 在毕赤酵母中成功实现了CR1-SCR15-18蛋白的分泌表达,该蛋白具有较高的抑制补体溶血的生物活性.     

EGF-IL-18在毕赤酵母中的表达

目的：在甲醇营养型毕赤酵母表达系统中分泌表达人表皮生长因子受体干扰基序和白细胞介素-18（EGF-IL-18）融合蛋白。方法：PCR扩增EGF-IL-18基因,克隆到表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后用电转化导入毕赤酵母GS115,筛选重组子,经摇瓶培养,用甲醇诱导表达EGF-IL-18融合蛋白。结果：序列分析表明,克隆到pPIC9K载体中的EGF-IL-18基因与设计相符,SDS-PAGE电泳分析显示表达产物EGF-IL-18以可溶性分子存在于酵母培养基中,Western印记表明表达产物EGF-IL-18具有良好的抗原性。结论：重组蛋白EGF-IL-18在毕赤酵母GS115中成功分泌表达。     

Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor （VEGF165）in pichia pastoris and Its Biological Activity

Objective :To express human vascular endothelial growth factor(hVEGF165) cDNA in Pichia pastroris,purify the expressed product and detect the biological activity of it.Methods:By inserting hVEGF165 cDNA coding 165 amino acid esidues into Pichia pastoris expression vector pPIC9K containing AOX1 promoter and the sequences of α secreting signal peptides,a recombinant expression plasmid pPIC9K/hVEGF165 was constructed and transformed to yeast host strain KM71,then multiple-copy insert transformants were screened out and cultured in flasks,and hVEGF165 was expressed under the induction of 1% methnol.Results:SDS-PAGE showed that after being induced with 1% methanol for 4d,the expressed product existed in supernatant in the form of soluble molecule and contained 60% of total protein expressed.Western blot showed good antigenicity and specificity of expressed product.After being purified by Heparin-Sepharose CL6B affinity chromatography,the purity of expressed product reached above 90%,Biological assays proved that the expressed product could stimulate the proliferation of HUVEC.Conclusion:hVEGF165 was successfully expressed.The study opened up a wide prospect for the application of VEGF165 in the prevention and treatment of ischemic heart disease and other tissue ischemic diseases such as secondary arterial occlusion in limbs.     

人组织因子途径抑制因子在毕赤酵母中的表达与纯化

目的利用毕赤酵母高效表达人组织因子途径抑制因子（TFPI）。方法利用基因定点突变技术对人TFPIcDNA特定序列进行定点突变（同义突变）。将获得的突变体及野生型cDNA分别插入表达载体pPic9中,转化酵母宿主菌GS115和KM71,用0.5%的甲醇诱导重组蛋白表达。细胞培养上清经超滤浓缩后,依次用DEAE-sepharose Fast Flow、Heparin-sepharose CL6B及Sephadex G-75柱层析分离纯化得到重组蛋白,分别采用凝胶扫描成像定量分析和底物显色法测定重组蛋白的表达量和活性。结果凝胶扫描成像定量分析显示,同义突变体的表达量（1mg/L）显著高于天然型（0.1mg/L）。活性测定表明GS115重组菌在诱导表达12h后即可于培养上清中检测到TFPI活性,36h达峰值;而KM71重组菌诱导表达24h后才开始于培养上清中检测到TFPI活性,72h达峰值。两个菌株中突变体mTFPI-pPic9转化子的表达量均显著高于TFPI-pPic9转化子。重组蛋白相对分子质量约为42000。结论对TFPI-cDNA特定序列进行同义突变后能显著提高重组蛋白在毕赤酵母细胞中的表达,且显著高于在酿酒酵母和昆虫细胞的表达;重组蛋白具有良好的生物活性。因此,利用毕赤酵母表达TFPI是一种较好的选择。     

Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Flt—1 Extracellular Domain 1—3 Loop cDNA in Pichia pastoris,Purification of the Expressed Product and Detection of Its Biological Acti

Objective:to express human vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 extracellular domain 1-3 loop cDNA in Pichia.pastroris,and to purify the expressed product and detect its biological activity.Methods:By inserting human Flt-1(1-3 loop)cDNA coding 316 amino acid residues into Pichia pastoris expression vector pPIC9K containing AOX1 promoter and the sequences of α secreting signal peptides,a recombinant expression plasmid pPIC9K/Flt-1(1-3) was constructed and transformed to yeast host strain GS115,then His^ Muts phenotype transformant was screened out and cultured in flasks,and Flt-1(1-3) was expressed under the induction of 1% methanol.Results SDS-PAGE showed that after being induced with 1% methanol for 4d ,the expressed product existed in supernatant in the form of soluble molecule and contained 60% of total protein expresses.Western blot showed good antigenicity and specificity of expressed product.After being purifed by CM-Sepharose FF and Sephacry1 S-100 chromatography,the purity of the expressed product reached obove 90%,Biological assay proved that the expressed product could bind to hVEGF165 and inhibit the proliferation of HUVEC stimulated by hVEGF165.Conclusion:Human vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 exracellular domian 1-3 loop was successfully expressed.The study lays f foundation for further application of the expressed product in the troduct in the treatment of vasoformation related diseases,such as tumor and diabetic retinopathy.     

人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究

目的 探索人α-防御素5成熟肽(mHD5)在酵母中高效分泌表达的可行性.方法 PCR扩增获得酵母菌偏好的mHD5密码子序列,应用基因重组方法构建表达质粒,电击转化酵母菌株GS115,应用G418浓度梯度、表型和PCR技术筛选高拷贝转化株.经摇瓶发酵和甲醇诱导,Tricine-SDS-PAGE分析重组mHD5(rmHD5)表达量,并采用Western blot鉴定.选用琼脂扩散法检测rmHD5的抑菌活性.结果 构建了pPIC9K-mHD5酵母表达质粒.筛选得到3株His /Mut 表型,且耐受8 mg/ml G418的多拷贝转化酵母菌株,成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清.rmHD3对大肠杆菌(EC25922)和金黄色葡萄球菌(SA25923)2种标准菌株均具有明显的抑菌活性.结论 防御素基因可以在毕赤酵母中实现分泌型离表达,此策略可能是抗菌肽工业化开发的有效途径之一.     

IL-18在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:探索人IL-18成熟蛋白(mhIL-18)在毕赤酵母中的高效表达. 方法:采用SOEing及不对称PCR方法扩增出mhIL-18基因并构建融合型表达载体pPIC9-IL-18-Intein,转化入毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,运用SDS-PAGE和Western Blot分析重组蛋白的表达,并经亲和层析后用MTT法检测表达的mhIL-18生物活性. 结果:成功构建载体并转化入毕赤酵母,经甲醇诱导,重组的GS115可分泌mhIL-18,其表达在96 h时达高峰,分泌量可达100 mg/L. 亲和层析后的mhIL-18纯度可达95%,并具有显著的IL-18的生物学活性. 结论:在毕赤酵母中成功表达具有显著生物学活性的mhIL-18.