甲型副伤寒杆菌nmpC基因原核表达及表达产物免疫保护作用

目的 构建甲型副伤寒杆菌外膜蛋白基因nmpC的原核表达系统,确定其重组表达产物rNmpC免疫原性和保护作用,了解甲型副伤寒杆菌临床菌株nmpC基因携带及表达率.方法 采用PCR和T-A克隆法从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中获得nmpC基因克隆并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rNmpC表达情况及其产量,采用免疫扩散法、Western blot和微量肥达试验鉴定其抗原性和免疫应答性.采用PCR和ELISA分别检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株nmpC基因携带及表达率.采用小鼠感染模型了解rNmpC对甲型副伤寒杆菌致死性感染的免疫保护作用.结果 与报道的相关序列比较,所克隆的nmpC基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rNmpC表达量约为细菌总蛋白的30%.rNmpC免疫家兔可产生抗体并能与甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生阳性Western杂交信号.所有甲型副伤寒杆菌菌株均携带nmpC基因并表达NmpC蛋白,但伤寒杆菌、乙型及丙型副伤寒杆菌未检出nmpC基因.100μg和200μgrNmpC对感染小鼠的免疫保护率分别为41.7%(5/12)和66.7%(8/12).rNmpC免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清仅对甲型副伤寒杆菌H抗原产生1∶5～1∶40的凝集效价.结论 NmpC是甲型副伤寒杆菌独有的序列保守、分布广泛且自然表达的外膜蛋白抗原,该外膜蛋白具有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可作为多价甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原.     

甲型副伤寒杆菌ompA基因分布及重组表达产物的免疫学鉴定

目的 构建甲型副伤寒杆菌ompA基因原核表达系统,确定其重组表达产物rOmpA免疫原性和保护作用,检测甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.方法 采用PCR从甲型副伤寒杆菌临床株JH01中扩增ompA基因,T-A克隆后测序并构建ompA基因原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rOmpA表达情况及其产量,采用免疫扩散法、微量肥达试验和Western blot鉴定其抗原性和免疫反应性.采用PCR检测98株甲型副伤寒杆菌临床菌株ompA基因携带率.采用小鼠感染模型,了解rOmpA对甲型副伤寒杆菌50001株感染的免疫保护作用.结果 与报道的相关序列比较,所克隆的ompA基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%.rOmpA表达量约为细菌总蛋白的65%.rOmpA能与其兔抗血清和甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生免疫反应(Western blot),并可在家兔中诱导产生抗体.94.9%(93/98)甲型副伤寒杆菌临床菌株含有ompA基因.100 μg和200 μg rOmpA对感染小鼠的免疫保护率分别为41.7%(5/12)和58.3%(7/12).rOmpA免疫小鼠或保护试验存活小鼠血清对各副伤寒杆菌H抗原的凝集效价为1:5～1:40.结论 ompA基因在甲型副伤寒杆菌临床菌株中分布广泛.rOmpA有良好的免疫原性和一定的免疫保护作用,可考虑为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原.     

甲型副伤寒沙门菌spaO-ompA融合基因构建及其表达产物免疫保护作用

目的 构建甲型副伤寒沙门菌spaO-ompA融合基因及其原核表达系统,确定重组表达产物rSpaO-OmpA免疫保护作用.方法 采用柔性肽序列连接spaO与ompA基因,构建spaO-ompA人工融合基因及其原核表达系统.采用SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组表达产物rSpaO-OmpA表达情况及其产量.采用免疫扩散法、微量肥达和Western blot法鉴定rSpaO-OmpA 抗原性和免疫反应性.采用小鼠感染模型了解rSpaO-OmpA对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的免疫保护作用,实验中采用重组表达的SpaO( rSpaO)及OmpA(rOmpA)作为对照.结果 所构建的spaO-ompA融合基因与spaO或ompA单基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100％.所构建的原核表达系统E.coli BL21 DE3pET42a-spaO-ompA能高效表达重组融合蛋白rSpaO-OmpA.rSpaO-OmpA能与甲型副伤寒沙门菌全菌抗血清结合并产生阳性杂交信号,免疫家兔后可产生特异性抗体.100 μg或200 μgrSpaO-OmpA对甲型副伤寒沙门菌感染小鼠的免疫保护率分别为66.7％ (8/12)和83.3％ (10/12),明显高于等量rSpaO及rOmpA( P＜0.05).rSpaO-OmpA免疫小鼠血清与不同副伤寒沙门菌H抗原的凝集效价为1∶5 ～ 1∶40、与rSpaO和rOmpA及rSpaO-OmpA免疫双扩散效价为1∶1 ～1∶16.结论 人工融合重组抗原rSpaO-OmpA免疫原性和免疫保护作用较等量rSpaO或rOmpA更强.     

人组蛋白H1基因的原核表达、纯化及其活性检测

目的:克隆人组蛋白H1全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化以及活性检测.方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人组蛋白H1全长编码区基因,将其克隆到pGEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达与纯化产物.结果:从人乳腺文库中扩增获得约650 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出相对分子质量(Mr)约为52 000的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H1,激酶实验证明该蛋白活性良好.结论:成功获得了活性良好的重组蛋白GST-H1,为后续研究细胞周期蛋白调控奠定了实验基础.     

幽门螺杆菌napA基因原核表达系统构建及其表达产物的免疫性和致炎作用

目的　构建幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)napA基因的原核表达系统 ,了解表达产物rNAPA免疫性和致炎作用。方法　采用PCR从Hp临床菌株Y0 6株DNA中扩增napA全长基因片段 ,T A克隆后测序 ,构建napA基因原核表达系统pET32a napA E .coliBL2 1DE3。采用SDS PAGE估计不同浓度IPTG诱导下rNAPA表达产量 ,Ni NTA亲和层析收集rNAPA。采用Westernblot和免疫扩散试验鉴定rNAPA的免疫性。采用ELISA分别检测 1 0 9株Hp临床菌株NAP(neutrophil activatingprotein)表达、1 2 5例Hp感染者血清中NAP抗体和rNAPA诱导人脐静脉内皮EVC 30 4细胞分泌IL 1、IL 8、TNF α和ICAM 1的作用。结果　所克隆的napA基因与报道的相应核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 94 .8%和 96 .9%。所构建的napA基因原核表达系统rNAPA表达量高达细菌总蛋白的 5 0 %以上。Hp全菌抗体商品 (DAKO)能识别rNAPA并与之结合 ,rNAPA兔抗血清的免疫扩散试验效价为 1∶8。 95 .4 %Hp临床菌株 (1 0 4 1 0 9)表达NAP ,92 .8%Hp感染者 (1 1 6 1 2 5 )血清中存在rNAPA抗体。 1～1 0 μg的rNAPA均可诱导人脐静脉内皮细胞株EVC 30 4IL 1、IL 8、TNF α和ICAM 1的分泌明显增加 (P<0 .0 5～ 0 .0 1 )。结论　成功地从Hp临床菌株Y0 6中构建了napA基因高     

EGFRvIII/PEP-3 cDNA与HBcAg重组基因原核表达载体的构建、表达与免疫分析

目的:构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒,进行原核表达、纯化,观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法:通过双酶切从pGEM-TEasy/PEP-3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段,插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/c-PEP-3-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a( )中,通过IPTG诱导蛋白表达,利用Ni2 -NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化;用融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、序列测定证实融合基因已插入pET28a( )载体中,融合基因序列与设计序列完全一致。原核表达后表达量占沉淀全菌蛋白的56%,纯化产物占总蛋白的92%,浓度约8g/L。BALB/c小鼠经4次免疫后,其血清中中和抗体的滴度可达1∶16000,第6次免疫后血清中中和抗体的滴度达到1∶2.56×105,抗PEP-3抗体滴度达到1∶1.28×105,抗HBcAg抗体滴度小于1∶4×103。结论:融合基因PEP-3-HBcAg在大肠杆菌中可获得高效表达,表达的融合蛋白可以诱导小鼠产生高滴度和高特异性中和抗体,从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。     

甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏首例甲型H1N1流感病毒毒株(A/Nan jing/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。West-ern blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功克隆NS1全长基因,并构建了其真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料。     

CAD基因原核表达载体的构建及表达产物的活性鉴定

目的构建pCool—GST—ICAD／CAD的表达载体，并存大肠杆菌BL21（DE3）中表达具有生物学活性的CAD核酸酶？方法用PCR扩增CAD基因，将扩增产物克隆入pCool—GST—ICAD载体中构建出pCool—GST—ICAD／CAD表达载体。经酶切和电泳鉴定正确后，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达，表达产物经亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤等方法分离纯化。最后用SDS—PAGE和DNA降解实验进行鉴定。结果构建了pCool—GST—ICAD／CAD原核表达载体，重组载体转化后表达出毫克级水平的GST—ICAD／CAD蛋白复合体。经分离纯化后得到纯度很好的CAD—ICAD篮白复合体，在SDS—PAGE电泳上旱现清晰的两条蛋白带。经DNA降解实验证明纯化所得的CAD蛋白具有非特异性降解DNA的核酸酶作用。结论成功制备了具有生物学活性的CAD核酸酶，为进一步研究细胞凋亡的作用机制提供了有效的制剂。     

人T-bet基因的表达、纯化及其免疫原性分析

目的：利用载体pQE30在大肠埃希菌（M15）原核表达人T-bet基因全长序列，并对表达产物进行纯化、免疫动物和制备多克隆抗体。方法：利用PCR技术从克隆载体pGEM-T／T-bet获得人T-bet的全长编码序列，并将其亚克隆至原核表达载体pQE30，形成重组表达质粒pT-bet；酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌JM109，测序鉴定后转化M15，经IPTG370C诱导4h后，SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色判断以包涵体形式存在的带有6×His标签的融合蛋白（表达产物），用Ni^2＋ -IMAC层析柱对融合蛋白进行纯化；将纯化的蛋白免疫BALB／c小鼠，制备人T-bet的多克隆抗体。结果：成功表达和纯化了人T-bet，并制备了多克隆抗体，ELISA和Western blot结果显示了血清抗体的高效价（1：100000）和高度特异性。结论：成功构建了原核表达载体pT-bet，并在工程菌M15中获得大量表达，经纯化后获得高纯度的人T-bet蛋白，制备了效价和特异性良好的多克隆抗体，为进一步研究T-bet的生物学功能奠定了的基础。     

CAD基因原核表达载体的构建及表达产物的活性鉴定

目的 构建pCool-GST-ICAD/CAD的表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达具有生物学活性的CAD核酸酶.方法 用PCR扩增CAD基因, 将扩增产物克隆入pCool-GST-ICAD载体中构建出pCool-GST-ICAD/CAD表达载体.经酶切和电泳鉴定正确后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤等方法分离纯化,最后用SDS-PAGE和DNA降解实验进行鉴定.结果 构建了pCool-GST-ICAD/CAD原核表达载体,重组载体转化后表达出毫克级水平的GST-ICAD/CAD蛋白复合体.经分离纯化后得到纯度很好的CAD-ICAD蛋白复合体,在SDS-PAGE电泳上呈现清晰的两条蛋白带.经DNA降解实验证明纯化所得的CAD蛋白具有非特异性降解DNA的核酸酶作用.结论 成功制备了具有生物学活性的CAD核酸酶,为进一步研究细胞凋亡的作用机制提供了有效的制剂.     

葡萄球菌肠毒素A基因原核表达系统的构建及其表达产物的鉴定

 目的：构建葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因原核表达系统，了解重组表达产物rSEA促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法：采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增全长SEA基因片段，T-A克隆后测序，构建SEA基因原核表达系统pET32a-SEA-E.coliBL21DE3。采用SDS-PAGE检测rSEA表达量，Ni-NTA亲和层析法提纯rSEA。采用TCID₅₀法测定rSEA对Vero细胞的细胞毒性并计算TCIC₅₀值。采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEA体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用以及对HepG2细胞（人肝癌细胞）、HeLa细胞（人宫颈癌上皮细胞）的生长抑制作用。结果: 与公布的相关序列比较，所克隆的SEA基因核苷酸序列相似性为100%。rSEA表达量约为细菌总蛋白的25%。rSEA对Vero细胞的TCIC₅₀为3.14 μg。1.0-20.0 mg/L的rSEA对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用（P<0.05）。5.0-20.0 mg/L rSEA作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长（P<0.05）。结论:成功地构建了rSEA原核表达系统。rSEA仍然具有生物学活性。所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法，为以后减毒rSEA突变体的筛选奠定了基础。     

抗甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原单克隆抗体的研制及初步应用

本文采用杂交瘤技术,制备了７ 株抗甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原单克隆抗体（ｍ Ａｂ） 的杂交瘤细胞株。对３ 株ｍＡｂ（２Ｃ８、２Ｅ６ 和５Ｄ７） 进行了鉴定,ｍＡｂ ２Ｃ８ 和５Ｄ７ 为ＩｇＭ,２Ｅ６ 为ＩｇＧ１（κ）亚类,可分别识别不同的抗原表位,均具有很强的特异性,即只与甲型副伤寒沙门氏菌及其鞭毛抗原起反应,而与相关肠道细菌：尼亚里木沙门氏菌、达卡沙门氏菌及伤寒沙门氏菌、乙型和丙型副伤寒杆菌、猪霍乱沙门氏菌、纽波特沙门氏菌等均无交叉反应。免疫印迹显示,３ 株ｍＡｂ 只能与甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原Ｍｒ 为５２ ０００ 的蛋白结合。用ｍＡｂ ２Ｅ６ 和５Ｄ７ 建立的双ｍＡｂ 夹心ＥＬＩＳＡ 法,检测了１３ 例血培养阳性的副伤寒患者血清中的甲型副伤寒沙门氏菌鞭毛抗原,１２ 例呈阳性,阳性符合率为９２－３％ 。     

甲型副伤寒沙门氏菌ompW基因功能的初步研究

目的 利用λRed重组系统敲除甲型副伤寒沙门氏菌ompW基因构建突变株,并且制备相应的回复株,进而初步研究该基因的功能.方法 PCR扩增得到上、下游同源臂,与卡那霉素抗性基因片段共同构建打靶片段,将其浓缩后转化含λRed重组系统的甲型副伤寒沙门氏菌(50973株),经PCR鉴定后得到突变株;将重组酶表达质粒pACU184与ompW基因的调控区和编码区序列连接后电转入突变株中,双酶切鉴定得到相应的回复株;SDS-PAGE及Western blot鉴定野生株、突变株与回复株中OmpW蛋白的表达情况;生化鉴定野生株、突变株与回复株,并观察野生株与突变株生长曲线的差异;测定野生株、突变株与回复株活菌半数致死量( LD50),以此来观察ompW基因与细菌毒力的相关性.结果 在甲型副伤寒沙门氏菌50973株中成功敲除了ompW基因,并构建了相应回复株;野生株与回复株均可表达出OmpW蛋白,突变株没有出现该蛋白的表达;野生株、突变株与回复株生化鉴定结果均为甲型副伤寒沙门氏菌,且野生株和突变株生长无明显差异;三者LD50均不存在显著差异.结论 甲型副伤寒沙门氏菌的ompW基因与该菌致病毒力无相关性,但突变株的构建为后续研究该基因具体功能提供了基础.     

人源His-talin1原核表达载体的构建及其蛋白表达

目的克隆人源talin1 cDNA,构建其高效原核表达载体,并纯化得到高纯度His-talin1融合蛋白。方法 PCR法扩增talin1基因并连接到原核表达载体pET32a(+),筛选和测序鉴定阳性克隆。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经过IPTG诱导表达和亲和层析分离纯化表达产物,对纯化的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果成功扩增了2.4kb的talin1基因,构建了pET32a(+)-talin1重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达出His-talin1融合蛋白。经SDS-PAGE和Western blot方法 ,验证了高纯度纯化的融合蛋白。结论建立了高效稳定的His-talin1表达体系,为进一步研究Talin1蛋白的结构及其与P-selectin之间的关系打下基础。     

甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白的分离、纯化和鉴定

目的提纯甲型副伤寒沙门菌鞭毛蛋白并鉴定。方法选用甲型副伤寒沙门菌,经自制的液体培养基扩大培养后,酸裂解法初步分离出鞭毛蛋白,用AKTAExplorer蛋白纯化系统除盐,弱阴离子交换层析纯化。纯化的蛋白用SDS-PAGE、Westernblot和磷钨酸负染扫描电子显微镜(scanningelectronmicrocopy,SEM)观察并摄片鉴定。考马斯亮蓝法测定所获得鞭毛蛋白的产量。结果SDS-PAGE提示纯化的鞭毛蛋白为一条相对分子质量(Mr)为52×103蛋白带;免疫印迹试验亦提示条带在Mr52×103处;SEM观察发现该鞭毛蛋白呈丝状;三者均证实该蛋白为同一均质蛋白。蛋白定量测得每克湿重的细菌可提取(4.8±0.5)mg鞭毛蛋白。结论经酸裂解法可获得高产量的鞭毛蛋白,且易于纯化和鉴定。     

MAGE-1与结核杆菌HSP70融合基因的构建及原核表达

目的 构建结核杆菌HSP70与肿瘤抗原MAGE-1的融合基因，在大肠杆菌中进行表达，并通过GST纯化系统进行分离纯化。方法 利用PCR方法扩增TBHSP70基因，经测序后连入原核表达载体pGEX-4T-1，再通过PCR方法扩增MAGE-1基因片段(289～927bp)，测序后插入TBHSP70基因的5’端，构建MAGE-1与TBHSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX-MAGE-1-TBHSP70，含有该质粒的大肠杆菌DH5a进行诱导表达和分离纯化。结果 成功地扩增了TBHSP70基因与MAGE-1基因片段，测序结果表明与GenBank公布的序列一致；成功地构建了pGEX-MAGE-1-TBHSP70原核表达质粒，含有该质粒的大肠杆菌DH5α经IPTG诱导后表达一Mt约为125000的蛋白，经GST融合蛋白表达系统纯化，得到了MAGE-1与TBHSP70的融合蛋白。结论 成功地获得了MAGE-1与TBHSP70的融合蛋白，为研究MAGE-1-TBHSP70融合蛋白在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础。