结核分枝杆菌特异性抗原ESXO的重组制备及其免疫原性评估

目的 评估结核分枝杆菌(MTB)重组特异性抗原ESXO在大肠埃希菌中的高效表达,并评价其免疫原性.方法 采用常规分子克隆方法获得MTB重组蛋白ESXO.酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测84份确诊结核病(TB)患者血清和48份健康人血清中相应的抗结核ESXO抗体水平,评价血清学抗原活性,并与结核早期分泌蛋白ESAT-6和CFP-10的检测结果进行比较.结果 重组特异性抗原ESXO在大肠杆菌中获得成功表达,其在E.coli BL 21 plysS (DE3)中以可溶性和包涵体两种形式存在,相对分子质量(27 300)与预期相符,血清学抗原活性评估结果显示其特异度和敏感度分别为94.0％ (45/48)和32.1％(27/84),特异度与ESAT-6和CFP-10相当,敏感度高于ESAT-6.结论 结核特异性抗原ESXO有望成为新的TB诊断与疫苗设计的候选抗原.     

结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B蛋白在结核病诊断的价值

目的探讨重组结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B蛋白用于结核病的诊断价值。方法以Ag85A和Ag85B为抗原,PPD为对照,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 325例肺结核病组,Ag85A、Ag85B和PPD检测的灵敏度分别为58.2%、62.2%和71.7%。健康献血组、非结核性呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用Ag85A、Ag85B和PPD检测,Ag85A特异性分别为94.3%、93.0%、73.7%。Ag85B特异性分别为96.4%、96.5%、85.3%。PPD特异性为93.6%、86.0%、67.9%。统计分析显示,Ag85B蛋白和PPD检测非结核性呼吸疾病组,其特异性有显著性差异（P〈0.05）。检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异（P〈0.05）。Ag85A和Ag85B同时检测325例肺结核病组血清可显著提高检测的阳性率。结论 Ag85B蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性,是ELISA的可靠抗原,与Ag85A联用可提高灵敏度,对结核病血清学诊断有较高参考价值。     

结核分支杆菌ESAT6蛋白的表达、纯化及抗原性研究

目的：获得重组ESAT6蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法：分别用生理盐水和卡介苗免疫小鼠8周后,以结核分支杆菌接种小鼠。应用基因工程技术表达、纯化ESAT6蛋白,分别以结核分支杆菌PPD或纯化的rESAT6蛋白为抗原,通过ELISA方法及结核病一步法检测小鼠或人血清中抗结核抗体。结果：重组质粒pET24b-ESAT6在大肠杆菌BL2（DE3）细胞内以包涵体形式存在,分子量约6kDa,每100ml培养菌可获得约18mg纯化的重组蛋白。生理盐水和卡介苗免疫小鼠血后血清中抗ESAT6抗体无区别。结论分支杆菌攻击后,两组小鼠血清中抗ESAT6抗体均明显升高,但只有卡介苗组小鼠抗体水平超过平均值＋2标准误。以33例正常人血清的OD值＋2S为正常界限值,33例正常人和32例结核病人血清一步法和PDD、rESAT6 ELISA检测抗结核抗体的特异性和敏感性分别为：一步法87.9%(29/33),65.6%(21/32),PPD93.9%(31/33),62.5%(20/32);rESAT6 97%(32/33),18.2%(4/32)。结论：pET24b-ESAT6大肠杆菌工程菌能以包涵形式高效表达重组ESAT6蛋白,卡介苗免疫对血清中ESAT6抗体无影响,结核病人血清中抗ESAT6抗体阳性率低,rESAT6纯化蛋白可作为结核病血清学诊断的混合抗原之一。     

结核分枝杆菌特异性蛋白片段Rv3388和6种特异抗原在结核抗体检测中的应用价值

目的 对结核分枝杆菌( MTB) PE家族的所有成员的结构进行分析,预测其抗原表位,截取Rv3388蛋白的优势抗原片段,对重组Rv3388蛋白及其它6种MTB特异性抗原进行评估,探讨不同结核特异性抗原与血清抗体的反应模式,评价血清学检测在结核病诊断中的价值. 方法 利用基因合成技术重叠延伸PCR扩增Rv3388蛋白637~731位的编码基因片段, 原核表达并纯化重组蛋白pET32a/Rv3388637-731 ,将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA法对该抗血清进行免疫原性分析. 同时对这7种MTB特异性蛋白的特异性及敏感性进行评价. 结果 重组蛋白pET32a/Rv3388637-731在大肠杆菌中的表达量占全菌蛋白的80%,ELISA显示有较强的免疫原性. 7 种 MTB特异性抗原具有不同的反应模式,单个抗原检测敏感性较差. 结论 对MTB PE家族的蛋白结构分析,表达并纯化重组蛋白pET32a/ Rv3388637-731 ,7种蛋白在血清抗体检测中具有抗原互补性,不同抗原与机体反应存在不同反应模式,提高结核抗体检测敏感性应多种抗原联合检测.     

重组融合蛋白CFP10-ESAT6在结核病血清学诊断中的初步应用

目的探讨结核分枝杆菌重组融合蛋白CFP 10-ESAT 6用于结核病血清学诊断的价值。方法分别用CFP 10-ESAT 6、ESAT 6和PPD检测220例确诊的结核病患者血清、30例非结核病呼吸系统疾病患者血清和50例健康人血清。结果rCFP 10-ESAT 6、rESAT 6和PPD检测的敏感性分别为45%、25%和57%;特异性分别为93%、95%和75%。rCFP 10-ESAT 6的敏感性高于rESAT 6,特异性高于PPD（P〈0.05）。结论rCFP 10-ESAT 6应用于结核病血清学诊断具有较好的敏感性和很高的特异性,对于结核病的诊断有很好的应用价值。     

结核分支杆菌MPT63抗原的表达及其血清学诊断价值的研究

目的：获得结核分支杆菌重组MPT63蛋白,研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值。寻找更有效的结核病诊断试剂,方法：应用基因工程技术表达,纯化MPT63蛋白,通过Western blotting和免疫双扩散试验春抗原性,通过斑点免疫试验,结明试验和结核病一步法检测血清中的抗结核抗体。结果：重组质粒pET24b-MPT63测序表明具有正确的编码序列,MPT63蛋白在大肠杆菌细胞内以可溶性蛋白的形式高效率表达,表达量占菌体总蛋白的40％左右,分子量的kDa,Western blotiing和免疫双扩散试验检测抗结核,抗体的阳性率分别为46．7％和50％,结核病一步法检测的阳性率为70％,结明试验的阳性率为80％,在34例正常血清中,MPT63和PPD斑点免疫试验检测抗结核抗体的阳性率分别为38．2％和35．3％,结论病一步法检测的阳性率也为23．5％,结论：pET24b-MPT63大杆菌工程菌能以可溶性蛋白的形式高效表达,重组的MPT63也许可作为结核病血清学诊断的一组抗原之一。     

肾结核免疫学诊断方法对比研究

目的：比较三种血清学诊断方法对肾结核诊断的效果。方法：采用免疫层析法和ELISA法检测血清中特异性抗体。结果：52例肾结核、105例健康人和126例肾脏病患者血清标本中，抗LAM抗体检测阳性率分别为59．6％，0％和0％；抗38ku和细胞质膜抗原抗体检测阳性率分别为82．7％、0．9％和2．4％；抗PPD抗体阳性率分别为76．9％、8．5％和11．1％。抗LAM和抗38ku抗体联合检测，肾结核患者阳性检出率达88．5％。结论：抗LAM和抗38ku抗体快速检测方法能够在半小时内对肾结核作出初步诊断和鉴别诊断。     

结核分枝杆菌38 kD重组蛋白的纯化及血清学诊断应用价值的研究

目的纯化获得结核分枝杆菌重组38kD蛋白，并评价其在血清学诊断方面的应用价值。方法应用亲和层析方法纯化结核分枝杆菌重组38kD蛋白，应用ELISA方法检测220例血清中的抗结核抗体。结果结核分枝杆菌重组38kD蛋白以包涵体形式表达，以48名正常人血清OD492＋2S为正常限值，57例PPD强阳性血清，47例菌阳结核病人血清和68例菌171结核病人血清阳性检出率分别为13．8％、97．87％和83．82％。结论结核分枝杆菌38kD重组蛋白以包涵体形式高效表达，具有较强的抗原特异性和免疫反应性。     

痰菌阳性肺结核211例PPD试验及血清抗结核抗体检查分析

目的:探讨PPD试验和血清抗结核抗体对结核病的诊断价值。方法:对经细菌学确诊的211例痰菌阳性肺结核同时做PPD试验和血清抗结核抗体检查。比较PPD不同直径阳性标准与血清抗结核抗体阳性对结核病的诊断。结果:以PPD直径≥10mm和PPD直径≥15mm为标准判断有意义阳性结果,灵敏度分别为78.2%和30.3%,漏诊率分别是21.8%和69.7%。血清抗结核抗体阳性率为82.9%,PPD结果阳性率为78.2%,经统计学处理无显著性差异,二者的阳性一致率为64%。结论:以PPD直径≥10mm为标准判断阳性结果有临床诊断价值,血清抗结核抗体检查在结核病的诊断中与PPD试验有同等重要价值,两者结合可提高临床诊断率。     

结核分枝杆菌蛋白Rv0315的克隆表达及其抗原性研究

目的评价结核分枝杆菌重组蛋白Rv0315在结核病血清学诊断中的价值。方法采用常规分子克隆方法获得重组Rv0315蛋白,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测84份确诊结核病人血清和48份健康人血清中相应的抗结核抗体水平,并与结核分泌蛋白ESAT-6的检测结果进行比较。结果成功构建了重组蛋白Rv0315,其在E.coli BL21plysS（DE3）中主要以可溶性形式表达,分子量（30.3kDa）与预期相符,ELISA血清学活性评估显示其特异性和敏感性分别为94.0%（45/48）和35.7%（30/84）。结论重组蛋白Rv0315有望成为新的结核病血清学诊断候选抗原。