IL-27促进外周血单个核细胞来源树突状细胞分化成熟

目的:研究IL-27体外对人外周血单个核细胞(PBMC)的来源树突状细胞(DC)分化、成熟及其免疫活性的影响。方法:采集健康成人外周血,密度梯度离心法获得PB-MC,给予GM-CSF、IL-4诱导DC,第5天后根据不同处理因素将DC分为3组:IL-27组、TNF-α组和阴性对照组。倒置显微镜和透射电镜下观察DC形态;流式细胞术(FCM)检测DC表面分子CD1a、CD80、CD83和CD86的表达情况;MTT法检测DC刺激T细胞增殖的能力。结果:IL-27刺激后PB-MC来源DC呈现典型的成熟DC形态学特征。IL-27组DC表面CD1a、CD80、CD83和CD86表达水平较对阴性对照组均明显上调(P<0.05),与TNF-α组DC相比无显著差异。IL-27组DC诱导T细胞增殖的能力较对照组DC明显增高(P<0.05)。结论:IL-27可刺激PBMC来源DC的成熟。     

ManLAM对树突状细胞成熟及下游免疫的影响

目的:研究结核分枝杆菌(MTB)成分带甘露聚糖帽的脂阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan,ManLAM)对树突状细胞(dendriticcells,DCs)成熟及下游免疫的影响。方法:分离健康人外周血单个核细胞,用GM-CSF和IL-4诱导DCs生长,培养至第五天换液加细胞因子,第六天分三组,按实验设计加ManLAM和LPS。第七天收集细胞送流式检测DC-SIGN、HLA-DR、CD86、CD83表达水平;ELISA检测DCs培养上清液中IL-12和IL-10水平;混合淋巴细胞反应检测DCs诱导CD4+T淋巴细胞增值能力;DCs与初始CD4+CD45RA+T细胞共培养48小时后,ELISA检测培养上清液中IFN-γ水平。结果:(1)ManLAM组DCs表达CD86、CD83等成熟标志物较成熟DCs组下降,差异有统计学意义(P0.05);(2)ManLAM组DCs培养上清液中IL-10水平较成熟组升高,IL-12水平较成熟组下降,差异有统计学意义(P0.05);ManLAM组DCs刺激淋巴细胞增殖能力及刺激初始CD4+CD45RA+T细胞向Th1细胞分化能力较成熟组下调,差异有统计学意义(P0.05)。结论:ManLAM干扰DCs成熟,下调DCs诱导的淋巴细胞增殖能力和激活初始CD4+CD45RA+T细胞向Th1细胞分化能力。     

天花粉蛋白联合CD40信号激发的人MoDC介导Th2细胞分化的研究

探讨天花粉蛋白(Tk)联合CD40信号诱导人单核细胞来源DC(MoDC)的成熟活化及其介导Th2细胞分化的作用和机制。采用GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导人MoDC,并利用鼠抗人CD40激发型单抗(5C11)刺激负载了Tk的DC制备成熟DC。采用免疫荧光标记和流式细胞术分析DC表型(CD80、CD83、CD86、CD14、PDL1)及其摄取FITC-Dextran的能力;ELISA法测定DC上清中IL-12p70的含量;胞内染色和流式细胞术检测经成熟DC活化的T细胞中CD4~+IFN-γ~+T和CD4~+IL-4~+T的比例。实验结果显示单独Tk不能刺激DC完全成熟,用Tk负载DC后必须联合外源性成熟刺激信号(如5C11),才能有效促进DC成熟,表现在CD80、CD83、CD86的上调表达,CD14下调表达,DC摄取FITC-Dextran的能力降低。与CD40信号单独诱导组相比,Tk联合CD40信号诱导的成熟DC表面PDL1分子呈下调表达,分泌IL-12的能力显著降低,明显提高T细胞中CD4~+IL-4~+T的比例。由此表明负载了Tk的成熟MoDC体外能有效介导Th2细胞分化。     

外周血单核细胞诱导的CD123＋髓系树突状细胞的特性研究

目的:探讨体外髓系培养体系中外周血单核细胞来源的CD123+髓系树突状细胞(mDC)的生物学特性.方法:分离健康人外周血单核细胞,用重组的粒/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)将其诱导为树突状细胞(DC).用流式细胞术(FCM)检测DC表面共刺激分子、 CD304 、 CD123和CD11C的表达,并用间接免疫磁珠法将其中CD123+DC加以分离纯化; 激光共聚焦显微镜、扫描电镜观察CD123+DC形态; ELISA法检测CD123+DC的IL-12 分泌量; 葡聚糖吞噬试验和3H-TdR渗入法分别检测CD123+DC的吞噬功能和对同种异体T细胞的刺激能力.结果:外周血单核细胞经GM-CSF和IL-4诱导7 d后,细胞表面高度表达CD86和CD11C,中等量表达CD1a和CD123,低表达CD83,丧失CD14的表达,其中,CD123和CD11C均匀分布于DC表面.免疫磁珠纯化后的CD123+DC呈现典型的不成熟DC形态,除细胞体积较小外,其表面突起类似于CD123-DC.CD123+DC仅微量分泌IL-12,其吞噬能力强于CD123-DC(P<0.05),但抗原刺激功能低于后者(P<0.05).结论:GM-CSF和IL-4培养体系中的CD123+DC可能是DC分化发育过程中更早期的未成熟mDC,具有独特的生物学特性.     

脐血CD123+髓系树突状细胞的生物学特性研究

探讨人脐血单核细胞在髓系树突状细胞(DC)体外诱导体系中获得的CD123 髓系DC的生物学特性。分离脐血单核细胞,用人重组的粒/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4将其诱导为DC。用流式细胞仪检测DC表面共刺激分子、CD123和CD11c的表达,并用间接免疫磁珠法将其中CD123 DC加以分离纯化;激光共聚焦显微镜、扫描电镜和倒置显微镜观察CD123 DC形态;3H-TdR渗入法检测CD123 DC对同种异体T细胞的刺激能力。脐血单核细胞经GM-CSF和IL-4诱导7 d后,细胞表面高度表达HLA-DR、CD86、CD11c和CD123,低表达CD83,丧失CD14的表达,其中CD123和CD11c均匀分布于DC表面。免疫磁珠纯化后的CD123 DC呈现不成熟DC形态,除细胞体积较小外,其表面突起类似于CD123?DC。CD123 DC能明显刺激同种异体T细胞增殖,但其刺激能力较CD123?DC组低(P<0.05)。GM-CSF和IL-4培养体系中的CD123 DC可能是DC分化发育过程中更早期的未成熟髓系DC,具有独特的生物学特性。     

人外周血耐受性树突状细胞的诱导培养及其DC-STAMP的表达研究

目的:诱导培养人外周血耐受性树突状细胞(TolDCs)并动态观察TolDCs诱导过程树突状细胞-特异性跨膜蛋白(DC-STAMP) mRNA的表达水平.方法:(1)免疫磁珠分选法获得人外周血CD14+单核细胞,采用细胞因子GM-CSF、白介素4(IL-4)、地塞米松和LPS联合培养诱导TolDCs;(2)观察培养细胞的形态变化,流式细胞术检测CD83、CD86和CD14的表达,并将培养的细胞与T淋巴细胞共培养观察T淋巴细胞增殖反应;(3)采用实时定量PCR对TolDCs诱导培养过程中DC-STAMP mRNA表达水平进行动态观察.结果:(1) CD14+单核细胞GM-CSF、IL-4、脂多糖诱导培养后胞体变大,出现树枝状突起,为典型的成熟DCs形态,加地塞米松诱导培养后胞体亦变大,但未见明显树枝状突起,缺乏典型的成熟DCs形态;(2)CD14+单核细胞经GM-CSF、IL-4培养后使CD83和CD86表达上调,CD14表达下调,加Dex联合诱导培养后DCs表面CD83、CD86表达下调,CD14表达上调,与T淋巴细胞共培养后增殖反应明显减弱,显示TolDCs的免疫表型和功能特性;(3) CD14+单核细胞经GM-CSF、IL-4培养后DC-STAMP mRNA的表达水平随培养时间延长而降低,加入地塞米松联合诱导后表达水平明显增加.结论:人外周血CD14+单核细胞采用GM-CSF、IL-4和地塞米松联合培养可诱导TolDCs生成,DC-STAMP可能与DCs的致耐受功能有关.     

人参皂苷Ro 促进THP-1 细胞向DC 分化的作用

目的:探讨人参皂苷Ro 联合细胞因子(GM-CSF 与IL-4)促进人单核白血病细胞(THP-1)向树突状细胞(DC)分化的作用。方法:筛选细胞因子诱导白血病源DC 敏感细胞株;采用细胞因子联合人参皂苷Ro 诱导筛选的敏感细胞株THP-1 向DC 分化。培养体系中分别加入小(5 μmol/ L)、中(10 μmol/ L)、大(20 μmol/ L)剂量人参皂苷Ro,流式细胞术检测白血病来源DC 表面标志CD1a、MHCⅠ、共刺激分子CD86 表达;逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测白血病来源DCMHCⅠ、CD86 mRNA 转录水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清TNF-α、IL-6 蛋白水平。结果:THP-1 是细胞因子诱导DC 分化的敏感白血病细胞株,与单纯细胞因子诱导比较,细胞因子联合人参皂苷Ro 作用后,白血病来源DC 表面标志CD1a、MHCⅠ、共刺激分子CD86 比例显著升高(P<0.05),CD1a、CD86 及MHCⅠ转录水平显著升高(P<0.05),培养上清TNF-α、IL-6 蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论:人参皂苷Ro 能明显促进细胞因子诱导THP-1 细胞向DC 分化。     

IL-17A 协同GM-CSF 和LPS 促进骨髓细胞衍生树突状细胞的分化和成熟研究

目的:探讨IL鄄17A 对小鼠骨髓细胞衍生树突状细胞分化和成熟的影响。方法:分离小鼠骨髓细胞,加入含GM-CSF(20 ng/ ml)RPMI1640 完全培基培养8 d,诱导小鼠骨髓单个核细胞向DC 分化,加入LPS(1 滋g/ ml)继续培养36 h,进一步诱导DC 成熟,同时在骨髓细胞衍生诱导DC 分化及成熟的不同阶段加入不同浓度的rmIL-17A(10、100 ng/ ml),采用流式细胞术检测DC 表面共刺激分子的表达,ELISA 方法检测DC 培养上清中IL-12p40 和IL-10 水平。结果:rmIL-17A 可促进GM-CSF 诱导骨髓细胞衍生DC 表面共刺激分子CD40、CD80、CD86 和MHC域的表达,且具有剂量依赖性,其中以高浓度rmIL-17A刺激组的CD40 及MHC域表达增加最显著;在LPS 诱导DC 成熟阶段加入rmIL-17A,骨髓细胞衍生DC 共刺激分子CD40、CD80、CD86 和MHC域的表达均明显增加,并且随着rmIL-17A 浓度的增加,CD86 和MHC域的表达水平也随之增高;同时与未加rmIL鄄17A 的对照组相比,低浓度rmIL-17A 组LPS 刺激骨髓细胞衍生DC 分泌IL-12p40 和IL鄄10 水平均显著增加(P <0.001),高浓度rmIL-17A 组IL-12p40 水平显著增高(P<0.001),但IL-10 水平没有变化。结论:IL-17A 可促进GM-CSF 诱导的骨髓细胞衍生DC 前体细胞表型发展,并能协同LPS 诱导骨髓衍生DC 的分化和成熟。     

4种细胞因子组合方式对小鼠树突状细胞分化发育的影响

目的观察在体外培养时4种细胞因子(CK)组合方式对小鼠骨髓源树突状细胞(DC)分化、增殖、发育的影响.方法用不同的CK定向诱导小鼠骨髓细胞分化为DC,通过流式细胞仪(荧光抗体双标记法)测定CD11c+细胞比例、MHC-Ⅱ类分子的表达及在脂多糖(LPS)刺激后CD86表达的变化.结果GM-CSF+IL-3+SCF促进DC分化、增殖的能力明显高于其他3组(P＜0.05).该组CK所诱导的DC在LPS刺激后,CD86表达增加的幅度明显低于GM-CSF+IL-4组(P＜0.01).结论GM-CSF、IL-3和SCF对于促进小鼠骨髓细胞向DC定向分化、增殖有协同作用,分化后的DC多数处于发育早期,DC前体所占的比例较大.     

肾癌细胞冻融抗原负载树突状细胞瘤苗的活化

目的: 探索体外诱导DCs活化的方法和制备肾癌树突状细胞(DCs)瘤苗。方法: 制备肾癌细胞冻融抗原；取健康人新鲜血分离外周血单个核细胞(PBMC),应用GM-CSF+IL-4刺激，诱导PBMC为iDCs,然后进行分组，采用不同因子刺激iDCs转化为mDCs,其中Ａ组:冻融抗原负载；Ｂ组: TNF-α+冻融抗原负载；Ｃ组: IL-1β+冻融抗原负载；Ｄ组: TNF-α+IL-1β+冻融抗原负载。 结果:各组均可诱导iDCs的成熟,并高表达CD86、CD80和HLA-DR；相对于其它组，D组DCs 更显著上调CD83和CD54表达(P<0.05)和IL-12分泌(P<0.01)，且D组mDCs更有效地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05)。 结论: TNF-α+IL-1β与肾癌细胞冻融抗原协同可有效促进DCs成熟、增强诱导淋巴细胞活化的能力。     

TNF-alpha induces the generation of Langerin/(CD207)+ immature Langerhans-type dendritic cells from both CD14-CD1a and CD14+CD1a- precursors derived from CD34+ cord blood cells

CD34+ cell-derived hematopoietic precursors amplified with FLT3-ligand, thrombopoietin and stem cell factor became, after a 6-day induction with GM-CSF, IL-4 and TGF-beta1, HLA-DR+, CD1a+, CD83-, CD86-, CD80- cells. A fraction of them expressed Langerin, Lag, and E-cadherin, resembling epidermal Langerhans cells (LC). TNF-alpha added for the last 3 days only marginally induced CD83 expression, but strikingly increased the proportion of immature Langerin+CD83- LC. Langerin+CD83+ and Langerin+CD83- cells were functionally distinct, the former internalizing less efficiently Langerin than the latter. Both CD1a-CD14- and CD1a-CD14+ cells sorted from FLT3-ligand, thrombopoietin and stem cell factor cultures responded to TNF-alpha by an increase of Langerin+ cells. Thus, TNF-alpha rescued LC precursors irrespective of their commitment to the monocytic lineage. When added to GM-CSF, IL-4 and TGF-beta1 containing-cultures, LPS or IL-1beta also induced significant numbers of Langerin+CD83- immature cells displaying a low allostimulatory activity, while CD40-ligand largely promoted highly allostimulatory Langerin-CD83+ cells. Altogether, these data show that in contrast to CD40-ligand, which induced LC maturation even in presence of TGF-beta1, nonspecific proinflammatory factors such as TNF-alpha, IL-1 or LPS, essentially induced immature LC generation, and little cell activation in the presence of TGF-beta1.     

The role of heat shock protein (hsp70) in dendritic cell maturation: hsp70 induces the maturation of immature dendritic cells but reduces DC differentiation from monocyte precursors

Members of the heat shock protein (hsp70) family are either constitutively expressed (hsc70) or can be induced by hyperthermic stress (hsp70). Recombinant hsp70 (rhsp70) stimulates cytokine production from monocytes and enhances NK cell proliferation and cytotoxicity. Here we demonstrate that rhsp70 binds to immature dendritic cells (DC) derived from monocyte precursors and induces their maturation as evidenced by an increase in CD40, CD86 and CD83 expression. Immature DC stimulated to mature with rhsp70 show an enhanced ability to present tyrosinase peptide to specific CTL. Mature DC did not bind rhsp70, suggesting a down-regulation in the expression of its receptor. When rhsp70 was added to monocyte precursors at the same time as GM-CSF and IL-4 it reduced the differentiation of monocytes into DC as shown by a decrease in the level of CD40, CD83, CD86 and HLA-DR expression and an increase in CD14 expression. The constitutively expressed hsc70 had neither a stimulatory effect on the maturation of immature DC nor did it reduce the differentiation of monocytes into DC. These findings demonstrate the specific ability of rhsp70 to induce the maturation of immature DC. Therefore rhsp70 may be useful for its adjuvant like properties in DC based immunotherapy of certain tumors.     

白细胞介素-18干预诱导的树突状细胞表型和活性研究

目的：研究白细胞介素-18（IL-18）干预诱导的树突状细胞（DC）的表型和活性。方法:自人外周血单核细胞诱导DC，第5 d起分为IL-18组、TNF-α组和IL-18+TNF-α组，分别加IL-18、TNF-α及IL-18+TNF-α促成熟，用ELISA法测定上清中IL-12含量；用流式细胞仪测定培养8 d DC的CD1a、HLA-DR、CD83及CD86的表达；用MTT法检测3组DC诱导T细胞增殖的作用。用ELISA法测定3组DC刺激T细胞分泌干扰素γ(IFN-γ)的量。结果:IL-18组与TNF-α组CD1a、HLA-DR、CD83及CD86表达无差异，IL-18+TNF-α组CD1a、CD83及HLA-DR阳性率高于IL-18组。IL-18+TNF-α组IL-12量高于IL-18组和TNF-α组(P＜0.05)。IL-18组与TNF-α组DC刺激T细胞增殖作用无差异，IL-18+TNF-α组DC的作用强于IL-18组和TNF-α组。IL-18组和TNF-α组IFN-γ量无显著差异，IL-18+TNF-α组IFN-γ的量高于IL-18组和TNF-α组(P＜0.05)。结论:IL-18干预诱导的DC高表达表面分子，具有明显的免疫刺激活性，IL-18与 TNF-α合用作用更强。     

香加皮羽扇豆烷乙酸酯(CPLA)对树突状细胞分化成熟的影响

目的：探讨香加皮羽扇豆烷乙酸酯（CPLA）对人外周血单个核细胞（PBMC）来源的树突状细胞（DC）在体外分化成熟及免疫活性的影响。方法：从人外周血分离单个核细胞，与细胞因子GM—CSF、IL-4共培养，于第5天加入DC的促成熟刺激剂TNF-α（阳性对照组）或CPLA。倒置显微镜和透射电镜下观察DC的形态；应用流式细胞术检测成熟DC的表面标志CD1a、CD83、CD80和CD86的表达情况；用ELISA检测DC培养上清中IL-12和IFN-γ的含量；用MTT法测定DC刺激T细胞增殖的能力。结果：培养10d后，经CPLA刺激的PBMC呈现出典型DC的形态学特征；成熟DC的特征性表面分子CD1a、CD83、CD80和CD86表达水平均明显上调（P〈0．05）；细胞培养上清中IL-12和IFN-γ含量明显增高（P〈0．05）；刺激T细胞增殖的能力明显增强（P〈0．05）。结论：CPLA可诱导PBMC来源的DC分化成熟，并可促进其细胞因子的分泌，增强DC的免疫调节活性。     

Dendritic cells generated in the presence of GM-CSF plus IL-15 prime potent CD8+ Tc1 responses in vivo

Dendritic cells (DC) comprise a system of professional antigen-presenting cells, which induce the stimulation of very rare antigen-specific naive T cells. DC progenitors can be stimulated to differentiate into immature DC by various growth factors, including GM-CSF and IL-4. Here we show that IL-15, in combination with GM-CSF, is a growth factor for murine DC. Murine bone marrow cells, depleted of T cells, B cells, I-A+ cells and Gr-1+ granulocytes, and cultured in the presence of GM-CSF plus IL-15 (IL-15 DC), yielded DC expressing high levels of CD11c and MHC class II molecules, as well as CD11b. These cells expressed significant levels of CD40, CD80 and CD86, and could stimulate allogeneic CD4+ T cells efficiently. Interestingly, IL-15 DC were far superior to DC generated with GM-CSF plus IL-4 in stimulating allogeneic CD8+ T cells in vitro. Consistent with this, IL-15 DC induced much more potent antigen-specific CD8+ T cell responses with high levels of Th1 cytokines in vivo, compared to DC generated with GM-CSF plus IL-4, or with GM-CSF plus TGF-beta, or with GM-CSF alone. Together, these data suggest that IL-15 promotes the development of DC, which induce potent Th1 and Tc1 responses in vivo. This suggests potential roles for these IL-15 DC cells in the immunotherapy of tumors and infectious diseases.     

慢性乙肝患者树突状细胞对Th1/Th2分化的影响

探讨慢性乙肝患者树突状细胞(dendritic cells,DC)对CD4+Th细胞亚群分化的影响。分离慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC),以rhIL-4(50 ng/ml)、rhGM-CSF(10 ng/ml)和rhTNF-α(100 u/ml)诱导培养DC。以流式细胞仪检测DC表面CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR分子表达情况。MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞亚群,PMA+Ionomycin刺激后胞内荧光染色,流式细胞仪检测辅助性T细胞(helper T cell,Th)内特征性细胞因子IFN-γ/IL-4以判断Th1/Th2分化。ELISA法检测DC或Th细胞培养上清中IL-6、IL-12、IFN-γ和IL-4的含量。结果:慢性乙肝患者的DC表达CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR分子水平明显低于正常人(P<0.01);培养至第7天,慢性乙肝患者DC分泌的IL-12水平低于正常人(P<0.01),而分泌的IL-6水平增高(P<0.05)。与正常人相比,慢性乙肝患者外周血中Th1细胞占CD4+T细胞的百分比较低(P<0.01),其Th细胞培养上清中IFN-γ的量也较低(P<0.01)。患者DC与同种异体的健康人Th细胞共培养,刺激Th1型细胞因子IFN-γ产生的能力低于正常人(P<0.01)。慢性乙肝患者体内DC功能的异常可能导致了外周血Th1细胞分化不足。     

不同刺激剂诱导肺癌患者引流淋巴结细胞分泌细胞因子的研究

目的:探讨多种刺激剂对肿瘤引流淋巴结(TDLN)细胞分泌细胞因子的影响及其抗肿瘤效应和机制。方法:采用ELISA和Griess法测定不同刺激组(分别为IL2、IL2 自身肺癌细胞抗原、IL2 GMCSF IL4 自身肺癌细胞抗原和IL2 GMCSF IL4 LPS)刺激TDLN后第7、14、21天,分泌IL12p70、IFNγ、TNFα和NO的水平。结果:IL2 GMCSF IL4 自身肺癌细胞抗原和IL2 GMCSF IL4 LPS组刺激的TDLN细胞中,CD83 细胞的比率明显增多,分泌IL12p70、IFNγ及TNFα的水平也明显高于IL2和IL2 自身肺癌细胞抗原刺激组,IL2 GMCSF IL4 LPS组刺激的TDLN细胞分泌NO的水平明显高于其他3组。各种刺激剂刺激TDLN细胞后,分泌IL12p70、IFNγ和NO的水平在第14天时达到高峰。结论:不同刺激剂诱导TDLN细胞中的CD83 细胞数量不同,故具有不同的抗肿瘤活性。