Netrin-1对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的:研究netrin-1对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响。方法:用高糖培养人肾小管上皮HK-2细胞,real-time PCR和Western blot测定细胞中netrin-1的表达水平。用过表达netrin-1慢病毒感染HK-2细胞,检测其对高糖环境下HK-2细胞中netrin-1表达的影响。流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定cleavedcaspase-3蛋白水平,2,4-二硝基苯肼法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸法检测培养液中丙二醛(MDA)含量,ELISA法测定培养液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结果:高糖处理后的HK-2细胞中netrin-1的mRNA和蛋白水平均明显下调(P 0.05)。过表达netrin-1慢病毒能够上调高糖环境下HK-2细胞中netrin-1的表达水平(P 0.05)。高糖可促进肾小管上皮细胞分泌IL-1β和TNF-α,提高细胞培养液中LDH和MDA的水平(P 0.05),使肾小管上皮细胞的caspase-3活化并诱导细胞凋亡;上调netrin-1的HK-2细胞经高糖诱导后,细胞分泌的IL-1β和TNF-α减少,细胞中活化的caspase-3蛋白水平降低,培养液中LDH和MDA水平降低,细胞凋亡减少(P 0.05)。结论:上调netrin-1减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤和炎性损伤,减少细胞凋亡。     

MG132对高糖条件下肾小管上皮细胞SnoN蛋白表达及纤维化效应的影响

目的:观察蛋白酶体抑制剂MG132对高糖培养条件下肾小管上皮细胞核转录共抑制因子Sno N蛋白表达的影响,探讨MG132减轻高糖状态下肾小管纤维化病变的作用及可能机制。方法:将体外培养的NRK-52E细胞分为正常组(NG)、高糖组(HG)和不同浓度MG132预处理后高糖培养组(HG+MG132),采用免疫荧光双染的方法观察E-钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在肾小管上皮细胞中的表达和分布,用Western blotting方法检测Sno N、Samd泛素化调节因子2(Smurf2)、Arkadia、E-cadherin、α-SMA和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)等目标蛋白的相对表达量。结果:与NG组相比,HG组肾小管上皮细胞E-cadherin和Sno N表达减少(P0.05),而α-SMA、Col-Ⅰ、Smurf2和Arkadia表达增多(P0.05);与HG组相比,不同浓度MG132预处理肾小管上皮细胞后高糖培养,可见肾小管上皮细胞中Sno N和E-cadherin蛋白表达显著上调(P0.05),而α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表达显著下调(P0.05),并且这种效应呈量效依赖性,但MG132预处理对Smurf2和Arkadia的表达无影响。结论:MG132可对抗高糖介导的肾小管上皮细胞的纤维化效应,其机制可能是通过减少Sno N蛋白的泛素化降解作用实现的。     

SnoN对高糖诱导大鼠原代肾小管上皮细胞纤维连接蛋白合成的影响

目的: 观察核转录共抑制因子SnoN (Ski-related novel protein N)对高糖诱导大鼠原代肾小管上皮细胞(RTECs)纤维连接蛋白(FN)合成的影响。方法: 原代培养大鼠RTECs,免疫荧光细胞化学和Western blotting检测培养细胞的上皮性钙黏蛋白、 角蛋白-18和α-平滑肌肌动蛋白表达,鉴定培养细胞;正常糖(5.5 mmol/L)、高糖(25 mmol/L)和相同渗透压的甘露醇分别培养RTECs 30 min、2 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h;SnoN siRNA转染RTECs,分为对照组、高糖组、control siRNA组和SnoN siRNA组;Western blotting和免疫细胞化学检测不同处理组RTECs中SnoN和FN蛋白的表达;RT-PCR检测FN mRNA。结果: 与正常糖培养组相比,高糖刺激能抑制 RTECs中SnoN蛋白表达,且呈时间依赖性;高糖刺激能使RTECs中FN蛋白和mRNA表达增加;与单纯高糖培养组相比,转染SnoN siRNA 能进一步促进高糖诱导的RTECs中FN蛋白表达(P<0.05)。结论: SnoN表达减少参与了高糖诱导的RTECs中FN合成过程。     

氧化应激和P53参与波动高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的: 探讨波动性高糖引起的肾小管上皮细胞凋亡的机制。方法: 体外培养人肾小管上皮细胞 (HK-2),给予稳定高糖或波动高糖干预,并使用抗氧化剂和P53特异性抑制剂验证氧化应激和P53在波动高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡中的作用;此外,SD大鼠随机分为正常对照组(A)、糖尿病稳定高血糖组(B)和糖尿病波动高血糖组(C)。采用链脲佐菌素(STZ)65 mg/kg腹腔注射诱发糖尿病,血糖波动组每天定时腹腔注射速效胰岛素,并错时给予葡萄糖,造成一天中血糖浓度大幅波动模型。采用比色法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,免疫组化法和Western blotting检测NADPH氧化酶4(Nox4)和P53蛋白表达,流式细胞术和原位缺口末端标记法(TUNEL)检测肾脏细胞凋亡。结果: (1)与稳定高糖比较,波动高糖引起更加明显的HK-2细胞凋亡,P53蛋白表达明显上调,同时培养上清液中MDA含量增加和SOD活性下降,抗氧化剂和P53抑制剂可明显抑制磷酸化P53蛋白表达和细胞凋亡。(2)在体动物实验制模12周后,与B组比较,C组肾组织Nox4表达明显增加,肾小管磷酸化P53蛋白表达上调,细胞凋亡数增加。结论: 氧化应激和P53参与波动性高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡。     

黄芪多糖对糖尿病肾病肾小管上皮细胞凋亡、转分化及ROS 含量的影响研究

目的:探讨黄芪多糖对糖尿病肾病肾小管上皮细胞凋亡、转分化及ROS 含量的影响。方法:HK-2 细胞分为低糖组、高糖组和黄芪多糖+高糖组,处理细胞48 h 后,CCK-8 实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡及ROS 含量;Western blot 检测E-cadherin、α-SMA、STAT1、STAT3、p-STAT1、p-STAT3 蛋白表达。结果:高糖组细胞存活率显著低于低糖组(P<0.01),细胞凋亡率、ROS 含量及E-cadherin、α-SMA、p-STAT1、p-STAT3 蛋白表达均显著高于低糖组(P<0.01),高糖+黄芪多糖组细胞存活率显著高于高糖组,细胞凋亡率、ROS 含量及E-cadherin、α-SMA、p-STAT1、p-STAT3 蛋白表达均显著低于高糖组(P<0.01)。结论:黄芪多糖可促进高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖,抑制细胞凋亡及转分化,其机制与下调JAK/ STAT 信号通路有关。     

HBV基因转染对肾小管上皮细胞凋亡及表型转化的影响

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染人体后不仅引起肝脏功能和结构的改变,还可引起肝外多种脏器损伤,其中乙型肝炎病毒相关性肾炎(hepatitis Bvirus associated glomerulonephritis,HBV-GN)最受人们关注.但其发病机制尚不清楚.研究发现肾小管间质纤维化在肾脏病变中有重要意义[1].我们前期研究发现慢性乙型肝炎患者TGF-β1水平升高,HBV-DNA阳性血清可导致肾小管HK-2上皮细胞凋亡及表型转化[2-3].因此用含3.2 kb HBV全基因组的AM12质粒转染HK-2,进一步探讨HBV在HBV-GN肾损伤中的作用及机制.     

PPARγ通过PTEN调控AKT/FAK通路影响高糖条件下肾小管上皮细胞转分化

目的:探讨在高糖培养的肾小管上皮细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)对PTEN/AKT/FAK通路的调控机制及对肾小管上皮细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法:以高糖培养的肾小管上皮细胞NRK52E为研究对象,采用过表达及shRNA干扰技术分别上调和下调肾小管上皮细胞中PPARγ的表达,并培养48 h,应用细胞免疫荧光、Western blot和RT-qPCR方法检测PTEN及EMT相关蛋白的表达变化;然后,在过表达及敲减PTEN的情况下,分别给予PPARγ抑制剂GW9662及激动剂罗格列酮干预,进一步观察PPARγ对AKT/FAK通路的调节是否通过PTEN实现的。结果:过表达PPARγ组PPARγ和PTEN的mRNA及蛋白表达增加,E-cadherin的表达明显上调,而vimentin和α-SMA蛋白表达显著下调(P<0.05);PPARγ敲减组PPARγ及PTEN的mRNA及蛋白表达水平明显降低,E-cadherin的表达也明显下调,而vimentin和α-SMA蛋白表达显著升高(P<0.05)。GW9662干预组PTEN的表达减少,而p-AKT(Th...     

C-反应蛋白诱导人肾小管上皮细胞凋亡

目的:探讨与微炎症状态相应的C-反应蛋白(CRP)水平是否诱导肾小管上皮细胞凋亡。方法:以微炎症状态相应的CRP浓度刺激HK-2细胞。采用AnnexinⅤ-FITC、PI染色和流式细胞术检测凋亡细胞的百分率。采用Hoechst 33258染色观察肾小管上皮细胞凋亡的形态学改变。比色法检测细胞caspase-3活性。Real-time PCR检测促凋亡基因bax、抗凋亡基因bcl-2的mRNA表达。结果:CRP呈剂量和时间依赖性地诱导HK-2细胞凋亡,细胞凋亡在CRP浓度为10 mg/L时达高峰,在20 mg/L时则以晚期凋亡和坏死为主。Hoechst 33258细胞核染色显示CRP作用的HK-2细胞呈现染色质浓缩、碎裂或染色质边集等细胞凋亡的特点。CRP增高细胞caspase-3的酶活性、上调促凋亡基因bax的表达和下调抗凋亡基因bcl-2的表达。结论:CRP轻度增高可诱导肾小管上皮细胞凋亡。     

miR-377调控THEM4对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞EMT的作用

目的:探讨微小RNA-377(miR-377)对硫酯酶超家族成员4(THEM4)的靶向作用及对高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞上皮间充质转化(EMT)的影响.方法:将人近端肾小管上皮细胞HK-2分为正常葡萄糖组(NG组:5mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG 组:30 mmol/L葡萄糖)、HG+miR-NC 组(HG+转...     

瓜蒌皮提取物通过调控NQO1对高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响北大核心CSCD

目的:探讨瓜蒌皮提取物(PT)通过调控NQO1对高糖诱导的人肾小管上皮细胞炎症因子表达的影响。方法:采用5.5 mmol/L和30 mmol/L的D-葡萄糖处理人肾小管上皮细胞HK-2,记为对照组和高糖(HG)组;分别用12.5、25、50μg/ml的PT处理细胞,进行高糖处理,记为HG+PT-L组、HG+PT-M组、HG+PT-H组;采用脂质体法将vector和NQO1转染至细胞后,进行高糖处理,记为HG+vector组和HG+NQO1组;si-NC和si-NQO1转染细胞后,用50μg/ml PT和高糖处理细胞,记为HG+PT+si-NC组和HG+PT+si-NQO1组。MTT检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测Bax、Bcl-2、NQO1蛋白表达;ELISA检测IL-1β、IL-10、TNF-α表达水平。结果:HG组细胞活力、Bcl-2、NQO1蛋白表达明显低于对照组,细胞凋亡率、Bax蛋白表达、IL-1β、IL-10、TNF-α水平明显高于对照组。HG+PT-L组、HG+PT-M组、HG+PT-H组细胞活力、Bcl-2、NQO1蛋白表达明显高于HG组,细胞凋亡率、Bax蛋白表达、IL-1β、IL-10、TNF-α水平明显低于HG组。HG+NQO1组NQO1、Bcl-2蛋白表达、细胞活力明显高于HG+vector组,细胞凋亡率、Bax蛋白表达、IL-1β、IL-10、TNF-α水平明显低于HG+vector组。HG+PT+si-NQO1组NQO1、Bcl-2蛋白表达、细胞活力明显低于HG+PT+si-NC组,细胞凋亡率、Bax蛋白表达、IL-1β、IL-10、TNF-α水平明显高于HG+PT+si-NC组。结论:PT通过上调NQO1表达减轻高糖诱导的人肾小管上皮细胞凋亡和炎症损伤。     

干扰维生素D3上调蛋白1通过调控Shh影响高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的:探讨维生素D3上调蛋白1(VDUP-1)对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响及机制。方法:人近端肾小管上皮HK-2细胞用高糖处理后,real-time PCR和Western blot检测细胞中VDUP-1的水平。HK-2细胞转染VDUP-1小干扰RNA,real-time PCR和Western blot检测抑制效果。高糖条件培养VDUP-1表达下调的HK-2细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中caspase-3和caspase-9的活性,ELISA法测定培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,Western blot检测细胞中音猬因子(Shh)信号通路关键蛋白Patched 1 (Ptch1)、Smoothened (Smo)、锌指蛋白Gli2和Shh的水平。用外源性Shh处理HK-2细胞,Western blot检测Ptch1、Smo和Gli2的水平。用外源性Shh处理VDUP-1表达下调的HK-2细胞,高糖处理后,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中caspase-3和caspase-9的活性,ELISA法测定培养液上清中TNF-α含量。结果:高糖处理后,HK-2细胞中VDUP-1的mRNA和蛋白水平升高(P 0. 05)。转染VDUP-1小干扰RNA后,HK-2细胞中VDUP-1的mRNA和蛋白水平下降(P 0. 05)。与正常培养的细胞相比,高糖处理后HK-2细胞凋亡率显著升高,细胞中caspase-3和caspase-9活性明显升高,TNF-α含量亦明显升高(P 0. 05);下调VDUP-1表达后的HK-2细胞经高糖处理后细胞凋亡率显著降低,细胞中caspase-3和caspase-9活性也明显降低(P 0. 05)。高糖培养后细胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh的蛋白水平下降,而下调VDUP-1表达部分拮抗高糖对HK-2细胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh表达的影响。外源性Shh可以促进细胞中Ptch1、Smo和Gli2的表达,抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡和分泌TNF-α,与下调VDUP-1共同抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡。结论:干扰VDUP-1表达可能通过激活Shh信号通路抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和分泌TNF-α。     

血糖波动对糖尿病大鼠肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的:观察血糖波动和持续高血糖对糖尿病大鼠肾小球血管内皮细胞和肾小管上皮细胞凋亡和Bax、Bcl-2表达的影响。方法:SD大鼠24只,均分为正常对照组、糖尿病持续高血糖组、糖尿病血糖波动组。采用链脲佐菌素（STZ）60 mg/kg腹腔注射诱发糖尿病，血糖波动组每天定时腹腔注射超短效胰岛素类似物诺和锐，并错时给予葡萄糖，造成1 d中血糖浓度大幅度波动模型。制模4周后，免疫组化法检测肾组织Bcl-2和Bax蛋白表达，原位缺口末端标记法（TUNEL）检测肾小球血管内皮细胞和肾小管上皮细胞凋亡。结果:糖尿病血糖波动组的肾脏凋亡细胞明显多于、肾小球Bcl-2蛋白表达少于、肾小管Bax表达明显多于糖尿病持续高血糖组。结论:糖尿病大鼠血糖明显波动可加速肾小管上皮细胞凋亡。     

特异性小干扰RNA沉默CHOP对肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的:研究C/EBP同源蛋白(CHOP)对肾小管上皮HK2细胞凋亡的影响。方法:采用qPCR法检测急性肾损伤患者及健康对照者血清中CHOP的mRNA水平。体外培养肾小管上皮HK2细胞,随机分为对照组、阴性组和si-CHOP组,si-CHOP组和阴性组分别转染CHOP小干扰RNA(siRNA)和阴性对照siRNA,通过转化生长因子β1(TGF-β1)诱导细胞损伤。MTT法检测细胞的活力,流式细胞术检测细胞的凋亡率, Western blot检测细胞中细胞核抗原Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)、caspase-3和cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:与健康对照者相比,急性肾损伤患者血清中CHOP的表达量显著增加(P0.05);转染CHOP siRNA显著降低肾小管上皮细胞HK2中CHOP的水平,与对照组相比差异具有统计学意义(P0.05)。敲减CHOP的表达显著增加肾小管上皮HK2细胞的活力(P0.05),降低其凋亡率(P0.05),增加Ki-67和PCNA的表达量(P0.05),下调cleaved caspase-3的蛋白水平(P0.05)。结论:在急性肾损伤患者血清中CHOP的水平增加。敲减CHOP表达通过调节增殖和凋亡相关蛋白的表达抑制肾小管上皮HK2细胞的凋亡。     

EGFR在高糖诱导下人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的观察EGFR信号通路对高糖诱导下人肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡的影响和机制。方法体外培养HK-2细胞,将细胞分为4组:对照组、渗透压对照组、高糖组和高糖加EGFR抑制剂AG1478组。用Western blot检测p-EGFR、total EGFR、cleaved caspase-3、BAX、BCL-2及β-actin的蛋白表达,四唑盐比色法(MTT)检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡。结果与对照组和渗透压对照组相比,高糖组HK-2细胞EGFR活性、cleaved caspase-3表达、BAX/BCL-2比值和内质网应激(ERS)明显升高,细胞活性降低(P0.01)。EGFR抑制剂AG1478能够明显抑制高糖诱导的HK-2细胞EGFR活化和细胞凋亡(P0.05),提高细胞活性(P0.05),同时抑制内质网应激(P0.05)。结论抑制EGFR活性能够减少高糖诱导的HK-2细胞凋亡,这可能是通过减少内质网应激实现的。     

白细胞介素2对淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶在肾小管上皮细胞中表达的影响

目的：探讨IL-2对肾小管上皮细胞中淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（Lck） mRNA及蛋白表达的影响以及Lck在狼疮肾炎中的致病作用.方法：采用BALB/c小鼠及BXSB狼疮小鼠肾小管上皮细胞为实验对象,分别给予 IL-2（100 U/ml）刺激.应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测肾小管上皮细胞Lck mRNA的表达,免疫印迹法检测Lck蛋白的表达,比较IL-2刺激前后Lck mRNA及蛋白表达水平的变化.结果：正常BALB/c小鼠及BXSB狼疮小鼠肾小管上皮细胞中仅有微量Lck mRNA及蛋白表达,经IL-2刺激后二者的Lck mRNA及蛋白表达水平均有增加,以狼疮小鼠肾小管上皮细胞增加更为显著.结论：（1）肾小管上皮细胞中有Lck基因的表达.（2）肾小管上皮细胞经IL-2刺激后Lck mRNA及蛋白表达水平增加,提示IL-2可活化肾小管上皮细胞诱导Lck表达,进而可能通过一系列信号传导作用,发挥生物学作用.相对于BALB/c小鼠,狼疮小鼠肾小管上皮细胞在IL-2刺激后Lck表达更明显,提示狼疮小鼠肾小管上皮细胞可能更易激活.（3）由于Lck在狼疮肾炎小鼠肾小管上皮细胞中异常表达,推测Lck可能作为细胞因子或炎症因子的重要信号分子,促进狼疮肾炎的发生.     

高糖对肾小管上皮细胞系细胞因子表达的影响

目的观察高糖诱导肾小管上皮细胞中转化生长因子β1(TGF-β1)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-Cadherin)的改变及酪氨酸激酶(JAK)抑制剂AG490对其的影响。方法体外培养人肾近曲小管上皮细胞系(HKC),分别给予高糖和AG490干预,采用免疫沉淀和Western blot检测JAK2磷酸化的表达;Western blot检测α-SMA、E-cadherin及信号蛋白STAT1、STAT3等的水平;ELISA法测定细胞上清液中TGF-β1和Ⅰ型胶原的分泌;RT-PCR检测TGF-β1mRNA表达。结果与低糖组比较,高糖培养HKC中α-SMA、p-JAK2、p-STAT1和p-STAT3表达明显上调,E-Cadherin表达明显下调,TGF-β1mRNA表达增加;细胞上清液中TGF-β1、Ⅰ型胶原分泌增加。AG490明显抑制高糖刺激HKC中α-SMA表达的升高,减轻E-Cadherin表达下降程度,降低TGF-β1mRNA表达及TGF-β1、Ⅰ型胶原的分泌。结论JAK/STAT信号途径可能参与高糖诱导的HKC中TGF-β1和细胞外基质的分泌。