骨髓细胞液氮长期冻存后间充质干细胞活力研究

目的研究骨髓细胞(BMC)液氮长期冻存后间充质干细胞(MSC)活力。方法从98人份经加低温保护剂、程控降温仪降温、液氮冻存23—25年的BMC中,取20人份复温,复温BMC体外行MSC初始和传代培养,传代细胞再行成骨和神经细胞诱导。检测培养全过程细胞的形态、增殖数量、细胞化学、免疫组化染色和抗原表达,计贴壁细胞回收率、相对增殖率和MSC相对回收率。结果 BMC冻存细胞,初始培养d10时旋涡状生长,d14时成纤维样细胞为(88.2±4.3)%;P1—P5传代培养时,d7旋涡状生长,传至P5时细胞扩增>60倍;P3时,成纤维样细胞为(94.7±3.6)%,细胞高表达CD29、CD90、CD44、CD71、CD73、CD105、CD166和HLA-A/B/C,低表达CD34、CD45和HLA-DR。P3细胞成骨诱导后ALP和茜素红染色强阳性,细胞内ALP含量明显增高;P3细胞神经细胞诱导后神经元烯醇化酶和巢蛋白染色阳性。细胞增殖和周期未发生改变。贴壁细胞回收率、相对增殖率和MSC相对回收率的结果分别为(52.1±5.6)%、(98.1±1.1)%和(48.5±8.6)%。结论用传统降温、液氮冻存骨髓细胞,至少在23—25年时,细胞内MSC性质不变、活力良好,达到了长期冻存的目的 。     

低温-80℃长期保存单采血小板的功能研究

目的 :为明确长期冰冻保存的单采血小板的功能 ,并对冰冻单采血小板的保存时间进行初步探讨。方法 :对冰冻保存前后的单采血小板进行回收率、粘附率、聚集强度和Ⅲ因子活性进行检测。结果 :冰冻保存后的回收率为 83 8%± 8 3 % ,粘附率为 5 9 0 %± 9 2 % ,聚集强度为 66 1%± 13 2 % ,Ⅲ因子活性为 ( 18± 3 )s。结论 :冰冻保存后的单采血小板仍具有较好的功能活性     

造血干细胞体外保存的研究现状及进展

造血干细胞是指具有自我复制并分化为成熟血细胞与免疫活性细胞能力的细胞 ,由于造血干细胞可从骨髓、外周血、脐血、胎肝获得 ,因此临床上出现了骨髓移植 (bonemarrow transplantation,BMT)、外周血造血干细胞移植(peripheral blood stem cell transplantation,PBSCT)、脐血干细胞 (cord blood stem cell transplantation CBSCT)及胎肝移植。近年来 ,PBSCT及 CBSCT由于比 BMT更简便、安全 ,其造血功能及免疫重建快、采集简单、抗移植物宿主病发病率低 ,在国内外得到快速发展 ,已成为治疗恶性血液病及多种实体瘤的有效方法。如何…     

-80℃保存机采浓缩血小板的研究

目的:探讨–80℃冰冻保存机采浓缩血小板的功能及止血效果。方法:随机抽取冰冻保存3个月之内、3～6个月之间、6～9个月之间的冰冻血小板样品于42℃解冻后进行相关实验,比较不同保存时期冰冻血小板的功能及回收率;分血液病组和非血液病组观察患者输注冰冻血小板24h后出血症状的控制及校正血小板增高指数CCI值。结果:冻存3个月内、3～6个月的两组冰冻血小板的黏附功能、聚集功能与新鲜机采血小板相比差异均无显著性(P>0.05),而冻存6～9个月的冰冻血小板的黏附功能与新鲜机采血小板相比则差异有高度显著性(P<0.01)。3组冰冻血小板的第Ⅲ因子活性测定与新鲜血小板相比,均在正常范围,平均回收率为85.2%。两组患者在输注冰冻血小板24h后能有效控制出血症状的比率平均为93.3%;而CCI值≥10000/μL的比率,非血液病组显著高于血液病组。结论:5%二甲基亚砜-80℃冰冻保存半年以内的机采浓缩血小板具有良好的止血功能。     

-80℃保存机采浓缩血小板的研究

目的：探讨-80℃冰冻保存机采浓缩血小板的功能及止血效果。方法：随机抽取冰冻保存3个月之内、3～6个月之间、6～9个月之间的冰冻血小板样品于42℃解冻后进行相关实验，比较不同保存时期冰冻血小板的功能及回收率；分血液病组和非血液病组观察患者输注冰冻血小板24h后出血症状的控制及校正血小板增高指数CCI值。结果：冻存3个月内、3～6个月的两组冰冻血小板的黏附功能、聚集功能与新鲜机采血小板相比差异均无显著性（P〉0．05），而冻存6～9个月的冰冻血小板的黏附功能与新鲜机采血小板相比则差异有高度显著性（P〈0．01）。3组冰冻血小板的第Ⅲ因子活性测定与新鲜血小板相比。均在正常范围，平均回收率为85．2％。两组患者在输注冰冻血小板24h后能有效控制出血症状的比率平均为93、3％；而CCI值≥10000／μL的比率，非血液病组显著高于血液病组。结论：5％二甲基亚砜-80℃冰冻保存半年以内的机采浓缩血小板具有良好的止血功能     

超低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存造血干细胞的比较

背景：在造血干细胞整个冷冻保存过程中,受到降温速率、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素影响,各国学者在提倡选择何种保存方法上面存在不同的主张。目的：比较-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存外周造血干细胞的效果。方法：将采集的造血干细胞分两组,第一组细胞浓度为1×1011L-1,加入10%二甲基亚砜,放入程序冷冻仪内程序设置为室温至-4℃按1℃/min的速率降温,按35℃/min快速降至-45℃,再以15℃/min升至-21℃,然后以5℃/min降至-90℃,取出冷冻管置-196℃液氮罐内。第二组细胞浓度为1×1011L-1,加入5%二甲基亚砜、3%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白,将冷冻管置-80℃冰箱过夜后取出,置-196℃液氮罐内的气相,再过夜后置液氮罐液相内。结果与结论：两组冷冻方法保存细胞的锥虫蓝拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差异无显著性意义（P〉0.05）。结果显示用5%二甲基亚砜、4%白蛋白、3%羟乙基淀粉组成的冷冻保护剂,通过-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞与传统10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂用程序降温的方法取得一样效果,操作简便易于临床应用。     

超低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存造血干细胞的比较

背景:在造血干细胞整个冷冻保存过程中,受到降温速率、储存温度深浅、冷冻保护剂组合等因素影响,各国学者在提倡选择何种保存方法上面存在不同的主张。目的:比较-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法与传统程序降温法保存外周造血干细胞的效果。方法:将采集的造血干细胞分两组,第一组细胞浓度为1×1011L-1,加入10%二甲基亚砜,放入程序冷冻仪内程序设置为室温至-4℃按1℃/min的速率降温,按35℃/min快速降至-45℃,再以15℃/min升至-21℃,然后以5℃/min降至-90℃,取出冷冻管置-196℃液氮罐内。第二组细胞浓度为1×1011L-1,加入5%二甲基亚砜、3%羟乙基淀粉、4%人血白蛋白,将冷冻管置-80℃冰箱过夜后取出,置-196℃液氮罐内的气相,再过夜后置液氮罐液相内。结果与结论:两组冷冻方法保存细胞的锥虫蓝拒染率、回收率、凋亡率和死亡率差异无显著性意义(P>0.05)。结果显示用5%二甲基亚砜、4%白蛋白、3%羟乙基淀粉组成的冷冻保护剂,通过-80℃低温冰箱转液氮阶梯降温法冷冻保存造血干细胞与传统10%二甲基亚砜作为冷冻保护剂用程序降温的方法取得一样效果,操作简便易于临床应用。     

血小板保存的研究进展

血小板体外保存的质量,是血液服务机构亟待解决的问题之一.目前供应临床的主要是常温[(22±2)℃]连续振荡液态保存的血小板,然而这种血小板保存时间<5 d,并且22℃常温振荡储存易使血小板受细菌污染,输入人体后可能会造成机体败血症的发生~([1]).     

骨髓细胞来源的树突状细胞体外刺激T淋巴细胞增殖的研究

分离骨髓单核细胞,在一定的培养条件下将其诱导成树突状细胞,通过混合淋巴细胞反应检测这些树突状细胞的体外刺激T淋巴细胞增殖的能力.     

人骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞

骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)是一群存在于骨髓腔内的能向骨、软骨、脂肪、肌肉和基质细胞等分化的细胞。最近的骨髓移植动物模型研究显示 ,在体内骨髓细胞具有形成神经元的能力[1 ,2 ] 。与造血细胞相同 ,骨髓中的间充质干细胞也具有可移植性[3] 。因此 ,骨髓移植后形成神经元的细胞可能来源于间充质干细胞。为验证此推测 ,我们进行了如下实验。材料与方法肝素抗凝骨髓取材于异基因骨髓移植过程中正常献髓者。间充质干细胞分离、纯化和体外培养按我们以前报道的方法进行[4] 。形成致密贴壁层的间充质干细胞用 0 .0 5 %…     

T淋巴细胞对人骨髓造血细胞体外扩增的负调节作用

采用抗CD3或抗CD8单克隆抗体的补体细胞毒方法体外清除人骨髓MNC(单个核细胞)中的T淋巴细胞和用流式细胞技术(FACS)分析细胞表面标志,观察人骨髓T淋巴细胞对造血细胞增殖的负调节效应.将MNC加入含多种造血生长因子的培养基进行液态扩增并检测其CD34+细胞绝对数、粒-巨噬集落(CFU-GM)和多向祖细胞集落(CFU-GEMM)形成能力.结果表明,抗CD3,抗CD8或抗CD3+抗CD8单抗清除T淋巴细胞的骨髓MNC,其细胞总数经造血生长因子刺激培养20天分别扩增了75.8,79.6和77.4倍,明显高于对照组(67.0倍).体外培养6天时CD8清除组CD34+细胞的扩增最高可提高17.82%.上述3个清除组的CFU-GM产率分别为173.67±18.90,165.33±26.58和170.33±21.50,对照组79.67±8.33.这3个清除组与对照组比较差异显著(P＜0.05).上述3个清除组的CFU-GEMM产率分别为431.33±34.56,370.33±42.10和386.67±10.02,对照组为177.67±26.86.这3个清除组与对照组比较P值分别为＜0.002,＜0.05和＜0.005.此研究结果提示骨髓中T淋巴细胞可以抑制造血细胞的体外扩增、CFU-GM和CFU-GEMM产率,其作用机制有待进一步探讨.     

人胎盘无细胞是悬液对骨髓造血干／祖细胞的体外扩增作用

为了探讨人胎盘无细胞悬液对骨髓造血干／祖细胞的体外扩增作用及与已知的几种细胞因子进行比较,用人胎盘无细胞悬液及ＩＬ－３,ＧＭ－ＣＳＦ,ＩＬ－３＋ＩＬ－６＋ＧＭ－ＣＳＦ＋ＦＰＯ作为刺激因子,并应用甲基纤维素半固体培养体 对骨髓ＧＭ－ＣＦＵ,ＧＭ－ＧＥＭＭ和ＢＦＵ－Ｅ进行了培养和比较,研究结果表明,人胎盘无细胞悬液对骨髓ＣＦＵ－ＧＭ,ＣＦＵ－ＧＥＭＭ和ＢＦＵ－Ｅ体外扩增最适蛋白浓度是２００－３００μｇ／Ｌ,人胎盘无细胞悬液作刺激因子对骨髓血干／祖细胞的体外扩增效果优于单独ＩＬ－３,单独ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－３＋ＩＬ－６＋ＧＭ－ＣＳＦ＋ＥＰＯ组。结论提示,人胎盘无细胞悬液可能含有多种细胞因子,用人胎盘无细胞悬液作扩增剂体外扩增骨髓造血干／祖细胞细胸具有有效而价廉的特点。     

全骨髓贴壁法培养人骨髓间充质干细胞的改良研究

本研究旨在利用红细胞自然沉降性原理,以传统的全骨髓贴壁法为基础,探讨一种改良后简便而高效的人骨髓间充质干细胞培养方法。采用6孔板培养细胞,将骨髓标本用MSC完全培养液培养48h,吸取上层无红细胞的上清层,置于新的培养孔以分离获取MSC。用倒置显微镜观察细胞形态及贴壁情况,记录细胞首次贴壁时间、首次传代时间。并以传统全骨髓贴壁法为对照;应用流式细胞术检测细胞周期、细胞表面标记;用油红0及碱性磷酸酶试剂盒分别对MSC成脂、成骨能力进行鉴定;应用计数板计数法描绘第1代,第3代,第5代MSC增殖曲线。结果表明,用改良法培养的MSC高表达CD90、CD105、CD13、CD44,低表达CD14、CD45、CD34;细胞周期中G0／G1期88．76％,G2／M期3．04％,S期8．2％,符合干细胞周期特征;增殖曲线呈典型”S”型;油红O与碱性磷酸酶染色均为阳性。同时与传统方法相比,改良方法的细胞贴壁率显著高于传统方法（P=0．0004）,首次贴壁时间短（P〈0．0001）、首次传代时间短（P=0．001）。结论：骨髓标本培养48h后的上清层中含大量贴壁活性的悬浮MSC,改良方法是一种比传统贴壁法更具有便捷、高效等优点的培养方法。     

5-氮杂胞嘧啶诱导人骨髓基质干细胞心肌分化

目的：研究5-氮杂胞嘧啶(5-aza)诱导人骨髓基质干细胞(hMSC)心肌分化过程中心肌特异转录因子和心肌特异基因的表达变化。方法：取传至第8代hMSC,以3μmol/L的5-aza孵育细胞24h，分别在诱导后3d、1周、2周和3周4个时间点提取细胞RNA。以RT-PCR方法检测4细胞心肌特异转录因子Nkx2.5和心肌特异基因(connexin43、ANP等)的表达。结果：hMSC经5-aza诱导后，形成肌节样结构。RT-PCR的结果显示，5-aza可诱导心肌特异基因connexin43和ANP的表达，随诱导时间延长，connexin43和ANP的表达量逐渐增加。5-aza还能诱导hMSC表达心肌特异转录因子Nkx2.5，并持续表达至3周。结论：5-aza在体外可诱导hMSC向心肌细胞分化，5-aza可能通过诱导心肌特异转录因子的表达而启动hMSC心肌化的过程。     

冷冻保存对骨髓单个核细胞IL-1和IL-6分泌的影响

探讨了冷冻保存对骨髓单个核细胞分泌IL-1和IL-6的影响。冻存后细胞经有丝分裂原(LPS)刺激后培养上清中的IL-1和IL-6的含量均显著高于新鲜细胞。细胞表面IL-1和IL-6抗体平均荧光强度表达冻后细胞明显高于新鲜细胞。实验结果提示冷冻对抑制性单核细胞的灭活促进了细胞IL-1和IL-6的分泌。冻后细胞的这一状态有利于机体免疫功能的重建。     

人骨髓间充质干细胞支持体外造血

体内的稳态造血依赖于复杂而完整的骨髓造血微环境系统,其中的细胞成分是该系统的关键。存在于骨髓中的间充质干细胞（ＭＳＣｓ）是成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种骨髓基质细胞的前体细胞,在造血调控中可能具有一定的作用。本研究首先建立了成人骨髓ＭＳＣｓ的分离及体外培养的方法,并应用长期骨髓细胞培养体系,观察了ＭＳＣｓ滋养层体外维持长期培养启动细胞（ＬＴＣ－ＩＣ）的能力及其促进造血细胞分化的功能     

甲基纤维素体外分离骨髓移植物中红细胞的效果

“ABO”血型不合的骨髓移植和一部分自体骨髓移植 ,需分离骨髓移植物中的红细胞。本研究观察了用甲基纤维素分离移植物中红细胞的效果。用生理盐水配制的 0 .5 %甲基纤维素 (MC)与采集的骨髓移植物按一定比例混匀 ,静置 ,然后沉降红细胞。对 1 8份骨髓移植物分离的结果显示 ,单个核细胞和CD34+ 细胞回收率分别达(83 .8± 5 .2 ) %和 (90 .3± 7.2 ) % ,CFU GM产率为 (60 .8± 2 2 .4) / 2× 1 0 5个单个核细胞 ;红细胞残留率仅为 (4.3±1 5) %。结论 :此方法可用于骨髓移植     

ECSOD体外转染恒河猴骨髓间充质干细胞的实验研究

本研究旨在探讨载带超氧化物歧化酶基因的腺病毒（AD-ECSOD）感染恒河猴骨髓间充质干细胞（R-BMMSC）生物学特性的影响。用含有ECSOD和报告基因EGFP的腺病毒感染经梯度密度离心和贴壁培养法分离、培养并纯化的R-BMMSC,用倒置荧光显微镜及流式细胞仪观察检测感染效率,ELISA法检测细胞培养上清中的ECSOD蛋白表达水平;流式细胞仪检测感染后R-BMMSC的表面抗原（CD34,CD29,CD45,CD90,mA-DR）;油红0和茜素红染色观察R-BMMSC的成骨及成脂诱导分化能力;MTT法检测AD-ECSOD转染对R-BMMSC增殖能力的影响。结果表明,不同滴度AD-ECSOD（感染滴度为每个细胞500,1000,1500和2000pfu）对R-BMMSC的感染效率均〉95％。转染后24h即可在细胞上清液中检测到ECSOD蛋白表达,且明显高于对照组（P〈0．01）,转染后48h蛋白表达量最高。AD-ECSOD转染后R-BMMSC的增殖能力及其表面抗原表达和多向分化能力与未转染组比较无统计荤差异fP〉0．05、．结论：AD-ECSOD能够高效转染R-BMMSC．对萁生物荤特性无明显影响．     

胎儿骨髓基质细胞协同外源性细胞因子对脐带血CD34^＋细胞的体外扩增作用

SCF和FL可促进造血干 祖细胞的增殖 ,是强有力的共刺激因子 ,而骨髓基质细胞所产生的c kit及Flk 2水平很低 ,因此基质细胞培养结合含有SCF或FL的细胞因子组合可提高造血干 祖细胞的扩增效率[1 ] 。SCF IL 3 IL 6 G CSF EPO和SCF IL 3 IL 6 FL EPO二种组合可高效扩增造血干 祖细胞[2 ] ,因此我们拟以上述二种细胞因子组合结合胎儿骨髓基质细胞培养以观察对脐带血CD3 4 细胞的体外扩增作用。材料与方法脐带血样品采自本院妇产科 ,胎儿骨髓采自 5 - 6月水囊引产的健康胎儿的四肢骨。胎儿骨髓基质细胞贴壁层的建立采用…