siRNA沉默CXCR4基因对胃癌生物学行为的影响

背景:CXCR4在肿瘤细胞中广泛表达,参与肿瘤侵袭和转移。RNA干扰技术可有效降低或关闭基因的表达,从不同水平阻断肿瘤侵袭和转移。目的:研究胃癌组织中CXCR4 mRNA和蛋白表达及其与临床病理特征的关系,并探讨siRNA沉默CXCR4表达对胃癌生物学行为的影响。方法:选取86例胃癌及其癌旁正常黏膜组织,应用RTPCR和蛋白质印迹法分别检测CXCR4 mRNA和蛋白表达,并分析其与临床病理特征的关系。构建CXCR4干扰RNA质粒载体,并转染胃癌MKN45细胞。应用MTT法、Transwell法、流式细胞术分别评估胃癌细胞增殖、迁移和侵袭、凋亡能力。结果:胃癌组织中CXCR4 mRNA和蛋白表达明显高于癌旁正常组织(P 0. 05),且其表达与TNM分期、肿瘤分化、淋巴结转移相关(P 0. 05)。与阴性对照组相比,siRNA转染组转染24、48、72 h后MKN45细胞增殖力均显著降低(P 0. 05),迁移率和侵袭率均显著降低(P 0. 05),细胞凋亡率显著升高(P 0. 05)。结论:CXCR4在胃癌发展过程中具有重要作用;以siRNA沉默CXCR4基因后,可显著抑制MKN45细胞增殖,抑制体外细胞迁移和侵袭,促进细胞凋亡,从而为胃癌的治疗提供新策略。     

核糖核酸干扰沉默生长抑制因子1基因表达对胃腺癌AGS细胞凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰沉默生长抑制因子1(ING1)基因表达对胃腺癌AGS细胞凋亡的影响。方法人胃腺癌细胞株AGS经常规培养后分为空白对照组、阴性对照组[转染阴性对照小干扰RNA(siRNA)序列]、siRNA组（转染特异性ING1 siRNA序列）。应用免疫荧光、定量PCR和免疫印迹方法检测转染后不同时间的ING1基因表达沉默效果。应用流式细胞技术检测ING1基因表达沉默对AGS细胞凋亡的影响。结果ING1主要在AGS细胞胞质中表达。在荧光定量PCR技术检测中将空白对照组的ING1基因表达量设为1,则转染后24和40 h阴性对照组的ING1基因相对表达量分别为0.88±0.16和0.92±0.13,siRNA组ING1基因相对表达量分别为0.38±0.09和0.17±0.06。空白对照组和阴性对照组比较,P值分别=0.78和0.82。空白对照组和siRNA组比较,P值均=0.01。阴性对照组和siRNA组比较,P值分别=0.02和0.01。免疫印迹技术检测结果显示,转染后40 h AGS细胞中ING1蛋白表达水平明显下调。空白对照组AGS细胞凋亡率为11.06％±0.97％,阴性对照组、siRNA组转染40 h后AGS细胞凋亡率为11.82％±0.69％和 6.70％±0.41％。空白对照组与siRNA组比较P=0.024。空白对照组与阴性对照组比较P=0.76。阴性对照组与siRNA组比较P=0.019。结论ING1在人胃癌细胞凋亡过程中发挥重要作用,可能成为胃癌基因治疗的新靶点。     

小干扰RNA沉默bcl-2基因抑制胃癌细胞生长的研究

目的利用RNA干扰技术,研究靶向bcl-2的小干扰RNA(siRNA)在体内外对胃癌细胞生长的影响,探讨其对胃癌治疗的可行性。方法化学合成bcl-2基因的siRNA,脂质体法将bcl-2 siRNA转染胃癌SGC 7901细胞,采用实时定量PCR和Western印迹观察bcl-2 siRNA转染前后胃癌细胞bcl-2基因的表达变化,四甲基偶氮唑盐(MTT)实验、流式细胞检测技术和端粒重复序列扩增法(TRAP)分别检测胃癌细胞增殖、凋亡和端粒酶活性变化。并将转染bcl-2 siRNA的胃癌SGC 7901细胞接种于裸鼠皮下,观察其在裸鼠体内成瘤及生长情况。结果数据经方差分析,bcl-2 siRNA转染胃癌SGC 7901细胞后,明显抑制bcl-2基因表达,并与其浓度和作用时间相关,以100 nmol/L bcl-2 siRNA对bcl-2基因表达抑制效果最佳。以该浓度的bcl-2 siRNA转染胃癌SGC 7901细胞后,bcl-2 mRNA和蛋白表达抑制分别为79．9%和85．3%；经bcl-2 siRNA作用的SGC 7901细胞生长明显缓于对照组(P＜0．05),细胞凋亡率高于对照组(P＜0．05),端粒酶活性明显低于对照组(P＜0．05)。转染100 nmol/L bcl-2 siRNA的胃癌SGC 7901细胞接种裸鼠皮下后,肿瘤出现时间晚,体积小．生长受到明显抑制(P＜0．05)。结论靶向bcl-2的siRNA可明显下调靶基因bcl-2的表达,在体内外抑制胃癌SGC 7901细胞的生长,为探索胃癌基因治疗提供新的策略。     

沉默G250基因对肾癌786-0细胞体内成瘤及生长的影响

目的 观察沉默G250基因对肾癌786-0细胞体内增殖的影响.方法 构建靶向G250的siRNA表达质粒pshRNA-G250并转染肾癌786-0细胞,12只BALB/c裸鼠分为阴性对照组和干扰成瘤组,干扰成瘤组每只裸鼠皮下接种5 ×106个G250基因沉默后的肾癌786-0细胞(786-0/si-G250-b),以转染空质粒的细胞(786-0/si-G250-0)为对照.观察裸鼠成瘤增时间、成瘤率、肿瘤体积变化、绘制生长曲线.成瘤3周后,处死裸鼠,称重瘤块,计算抑瘤率.结果 5×106个细胞皮下接种BALB/c裸鼠均成瘤,实验和对照组肿瘤出现时间分别为(11±1.5)、(15±2.4)d(t=3.381,P =0.007).7个不同时间点肿瘤的生长体积具有统计学意义(F=84.836,P=0.000).成瘤3 w后,肿瘤重量分别为(22.224 +5.145) mg、( 37.353±9.332) mg,(t=3.475,P =0.006),干扰组肿瘤成瘤抑制率为40.50%.结论 G250基因表达沉默抑制了肾癌细胞的体内增殖能力.     

幽门螺杆菌脂多糖通过调节MDM2表达对胃上皮细胞恶性转化的影响

背景:幽门螺杆菌脂多糖(Hp-LPS)在诱导胃癌发生中起重要作用。目的:探讨Hp-LPS对MDM2基因表达的调节作用,及其对胃上皮细胞恶性转化的影响。方法:分别以Hp-LPS (1μg/mL)和大肠埃希菌(E. coli)-LPS(1μg/mL)刺激人胃上皮细胞株GES-1和胃癌细胞株HGC-27、MKN45 24 h,以蛋白质印迹法检测MDM2表达。构建MDM2启动子区荧光素酶报告基因质粒并转染HGC-27细胞,以Hp-LPS刺激细胞24 h后,检测报告基因相对荧光素酶活性。构建MDM2 RNA干扰质粒并分别转染三株细胞,行流式细胞术细胞凋亡检测和Transwell细胞侵袭实验。建立裸鼠MKN45、HGC-27细胞胃癌异种移植瘤模型并予尾静脉注射siRNA-hMDMA2-3,观察移植瘤生长情况。结果:Hp-LPS可增加MDM2基因启动子转录活性,上调胃上皮细胞和胃癌细胞MDM2蛋白表达。转染siRNAhM DMA2-3的GES-1、HGC-27、MKN45细胞,细胞凋亡较转染阴性对照siRNA者显著增加(P 0. 05),侵袭能力显著减弱(P 0. 05)。经siRNA-hMDMA2-3干预的异种移植瘤模型裸鼠,肿瘤生长抑制率显著高于以阴性对照siRNA干预者(P 0. 05)。结论:Hp-LPS可能通过诱导MDM2表达引起胃上皮细胞恶性转化,而抑制MDM2表达可促进胃上皮细胞和胃癌细胞凋亡并抑制其侵袭能力,发挥抑制胃上皮细胞恶性转化和胃癌生长的作用。     

慢病毒介导的ADAM8基因沉默对胃癌MKN45细胞EMT、侵袭和迁移的影响

目的 研究慢病毒介导的解整合素和金属蛋白酶(ADAM)8基因沉默对人胃癌MKN45细胞上皮间质转化(EMT)、侵袭和迁移能力的影响.方法 采用慢病毒转染技术沉默MKN45细胞中ADAM8基因,构建稳定沉默ADAM8的MKN45细胞株,转染空载作为阴性对照组(sh-NC组),转染ADAM8 shRNA为实验组(sh-AD...     

SiRNA沉默livin基因表达促进胃癌细胞凋亡

目的:研究livin特异性小分子干扰RNA (siRNA)沉默胃癌SGC-7901细livin基因及对促胃癌细胞凋亡的影响。方法:设计针对人源livin基因的两条SiRNA:si-livin1和si-livin2,分别转染至对数生长期的胃癌SGC-7901细胞:逆转录酶链式反应(RT- PCR)检测转染前后胃癌SGC-7901细胞livin基因表达的变化,MTT法检测转染前后该细胞对5-FU、顺铂的半数抑制浓度(IC50)的变化以及检测转染前后细胞增殖能力的变化,PI染色后流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡的变化。结果:livin特异性siRNA转染胃癌SGC-7901细胞48h后,si-livin1组livinαmRNA(灰度值表示)表达较空白对照组和阴性对照组显著减少(livinα:0.167±0.013 vs 0.403±0.036,0.389±0.053;livinβ:0.181±0.028 vs 0.413±0.041,0.404±0.029,均尸<0.01),而si-livin2组livin mRNA表达相比于空白对照组和阴性对照无显著差异;转染siRNA后,si-livin1组胃癌细胞生长缓慢,生长曲线较对照组平缓;si-livin1组细胞对5-FU和顺铂半数抑制浓度IC50较空白对照组和阴性对照组显著降低(5-FU:34.07±2.98 vs 74.39±4.91,69.85±4.57;顺铂:4.56±0.35 vs 9.07±0.44,7.96±0.64,均P<0.01);转染siRNA后,si-livin1组胃癌细胞自发凋亡率较空白对照组和阴性对照组增加(11.07±1.36 vs 3.54±2.89,6.72±1.77,P<0.01,P<0.05).5-FU和顺铂作用后,si-livin1组胃癌细胞凋亡率较空白对照组和阴性对照组显著增加(5-FU:34.90±1.76 vs 11.54±O.83,13.54±2.55;顺铂:48.14±2.70 vs 14.51±0.35,15.71±0_34,均P<0.01).结论:RNA干扰可有效沉,livin基因表达从而抑制胃癌SGC-7901细胞生长及增加该细胞凋亡敏感性,livin可能成为胃癌凋亡治疗途径的一个分子靶点。     

SLP-2 siRNA对裸鼠胃癌移植瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨SLP-2siRNA对裸鼠胃癌移植瘤细胞增殖及凋亡的影响.方法:设计合成化学修饰的SLP-2siRNA,将胃癌细胞SGC-7901接种于裸鼠皮下建立裸鼠胃癌移植瘤模型,随机分为转染SLP-2siRNA组、阴性对照组和空白对照组,于肿瘤局部分别多点多次注射化学修饰SLP-2siRNA、阴性对照siRNA及生理盐水.检测3组移植瘤细胞增殖及凋亡状况,RT-PCR及免疫组织化学技术检测移植瘤细胞内SLP-2mRNA及蛋白的表达.结果:与两对照组相比,注射化学修饰的SLP-2siRNA后,裸鼠胃癌移植瘤细胞生长速度减慢、移植瘤体积减小(P=0.009,P=0.003).抑制瘤率分别为26.74%和30.15%,细胞凋亡无明显变化(P>0.05),肿瘤细胞内SLP-2mRNA及蛋白的表达量降低.结论:SLP-2siRNA可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长,但对细胞凋亡无影响,提示SLP-2基因参与促进胃癌细胞增殖.     

siRNA沉默Livin基因对胃癌细胞生长、凋亡的影响

目的:观察小分子干扰RNA(siRNA)沉默Livin基因在胃癌BGC-823细胞中的表达, 并探讨Livin基因对胃癌细胞生长、凋亡的影响.方法:自行设计两条针对Livin基因的siRNA:Livin-sh-1和Livin-sh-2, 以此构建相应的表达载体并分别转染至对数生长期胃癌BGC-823细胞, 经G418筛选后分别采用半定量RTPCR检测不同siRNA实验分组细胞BGC-823mRNA水平变化, 四氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖、流式细胞仪检测胃癌细胞的凋亡.结果:siRNA对照组与空siRNA载体组Livinα/β mRNA表达差别无显著性; 但转染siRNA组Livin α/β mRNA表达显著低于空白对照组和空siRNA载体组(Livin α:0.11±0.07 vs 0.37±0.10, 0.34±0.08; Livin β:0.13±0.04 vs 0.43±0.09, 0.45±0.11, 均P<0.05). 空白对照组与空siRNA载体组相比, 24、48、96 h和1 wk时细胞生长未受影响; 而siRNA组在转染后24 h和48 h细胞生长未受影响, 但在96 h和1 wk时则被明显抑制( P<0.01). 转染siRNA组的细胞的凋亡率与空白对照组和转染空siRNA载体组相比显著增加(14.85%±1.35% vs 4.51%±0.36%, 6.13%±0.71%, 均P<0.05).结论:siRNA沉默Livin基因能抑制胃癌细胞的生长, 促进胃癌细胞的凋亡, Livin基因有可能成为胃癌治疗的新靶点.     

Slug-siRNA干扰Slug基因表达对胰腺癌的抑制作用

目的: 研究携带Slug-siRNA的rAAV对裸鼠体内胰腺癌的作用.方法: 建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,2wk后随机将建模成功的裸鼠分为3组,每组6只. 构建携带Slug-siRNA的rAAV载体,采用瘤体内多点注射的方法,阴性对照组裸鼠按1×109 puf(50 μL)标准注射rAAV-EGFP,空白对照组裸鼠注射等量生理盐水,实验组裸鼠按1×109 puf(50 μL)标准注射rAAV2-EGFP-slugsiRNA,只注射1次. 观察裸鼠的一般情况,摄食,活动能力,每周用电子天平秤体质量,绘制裸鼠生长曲线. 治疗6 wk后二氧化碳吸入法处死裸鼠,切取肿瘤称质量;免疫组织化学SP法检测slug蛋白的表达,TUNEL检测皮下移植瘤细胞凋亡,透射电镜检测细胞超微结构.结果: 3组裸鼠分别接受不同的处理后,在开始的2 wk皮下移植瘤的生长无明显差别,2 wk以后,实验组裸鼠皮下移植瘤的体积增长明显滞后于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义( P<0.05). 治疗6 wk后,实验组裸鼠皮下移植瘤的质量明显轻于阴性对照组和空白对照组差异有统计学意义(3.26±0.48 g vs7.56±1.25 g,7.50±1.23 g,均P<0.05). 实验组裸鼠皮下移植瘤的AI值明显高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(0.27±0.06vs 0.024±0.01,0.025±0.01,均P<0.05);实验组的抑瘤率明显高于阴性对照组,差异有统计学差异(71.4% vs 0.04%,P<0.01). 透射电镜下,实验组肿瘤细胞可见细胞器结构模糊,核固缩,染色质边集等现象. 免疫组织化学检测示实验组Slug表达明显减少.结论: Slug基因被有效沉默,Slug基因沉默后促进细胞凋亡,抑制胰腺癌实体瘤增殖和生长.     

siRNA靶向沉默PcG蛋白EZH2对人胃癌细胞株MKN45增殖和侵袭力的影响

背景：PcG蛋白是一组转录抑制因子,其核心成分EZH2在胃癌组织中表达增高,并与胃癌的进展相关。目的：应用RNA干扰（RNAi）技术研究EZH2对人胃癌细胞株MKN45增殖和侵袭力的影响,从细胞水平探讨EZH2参与胃癌发生的机制。方法：使用EZH2小干扰RNA（siRNA）转染MKN45细胞,以实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测EZH2mRNA和蛋白表达,CCK-8（Cell Counting Kit-8）实验检测细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期．MatrigelTM侵袭实验检测细胞侵袭力。结果：EZH2siRNA能有效抑制MKN45细胞的EZH2mRNA和蛋白表达。与阴性对照siRNA组相比,EZH2siRNA组MKN45细胞增殖抑制率为14．7％（P＜0．05）,侵袭能力显著降低[穿过Transwell小室膜细胞数：（38．5±3．4）个／HPF对（92．7±9．7）个／HPF,P＜0．05）,细胞周期阻滞于G0／G1和G2／M期。结论：EZH2siRNA可抑制人胃癌细胞的增殖和侵袭力,证实EZH2通过促进细胞增殖和侵袭在胃癌发生中发挥作用。     

PGE2对胃癌MKN28细胞VEGF表达的影响

目的:观察前列腺素E2(PGE2)对胃癌MKN28细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA转录、蛋白表达水平的影响．方法:对胃癌MKN28细胞分别给予0．1,1,5, 10μmol／L浓度的PGE2处理3 h,分别以实时PCR,Western blot检测VEGF mRNA转录水平及VEGF蛋白表达水平的变化．结果:胃癌MKN28细胞经用不同浓度的PGE2作用3 h,VEGF mRNA表达呈剂量依赖性增加,其表达在PGE2浓度为0．1,1,5,10μmol／L时与对照组之间的差异均有统计学意义(0．67±0．093,0．74±0．13,0．87±0．07,1．49±0．15 vs 0．42±0．10．P<0．05或P<0．01)．VEGF蛋白表达量与PGE2浓度存在正相关,其表达在PGE2浓度为1,5,10μmol／L组与对照组之间的差异均有统计学意义(51．02±2．16,66．69±9．85,136．49±6．89 vs 26．87±3．98,P<0．05或P<0．01)．结论:外源性PGE2可显著增加胃癌MKN28细胞VEGF的表达．     

转移相关基因1在老年子宫内膜癌中的表达及对侵袭转移的影响

目的探讨转移相关基因(MTA) 1在子宫内膜癌中的表达及对子宫内膜癌细胞侵袭转移的影响。方法选择子宫内膜癌组织标本75例和正常子宫内膜标本75例,人子宫内膜癌HEC-1-C细胞分为siRNA MTA1组、阴性对照组和空白对照组。采用免疫组织化学法测定组织中MTA1蛋白的表达,采用RT-PCR测定组织和细胞中MTA1 mRNA的表达,采用Western印迹检测细胞中MTA1蛋白的表达,采用Transwell实验测定细胞的侵袭能力,采用划痕损伤实验测定细胞的迁移能力。结果子宫内膜癌组MTA1蛋白阳性率显著高于对照组(P<0. 05),MTA1 mRNA表达量明显高于对照组(P<0. 05)。siR-NA MTA1组HEC-1-C细胞中MTA1蛋白和mRNA表达均显著低于阴性对照组和空白对照组(P <0. 05)。siRNA MTA1组HEC-1-C细胞的穿膜细胞比例显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0. 05),HEC-1-C细胞迁移率显著低于阴性对照组和空白对照组(P<0. 05)。结论子宫内膜癌组织中MTA1水平升高,沉默MTA1基因后子宫内膜癌细胞中MTA1水平下降,细胞的侵袭和迁移能力下降。     

组蛋白去乙酰化酶1对人胰腺癌细胞增殖凋亡的影响

目的 观察沉默组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖及凋亡的影响.方法 培养胰腺癌PaTu8988细胞株,设空白对照组(未予任何处理)、阴性对照组[予30 nmol/L阴性小干扰RNA(siRNA)]、HDACI低剂量组(予15 nmol/L HDAC1 siRNA)和HDAC1高剂量组(予30 nmol/L HDAC1 siRNA),siRNA转染48 h后,分别采用相对实时定量PCR法和Western印迹法检测HDAC1基因在mRNA和蛋白水平的沉默效率,细胞计数试剂盒法检测siRNA干扰前、后细胞增殖变化,流式细胞技术检测干扰前、后细胞凋亡变化.结果 转染HDAC1siRNA 48 h后,低剂量组和高剂量组人胰腺癌PaTu8988细胞中HDAC1 mRNA表达率分别为46.1%±6.1%和32.3%±1.4%,均显著低于空白对照组(100.0%±3.4%)和阴性对照组(87.4%±28.3%),差异有统计学意义(P值均<0.05).空白对照组和阴性对照组HDAC1蛋白表达水平高于其余两组.空白对照组、阴性对照组、HDAC1低剂量组和HDAC1高低剂量组的细胞存活率分别为100.0%±17.1%、87.1%±5.0%、68.7%±4.7%和61.6%±2.0%,细胞凋亡率分别为4.20%±0.95%、4.59%±1.26%、10.09%±1.36%和11.19%±6.07%,空白对照组和阴性对照组与其余两组比较,差异均有统计学意义(P值均<0.05).结论 HDAC1 siRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞HDAC1表达,抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡.     

restin基因转染对裸鼠胃癌移植瘤生长的影响

目的:探讨restin基因转染对胃癌细胞BGC803裸鼠移植瘤生长抑制作用及对肿瘤血管生成的影响.方法:将重组质粒pEGFP-restin转染BGC-803细胞,以绿色荧光蛋白示踪其对胃癌细胞BGC-803生长的影响:RT-PCR鉴定目的基因的表达:通过裸鼠移植瘤实验比较restin对裸鼠移植瘤的生长抑制作用,免疫组织化学染色方法观察微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果:重组质粒经RT-PCR扩增后在600bp处稳定表达:将pEGFP-restin重质粒转染胃癌细胞BGC-803,荧光显微镜下见转染组细胞发出绿色荧光,肿瘤细胞形态不一;裸鼠移植瘤实验显示,与对照组(空载体组和未转染组)比较,转染组胃癌细胞生长速度缓慢,肿瘤体积小(P＜0.01);空载体组与转染组的抑瘤率分别为3.60%、29.02%:免疫组化显示,转染组肿瘤微血管密度减少(4.25±0.29 vs 9.79±0.94,10.34±1.22,均P＜0.05),转染组VEGF表达降低(12.24 3.45 vs 44.52±9.70,39.76±6.38,均P＜0.05).结论:restin基因转染可抑制裸鼠移植瘤生长,影响肿瘤新生血管形成可能是其抗肿瘤作用之一.     

粘蛋白1介导的抗胃癌细胞MKN-45侵袭作用的研究

目的 构建粘蛋白1 (MUC1)基因的反义肽核酸(PNA),观察对胃癌细胞MKN-45侵袭能力的影响,并探讨其机制.方法 根据MUC1基因的序列设计反义PNA序列,经脂质体介导转染胃癌细胞MKN45,并设空载体组(随机对照)和空白对照组(阴性对照)运用荧光定量PCR检测MUC1的表达,并观察E-粘附素的表达变化;Transwell小室实验观察对胃癌细胞侵袭力的影响.结果 构建的3个MUC1基因的反义PNA均能有效抑制该基因表达,其表达水平分别为0.62±0.18,0.49±0.12和0.60±0.21,显著低于阴性对照组(1.18±0.03,P＜0.01).阴性对照组与随机对照组之间差异无统计学意义(1.00±0.04,P=0.657).取抑制效率最高的PNA进行后续研究转染MUC1 PNA后的胃癌细胞侵袭能力显著下降(t=2.09,P=0.005),并伴有E-粘附素基因及蛋白的表达上调.结论 胃癌细胞MKN-45中MUC1基因与E-粘附素的表达存在负相关,抑制MUC1基因的表达能显著抑制肿瘤细胞的侵袭能力.     

VEGF基因沉默对肝癌HepG2细胞侵袭和迁移的影响

目的观察VEGF基因沉默对人肝癌细胞株HepG2迁移和侵袭的影响。方法采用siRNA技术沉默HepG2细胞内血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因。体外成功构建针对VEGF的3种siRNA表达载体和1个阴性对照,分别命名为pGenesil-1-VEGF-shRNA-1、2、3和pGenesil-1-VEGF-shRNA-scramble。Lipofectamine 2000介导转染HepG2,用RT-PCR筛选出沉默效果最好的siRNA片断(pGenesil-1-VEGF-shRNA-2),将其重组质粒转染HepG2(观察组),以空质粒细胞(空载组)和空白细胞(空白组)作为对照。采用细胞创伤愈合试验、Transwell小室体外侵袭试验分别检测三组细胞迁移、侵袭能力。结果细胞创伤愈合试验显示,观察组细胞迁移速度为(3.02±0.03)μm/h,显著慢于空载组的(8.67±0.02)μm/h和空白组的(8.78±0.03)μm/h,P均<0.05;细胞侵袭试验显示,观察组穿膜细胞数为(14.0±1.3)个,显著低于空载组的(35.0±2.3)个和空白组的(36.0±2.5)个,P均<0.05。结论 VEGF基因沉默可抑制肝癌细胞株HepG2的迁移和侵袭能力。     

RNA干扰沉默NF-κB p65基因表达抑制胰腺癌PANC1细胞增殖与侵袭的研究

目的 运用RNA干扰技术阻断人胰腺癌细胞株PANC1的NF-κB p65表达,观察该基因沉默后对细胞增殖能力及体外侵袭能力的影响.方法 采用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000将化学合成的人NF-κB p65的小干扰RNA(siRNA)转染人胰腺癌细胞PANC1作为siRNA组,另设无同源性siRNA转染细胞的阴性对照组和蒸馏水空白对照组.实验重复6次.应用RT-PCR检测转染细胞NF-κB p65 mRNA与细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达.MTT结合克隆形成实验测定细胞生长抑制率.Matrigel细胞侵袭实验测定细胞体外侵袭能力.结果 siRNA组、阴性对照组和空白对照组NF-κB p65 mRNA相对表达量分别为0.227±0.045、0.381±0.038和0.404±0.031;ICAM-1 mRNA相对表达量分别为0.597±0.083、0.983±0.068和1.027±0.098;细胞生长抑制率(72 h)分别为18.3%、2.3%和0;克隆形成率分别为(14.1±3.1)%、(24.5±2.1)%和(27.2±2.6)%;侵袭细胞数分别为80.25±6.35、123.83±8.80和127.68±9.23.siRNA组均明显低于2个对照组(P＜0.01).结论 NF-κB p65的RNA干扰能抑制胰腺癌PANC1细胞NF-κB p65 mRNA和ICAM-1 mRNA的表达,抑制细胞的生长和侵袭.     

RPL31-siRNA对人胰腺癌BxPC-3细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用

目的:研究siRNA沉默糖体蛋白L31(ribosomal protein L31,RPL31)对人胰腺癌BxPC-3细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用,探讨RPL31基因在胰腺癌中可能的作用机制.方法:设计合成靶向人RPL31基因的siRNA及阴性对照siRNA;建立人胰腺癌BxPC-3细胞的Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,按照移植瘤体积随机化分为3组:溶剂对照组、阴性对照组及RPL31-siRNA干预组;使用RNAi-Mate转染试剂将RPL31-siRNA进行移植瘤瘤内注射,观察各组裸鼠体内瘤体生长速度,绘制肿瘤生长曲线;采用实时定量PCR及Western blot的方法检测移植瘤组织RPL31基因的表达;免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测裸鼠皮下移植瘤Ki-67及CD31的表达;原位末端标记技术(TUNEL)检测移植瘤组织的细胞凋亡.结果:与溶剂对照组和阴性对照组相比,RPL31-siRNA注射组裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,移植瘤体积明显缩小,差异具有统计学意义(P<0.05);移植瘤组织中RPL31基因的mRNA水平和蛋白水平表达下调;另外,RPL31-siRNA注射组裸鼠移植瘤中Ki-67表达下调(55.78%±4.63%、51.37%±5.05%vs11.08%±1.31%),CD31的表达下调(56.53%±6.03%、44.84%±5.24%vs9.67%±1.39%);RPL31-siRNA注射组裸鼠移植瘤细胞凋亡增加(2.92%±0.54%、3.85%±0.87%vs39.58%±4.02%).结论:RPL31-siRNA可以下调胰腺癌BxPC-3细胞裸鼠皮下移植瘤中RPL31基因的表达,抑制移植瘤的生长,并且还可以抑制移植瘤中Ki-67及CD31的表达,诱导移植瘤细胞的凋亡.以RPL31为靶点的基因治疗有潜在临床应用前景.     

转录因子c-Jun对人血管平滑肌细胞增殖的调控作用及其机制的实验研究

目的:通过下调和上调c-Jun在人血管平滑肌细胞(hVSMCs)中的表达,研究c-Jun对hVSMCs增殖的调控作用及其机制。方法:(1)l-Jun基因低表达实验:体外培养hVSMCs,将细胞分为空白对照组、阴性对照组(转染阴性对照siRNA)和siRNA干扰组(转染靶向c-Jun的siRNA)三组,用构建好的siRNA转染各组细胞并培养24 h。(2)c-Jun基因过表达实验:体外培养hVSMCs,将细胞分为空白对照组、阴性对照组(转染阴性对照病毒载体)和慢病毒组(转染过表达c-Jun的慢病毒载体)三组,用构建好的慢病毒转染各组细胞并培养48 h。完成上述的细胞转染后,光镜观察各组细胞的生长情况,加入CCK-8试剂检测各组细胞的OD值。Western Blot检测c-Jun基因、线粒体融合基因2(Mfn2)的表达以及RAS-RAF-MEK-ERK1/2信号通路蛋白的表达。结果:siRNA干扰c-Jun表达后,与阴性对照组(1.301±0.027)或空白对照组(1.223±0.016)相比,siRNA干扰组(1.759±0.023)的OD值显著增加(P0.05),Mfn2的表达下调,RAS、RAF、MEK以及ERK1/2蛋白的表达显著增加(P0.05)。相反,慢病毒过表达c-Jun后,与阴性对照组(1.660±0.009)或空白对照组(1.862±0.123)相比,慢病毒组(1.101±0.101)的OD值显著减少(P0.05),Mfn2的表达上调,RAS、RAF、MEK以及ERK1/2蛋白的表达显著减少(P0.05)。结论:c-Jun可能通过调控Mfn2-RAS-RAF-MEK-ERK1/2信号通路调节hVSMCs的增殖。