姜黄素诱导的免疫耐受性人树突状细胞的研究

目的:探讨姜黄素(Curcumin)诱导免疫耐受性人树突状细胞(Dendritic cell,DC)的效果。方法:聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque,F-H)密度梯度离心法获得健康人外周血单个核细胞(PBMC),在含有重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素4(rhIL-4)的培养基中培养6天。实验共分四组:①未成熟DC组(imDC组)、②姜黄素组(Curcumin,Cur组)、③姜黄素+脂多糖组(Cur+LPS组)、④脂多糖组(LPS组)。流式细胞术检测DC表型CD80、CD86、CD83及HLA-DR的表达情况和DC吞噬葡聚糖的能力,酶联免疫吸附法(ELISA)检测DC分泌白介素-12(IL-12)的能力,混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果:Cur能够显著抑制DC共刺激分子CD80、CD86、CD83及HLA-DR的表达,并呈剂量依赖性,与imDC组比较差异无统计学意义;与LPS组比较,Cur+LPS组DC吞噬葡聚糖的阳性细胞百分率显著提高(P<0.05),而刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力则显著下降(P<0.05),IL-12的分泌量也显著下降(P<0.05)。结论:姜黄素能够抑制人树突状细胞的成熟,从而获得免疫耐受性的人树突状细胞。     

外周血单核细胞诱导的CD123＋髓系树突状细胞的特性研究

目的:探讨体外髓系培养体系中外周血单核细胞来源的CD123+髓系树突状细胞(mDC)的生物学特性.方法:分离健康人外周血单核细胞,用重组的粒/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)将其诱导为树突状细胞(DC).用流式细胞术(FCM)检测DC表面共刺激分子、 CD304 、 CD123和CD11C的表达,并用间接免疫磁珠法将其中CD123+DC加以分离纯化; 激光共聚焦显微镜、扫描电镜观察CD123+DC形态; ELISA法检测CD123+DC的IL-12 分泌量; 葡聚糖吞噬试验和3H-TdR渗入法分别检测CD123+DC的吞噬功能和对同种异体T细胞的刺激能力.结果:外周血单核细胞经GM-CSF和IL-4诱导7 d后,细胞表面高度表达CD86和CD11C,中等量表达CD1a和CD123,低表达CD83,丧失CD14的表达,其中,CD123和CD11C均匀分布于DC表面.免疫磁珠纯化后的CD123+DC呈现典型的不成熟DC形态,除细胞体积较小外,其表面突起类似于CD123-DC.CD123+DC仅微量分泌IL-12,其吞噬能力强于CD123-DC(P<0.05),但抗原刺激功能低于后者(P<0.05).结论:GM-CSF和IL-4培养体系中的CD123+DC可能是DC分化发育过程中更早期的未成熟mDC,具有独特的生物学特性.     

载脂蛋白A-I对树突状细胞表型及功能影响

目的:探讨载脂蛋白A-I(ApoA-I)对人外周血树突状细胞(PBDC)及体外培养的单个核诱导的树突状细胞(MD-DC)的影响及其机制。方法:采用免疫磁珠法,直接分离PB-DC或通过GM-CSF,IL-4诱导生成MDDC,DC经ApoA-I,LPS或TNF-α刺激后,用流式细胞技术(FCM)检测树突状细胞表面协同刺激分子表达的变化及细胞的吞噬能力;酶联免疫吸附法(ELISA)检测DC分泌的细胞因子;CFSE法检测经刺激后DC对T细胞增殖的影响。结果:分离高纯度PBDC,并成功诱导生成未成熟MDDC;经FCM检测,ApoA-I刺激后的PBDC和MDDC膜表面CD83分子表达上调,同时MDDC表面的CD40、CD86及MHC-Ⅱ分子的表达均增强;吞噬能力减弱;IL-12和TNF-α的分泌增加;并且可以诱导Th细胞的增殖。结论:在体外ApoA-I可以诱导PBDC和MDDC的成熟、活化,刺激其分泌细胞因子,发挥其免疫应答中抗原呈递,促进Th分化的作用;通过该作用ApoA-I可能参与了动脉粥样硬化的发生,发展中的免疫应答。     

肺炎支原体荚膜多糖与DC-SIGN结合并促进IL-10的分泌

目的 研究肺炎支原体(Mp)荚膜多糖(CPS)与树突状细胞(DC)特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子(DC-SIGN,CD09)的相互作用及其对未成熟DC(iDC)分泌IL-10和IL-12的影响.方法 提取并纯化Mp的CPS和脂质相关膜蛋白(LAMPs),用间接免疫荧光检测CPS与DC-SIGN受体的作用;ELISA法检测CPS和LAMPs作用后iDC所分泌的IL-10,IL-12水平.结果 间接免疫荧光可见Mp CPS可结合到DC表面,且DC-SIGN的特异性封闭抗体可阻断CPS与DC的结合;ELISA检测发现CPS与LAMPs共孵育可促进DC分泌IL-10(P ＜0.05),而IL-12的表达水平刺激前后无统计学的差异.结论 Mp的CPS可识别并结合DC的DC-SIGN受体,并促进未成熟DC分泌IL-10.     

IL-27促进外周血单个核细胞来源树突状细胞分化成熟

目的:研究IL-27体外对人外周血单个核细胞(PBMC)的来源树突状细胞(DC)分化、成熟及其免疫活性的影响。方法:采集健康成人外周血,密度梯度离心法获得PB-MC,给予GM-CSF、IL-4诱导DC,第5天后根据不同处理因素将DC分为3组:IL-27组、TNF-α组和阴性对照组。倒置显微镜和透射电镜下观察DC形态;流式细胞术(FCM)检测DC表面分子CD1a、CD80、CD83和CD86的表达情况;MTT法检测DC刺激T细胞增殖的能力。结果:IL-27刺激后PB-MC来源DC呈现典型的成熟DC形态学特征。IL-27组DC表面CD1a、CD80、CD83和CD86表达水平较对阴性对照组均明显上调(P<0.05),与TNF-α组DC相比无显著差异。IL-27组DC诱导T细胞增殖的能力较对照组DC明显增高(P<0.05)。结论:IL-27可刺激PBMC来源DC的成熟。     

慢性乙肝患者树突状细胞抗原递呈功能状态的初步研究

目的:研究慢性乙肝患者树突状细胞(DC)抗原递呈功能的改变。方法:从慢乙肝患者和健康人外周血分离单个核细胞,诱导培养出DC,显微镜下观察DC形态并计数,流式细胞仪检测DC表面协同刺激分子(CD80,CD86),MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,ELISA法测定培养上清液中IL-12、r-IFN水平。结果:慢乙肝患者外周血单个核细胞诱导培养所获得的DC数量及表面协同刺激分子(CD80,CD86)表达水平、刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和细胞因子产生水平均明显低于健康者(P<0.05)。结论:慢乙肝患者DC的数量及抗原递呈、免疫刺激功能状态均处于低下水平。     

慢性乙肝患者树突状细胞对Th1/Th2分化的影响

探讨慢性乙肝患者树突状细胞(dendritic cells,DC)对CD4+Th细胞亚群分化的影响。分离慢性乙肝患者外周血单个核细胞(PBMC),以rhIL-4(50 ng/ml)、rhGM-CSF(10 ng/ml)和rhTNF-α(100 u/ml)诱导培养DC。以流式细胞仪检测DC表面CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR分子表达情况。MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞亚群,PMA+Ionomycin刺激后胞内荧光染色,流式细胞仪检测辅助性T细胞(helper T cell,Th)内特征性细胞因子IFN-γ/IL-4以判断Th1/Th2分化。ELISA法检测DC或Th细胞培养上清中IL-6、IL-12、IFN-γ和IL-4的含量。结果:慢性乙肝患者的DC表达CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR分子水平明显低于正常人(P<0.01);培养至第7天,慢性乙肝患者DC分泌的IL-12水平低于正常人(P<0.01),而分泌的IL-6水平增高(P<0.05)。与正常人相比,慢性乙肝患者外周血中Th1细胞占CD4+T细胞的百分比较低(P<0.01),其Th细胞培养上清中IFN-γ的量也较低(P<0.01)。患者DC与同种异体的健康人Th细胞共培养,刺激Th1型细胞因子IFN-γ产生的能力低于正常人(P<0.01)。慢性乙肝患者体内DC功能的异常可能导致了外周血Th1细胞分化不足。     

重组质粒pchIL-18-MAGE转染树突状细胞疫苗体外杀伤肝癌细胞的研究

目的:探讨重组质粒pch IL-18-MAGE转染DC细胞在体外对肝癌细胞的杀伤作用。方法:构建共表达质粒pchIL-18-MAGE,体外培养树突状细胞,将以上重组质粒转染树突状细胞。RT-PCR和Western blot方法验证IL-18和MAGE-1基因在转染DC中的表达。应用流式细胞术检测转染后DC细胞的表型变化。以转染重组质粒DC刺激的淋巴细胞作为效应细胞,单纯淋巴细胞和未经转染DC刺激的淋巴细胞为对照,检测其对肝癌靶细胞的体外杀伤作用。ELISA法检测INF-γ的分泌。结果:pchIL-18-MAGE转染后DC细胞高表达CD83、CD1a、CD86、CD80、HLA-DR等抗原,表现为成熟DC表型特征。共表达质粒转染的DC细胞诱导的CTL对肝癌细胞杀伤作用最强(P<0.05)。结论:pchIL-18-MAGE转染DC细胞对MAGE+肝癌细胞杀伤作用明显。     

罗勒多糖对树突状细胞表面分子表达的影响

目的：观察罗勒多糖对人外周血单核细胞来源的树突状细胞（Dendritic cell，DC）表面分子表达的影响，探讨其抗肿瘤免疫机制。方法：从正常人外周血分离获得单核细胞，加入含10％胎牛血清、CM-CSF及IL-4的RPMI1640，37℃培养5天，实验组加入罗勒多糖，对照组加入PBS，流式细胞仪检测细胞表面分子的表达。结果：在细胞因子的诱导下，CD14^＋单核细胞逐渐分化为DC，罗勒多糖作用组与对照组DC均表达CD209、CD80、CD83、CD86、CD1a和HLA-DR，与对照组相比，罗勒多糖组DC表面分子CD80和HLA-DR的表达均明显上调。结论：罗勒多糖能够调节DC表面分子CD80和HLA-DR的表达，这可能是罗勒多糖发挥其抗肿瘤免疫的机制之一。     

SOCS1沉默增强树突状细胞抗喉癌免疫效应

目的研究SOCS1沉默的树突状细胞特异性抗肿瘤作用机制,并探讨RNAi技术在喉癌基因治疗中的应用前景,为树突状细胞的临床应用提供新思路和理论依据。方法以细胞因子GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导扩增外周血单核细胞来源的DC,倒置显微镜下观察DC形态特征;构建RNAi载体转染DC,Western blot检测SOCS1的表达情况,筛选抑制SOCS1表达的有效靶序列;流式细胞术检测DC表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表达;ELISA法分析上清中IFN-γ的含量;MTT法评估DC刺激T细胞增殖的能力及诱导细胞毒性T细胞的杀伤活性。结果 DC体外诱导培养成功;设计的RNAi载体经测序验证无误。干扰序列5可显著下调SOCS1表达水平;SOCS1沉默联合喉癌Hep-2抗原致敏的DC可显著上调表面分子标志CD83(85.61±0.96)%、CD86(96.86±1.20)%和HLA-DR(98.02±0.94)%的表达;该组DC能有效刺激T细胞增殖,增加IFN-γ的分泌量,最终增强CTL的特异性杀伤作用,效靶比为50:1时其杀伤活性显著高于对照组(P<0.01)。结论 SOCS1沉默并负载喉癌Hep-2抗原的DC可以产生高效而特异性的抗喉癌免疫应答。     

抗P选择素功能域单抗对人树突状细胞表型及IL-12分泌的影响

观察抗P选择素Lectin EGF功能域单抗 (PsL EGFmAb )对体外培养人树突状细胞 (DC )表型以及促炎细胞因子IL 1 2分泌的影响 ,探讨PsL EGFmAb对DC炎性成熟过程中的调节作用。通过SCF、GM CSF、TGF β1 、Flt 3和TNF α体外培养体系 ,从脐血CD34+ 造血干细胞中诱导扩增获得DC ,并于成熟中用PsL EGFmAb进行干预。采用流式细胞仪分析细胞表型CD1a、CD1 1c、CD83、CD80、CD86和HLA DR ;采用RT PCR检测IL 1 2p35、p4 0mRNA表达 ;以及ELISA法测定IL 1 2p70分泌的含量。结果显示 ,PsL EGFmAb可下调成熟中DC表面CD1 1c、CD83、CD80、CD86和HLA DR的表达 ,同时能抑制DC内IL 1 2p35、p4 0mRNA的转录和IL 1 2p70的分泌。本研究提示 ,PsL EGFmAb对DC黏附共刺激分子表达和促炎细胞因子合成具有抑制作用 ,并可能影响和调抑DC成熟及其提呈抗原功能     

干扰素-α联合GM－CSF诱导慢性髓性白血病细胞向树突状细胞分化

目的：研究干扰素-α（IFN-α）对慢性髓性白血病（CML）骨髓单个核细胞来源的树突状细胞（DCs）发育的影响。 方法： 12例初发慢性期CML患者的骨髓单个核细胞，分别与含如下细胞因子,RPMI-1640培养液共育：rhGM-CSF 1×106U/L联合rhIFN-α 2×106U/L（IFN-α组）、rhGM-CSF 1×10⁶U/L联合rhIL-4 5×10⁵U/L（IL-4组）、单用rhGM-CSF 1×10⁶U/L和单用rhIFN-α 2×106U/L，培养7 d；于第8-10 d，部分孔加入rhTNF-α 5×10⁴U/L。形态学（Wright染色、倒置显微镜）、免疫学（CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR）检测；磷脂酰丝氨酸（PS）转位检测 DCs凋亡情况；荧光原位杂交（FISH）对1例CML进行细胞遗传学分析；混合淋巴细胞反应（MLR）检测刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。 结果： CML骨髓单个核细胞经上述细胞因子诱导7 d后，IFN-α组和IL-4组均呈现树突状细胞的典型形态；免疫学鉴定，IFN-α组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达显著高于IL-4组（P<0.05），经5×104U/L rhTNF-α作用后，两组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR进一步上调，其中IFN-α组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达显著高于IL-4组（P<0.05）；经FISH证实来源于白血病细胞；两组DCs均具有刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力，IFN-α组刺激淋巴细胞增殖的能力明显高于IL-4组(P<0.05)。 结论： IFN-α可促进CML骨髓单个核细胞来源的树突状细胞的分化、活化。这可能是IFN-α在CML中的治疗机制之一。     

抗CD47单抗对人树突状细胞的免疫调控作用及其机制探讨

目的:研究可溶性的抗CD47单抗(B6H12)对树突状细胞(DC)的免疫调控作用及分子机理。方法:分离人外周血单核细胞,联合应用rhGM-CSF、IL-4、细菌脂多糖(LPS)在体外诱导扩增DC,并在培养体系中添加抗CD47单抗(B6H12)。采用透射电镜观察DC形态,流式细胞仪检测DC膜表面分子,ELISA定量检测DC释放IL-12P70水平,Brdu-ELISA 法检测DC刺激同种异型淋巴细胞增殖,凝胶电泳迁移率改变实验(EMSA)检测NF-κB活性。结果:(1)经抗CD47单抗(B6H12)处理的DC,膜表面CD80、CD86、CD1a、CD83、DR表达显著降低(P＜0.05);其释放IL-12P70的水平及刺激同种异型淋巴细胞增殖的能力也显著低于对照组(P＜0.01)。(2) B6H12单抗处理DC组其NF-κB活性显著降低(P＜0.05),且该效应呈剂量依赖性。结论:抗CD47单抗可通过抑制NF-κB活性而影响DC的发育、成熟及功能。     

IFN-γ促进人单核细胞向不典型成熟DC分化

目的: 研究IFN-γ对人单核细胞表型及分化的影响.方法: 采用免疫磁珠法从健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs)中特异性分选单核细胞, 以细胞因子IFN-γ、 TNF-α、 IFN-α刺激单核细胞后, 观察单核细胞生长特性, 并以流式细胞术检测单核细胞表面CD1a、 CD14、 CD80、 CD83、 CD86、 HLA-DR等分子表达.结果: 细胞因子IFN-γ、 TNF-α、 IFN-α对单核细胞形态、生长及表型转化有不同影响.IFN-γ促进单核细胞黏附聚集形成"细胞小岛结构", 刺激单核细胞形态向梭形及多角形转化; IFN-γ上调单核细胞表达CD80、 CD83、 CD86及HLA-DR分子, 同时下调CD14分子表达.结论: IFN-γ促进单核细胞向不典型的成熟DC方向分化.     

激动型CD40单克隆抗体体外抑制结肠癌细胞增殖的实验研究

目的 探讨激动型CD40单克隆抗体在体外对结肠癌细胞增殖的抑制作用.方法 树突状细胞(DCs)经结肠癌冻融抗原致敏后予以不同条件激活,分为激动型CD40单克隆抗体组、阴性对照组及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)阳性对照组,诱导培养至第7天,用流式细胞仪检测各组DCs表面分化相关抗原CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达,酶联免疫吸附测定法检测DCs培养液上清中白细胞介素-12(IL-12)的质量浓度,噻唑蓝比色法检测DCs体外刺激T淋巴细胞增殖的能力,进而检测DCs所诱导的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对人结肠癌细胞HCT116的杀伤作用.结果 与阴性对照组相比,激动型CD40单克隆抗体组活化的DCs表面抗原CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达率均显著升高(均P＜0.05),DCs上清中IL-12的质量浓度亦显著升高((716.80±53.43) pg/ml比(405.51±12.17) pg/ml,P＜0.05),活化的DCs具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力(刺激指数2.006 2±0.438 3比1.365 0±0.209 8,P＜0.05),活化的DCs所诱导的CTL对HCT116细胞具有更强的杀伤作用(抑制率(66.08±0.41)％比(46.60±1.10)％,P＜0.05);而与TNF-α阳性对照组相比,其差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 激动型CD40单克隆抗体在体外可促进DCs的活化与成熟,进而诱导肿瘤特异性CTL的产生,从而抑制人结肠癌细胞HCT116的增殖.     

CD80 and CD86 costimulatory molecules on circulating T cells of HIV infected individuals

The expression of CD80 and CD86 costimulatory molecules, typical for antigen presenting cells (APC), was measured on circulating T cells of 20 HIV-infected individuals and of 11 HIV-negative healthy controls. The CD80 and CD86 molecules were present on both circulating T subsets of HIV-infected individuals (mean of CD80 expression within CD4+ T cells [CD80/CD4]: 5.0%; and CD86/CD4: 2.6%; CD80/CD8 4.1% and CD86/CD8: 2.7%) and were associated with HLA-DR expression. Some CD80 and CD86 expression was also found in normal controls, and only the expression of CD86 was significantly (P < 0.05) increased on CD4 + and CD8 + T cells of HIV-infected individuals. The expression of CD28 was decreased on T cells of HIV-infected individuals and was negatively correlated to the expression of HLA-DR and CD86 (mean CD28 within CD3+T cells: HIV+ 29.5%, HIV - 67.6%; correlation coefficient, - 0.75 and - 0.71, respectively). The more the disease proceeds, the less CD28 and the more DR and CD86 are found on circulating T cells. This suggests that during HIV infection T cells themselves develop an antigen presenting phenotype by upregulating expression of HLA-DR, CD86 and CD80 molecules.     

Phenotype of Resting and Activated Monocyte-Derived Dendritic Cells Grown from Peripheral Blood of Patients with Ankylosing Spondylitis

Decreased levels of class II major histocompatibility complex (MHC) expression and impaired formation of immunological synapse by dendritic cells (DCs) of HLA-B27 transgenic rats have been recently demonstrated. The resulting dysfunction of DCs may be implicated in the pathogenesis of the HLA-B27-related disease in transgenic animals. The phenotype of DCs in patients with ankylosing spondylitis (AS) has not been evaluated. Monocyte-derived DCs (MDDCs) were grown from patients with active AS and age-matched healthy volunteers. Surface expression of HLA-DR, co-stimulation molecules CD80, CD86 and CD40, as well as CD83 was assessed by flow cytometry and compared between the groups under 3 conditions: in resting state, after stimulation by lipopolysaccharide (LPS) and after stimulation by LPS in the presence of etanercept, a soluble receptor of tumor necrosis factor α. Lower baseline expression of class II MHC molecules (HLA-DR) was observed by MDDCs grown from AS patients, as compared to healthy subjects. Post-stimulated levels of HLA-DR were comparable in both groups, suggesting greater up-regulation of class II MHC molecules by MDDCs from AS in response to LPS. No difference between groups in the levels of expression of co-stimulation molecules and CD83 was observed. Lower basic expression of class II MHC by the MDDCs grown from patients with AS may be associated with impaired regulation of their activity. Functional studies on DCs from patients with AS are needed to evaluate the integrity of their antigen-presenting function.     

食管黏膜树突状细胞表型分析

目的:研究食管黏膜树突状细胞(DCs)表型特点。方法:内镜下收集健康人食管黏膜标本,Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离食管黏膜标本中的单个核细胞,采用磁珠分选技术分离DCs,流式细胞仪分析食管黏膜DCs表型。结果:健康人食管黏膜含3类单个核细胞:HLA-DRhigh/CD13low,HLA-DRmed/CD13+和HLA-DR-/CD13+;HLA-DRhigh/CD13low细胞表达不同DCs亚群表面标志,是食管黏膜DCs;健康人食管黏膜DCsCD80、CD83、CD86表达水平低,是不成熟DCs。结论:成功分离了食管黏膜DCs,证实HLA-DRhigh/CD13low细胞是食管黏膜DCs。     

EB病毒对新生儿脐带血单核细胞来源的树突状细胞表型的影响

从脐带血单核细胞来源树突状细胞(DC)表型变化的角度来探讨EB病毒对DC表型的影响,以阐明其逃逸宿主免疫的机制。将GM-CSF和IL-4、EB病毒和LPS不同组合对单核细胞来源DC进行刺激培养,利用单染色和三染色免疫荧光抗体标记—流式细胞术检测单核细胞来源DC表面CD14、CD11c、CD1a、HLA-DR、CD86、MR和MHCⅠ类分子。加入EB病毒后,DC表面CD14分子表达的下调不明显,CD1a的表达则随病毒加入时细胞的分化阶段有关;同时EB病毒还影响了加入LPS后HLA-DR和CD86的升高和MR的降低;EB病毒还影响了细胞表面MHCⅠ类分子的表达。因此EB病毒可抑制单核细胞来源DC的分化和成熟,这可能是其逃逸宿主免疫的机制之一。