2008年辽宁省乙脑病毒分离株全基因组特征分析

目的 对2008年分离自辽宁蚊虫的乙脑病毒株进行全基因组序列测定和分析,了解其全基因组特征.方法 使用针对乙脑病毒全基因组测序引物,RT-PCR扩增片段,完成对病毒全基因组序列的测定.应用Chstal X(1.83)、ATGC(V4)、DNAStar、GENEDOC(3.2)、Mega(4.0)等生物学软件完成全基因组核苷酸和氨基酸序列分析及病毒的系统进化分析.结果 乙脑病毒LN0828株基因组全长10 965个核苷酸,其中从97位到10 392位为开放读码框,编码3432个氨基酸.与GenBank中的32株乙脑病毒在全基因组水平的核苷酸总体差异率为1.6%～16.4%,氨基酸总体差异率为0.3%～5.1%.与减毒活疫苗株SA14-14-2相比,编码区共存在1186个核苷酸差异,86个氨基酸差异.全基因组序列系统进化分析显示LN0828株属于基因Ⅰ型乙脑病毒.结论 与该地区2002年和2007年乙脑病毒分离株高度同源,关键位点氨基酸未见变异.     

中国基因3型乙型脑炎病毒E基因分子特征

目的 以减毒活疫苗(SA14-14-2株)为对照,分析我国分离的基因3型乙脑病毒E基因区段核苷酸及氨基酸序列分子特征.方法 从GenBank中获取相应乙脑病毒株E基因区段核苷酸序列,通过Clustal X(1.81)、DNAStar、GENEDOC(3.2)等生物学软件进行核苷酸和氨基酸位点差异分析.以蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白氨基酸位点分析.结果 我国不同地域、不同宿主分离的基因3型乙脑病毒与SA14-14-2株核苷酸同源性分别在96%和95%以上,氨基酸同源性在95%和94%以上.在同一地域、同一宿主类型分离的毒株之间核苷酸和氨基酸同源性非常高.在E基因区段存在10处共同的氨基酸位点差异,在结构域Ⅰ(E160)、结构域Ⅱ(E123和E227)和两个未在结构域中的氨基酸位点(E441和E487)等5个位点在部分基因3型乙脑病毒中存在差异.结论 我国分离的基因3型乙脑病毒与减毒活疫苗株(SA14-14-2株)E基因区段同源性高,存在5处基因3型乙脑病毒特异的氨基酸位点差异,但现行减毒活疫苗株理论上可以保护我国分离的基因3型乙脑病毒野毒株.     

乙型脑炎病毒减毒活疫苗生产株SA_(14)-14-2基因组全序列的测定

目的　对乙型脑炎减毒活疫苗SA14 1 4 2生产株进行全序列测定和分析 ,为进一步了解其基因组结构与疫苗减毒机制的关系及研究疫苗生产的遗传学质控标准奠定基础。方法　根据已发表的SA14 1 4 2株及SA14株的序列 ,设计 6对相互重叠片段的引物 ,通过RT PCR扩增出SA14 1 4 2疫苗生产株的cDNA片段 ,分别克隆到pGEM T载体 ,转化至TG1受体菌中 ,挑取阳性克隆进行鉴定后测定全序列。结果　SA14 1 4 2生产株基因组全序列长 1 0 976个核苷酸 ,96到 1 0 3 94为一个长开放读码框 ,编码 3 43 2个氨基酸。与国外测定的SA14和SA14 1 4 2株的核苷酸序列和氨基酸序列相比 ,同源性均在 99%以上 ,突变位点分散于各个区域 ,以往推测的 7个可能与减毒相关的位点均未发生改变。1 2 96～ 1 50 6间有 4个突变位点 ,有可能作为疫苗质控的遗传学标记。结论　乙脑减毒活疫苗生产株的基因组全序列基本类似于已发表的序列 ,若干不同位点产生的原因可能在于病毒株的不同传代。全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理及疫苗的遗传学质控标准具有一定意义。     

从病毒性脑炎患者标本分离的基因I型乙脑病毒全基因组序列特征研究

目的通过现代分子生物学理论与技术测定和分析了从脑炎患者脑脊液标本分离的基因I型乙脑病毒（GZ56株）全基因组序列特征,以了解其致病性的分子基础。方法采用RT．PCR法和核酸序列测定法获得病毒基因组全序列,并利用DNASTAR、ClustalX version2．0．9及MEGAversion4．1等生物学软件分析该乙型脑炎病毒核苷酸序列、氨基酸序列及系统进化等。结果研究结果表明从病毒性脑炎患者脑脊液标本分离的基因I型乙脑病毒（GZ56株）基因组全长为10965nt,编码3432个氨基酸。病毒全基因组分子进化分析显示GZ56株全基因组与国际上第一株从蚊虫分离的基因I型乙脑病毒（M-28株）处于同一进化分支。GZ56株与其他基因I型乙脑病毒核昔酸和氨基酸序列同源性分别为96．2％～98．6％和98．2％～99．7％。病毒E基因与乙脑病毒灭活疫苗株P3相比存在11个氨基酸差异位点,而与乙脑病毒减毒活疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白上存在14个氨基酸差异位点。结论本研究提示,从病毒性脑炎患者标本分离的基因I型乙脑病毒全基因组未见明显变化,从基因组水平可以推测该病毒可以被现行的乙脑疫苗所保护。     

乙型脑炎病毒减毒活疫苗生产株SA14—14—2基因组全序列的测定

目的：对乙型脑炎减毒活疫苗SA14－14－2生产株进行全序列测定和分析,为进一步了解其基因组结构与疫苗减毒机制的关系及研究疫苗生产的遗传学质控标准奠定基础。方法：根据已发表的SA14－14－2株及SA14株的序列,设计6对相互重叠片段的引物,通过RT－PCR扩增出SA14－14－2疫苗生产株的cDNA片段,分别克隆到pGEM-T载体,转化至TG1受体菌中,挑取阳性克隆进行鉴定后测定全序列。结果：SA14－140－2生产株基因组全序列长10976个核苷酸,96到10394为一个长开放读码框,编码3432个氨基酸。与国外测定的SA14和SA14－14－2株的核苷酸序列和氨基酸序列相比,同源性均在99％以上,突变位点分散于各个区域,以往推测的7个可能与减毒相关的位点均未发生改变。1296－1506间有4个突变位点,有可能作为疫苗质控的遗传学标记。结论：乙脑减毒活疫苗生产株的基因组全序列基本类似于已发表的序列,若干不同位点产生的原因可能在于病毒株的不同传代。全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理及疫苗的遗传学质控标准具有一定意义。     

从辽宁省再次分离到基因1型乙型脑炎病毒

目的 了解2007年在辽宁省分离的乙型脑炎病毒基因型别及其病毒E基因分子特征.方法2006年8月在辽宁省东港市采集蚊虫标本,利用组织培养细胞进行病毒分离,对病毒分离物进行血清学和分子生物学鉴定.结果从采集的30批,共1500只三带喙库蚊标本中分离到2株病毒,命名为LNDG07-02、LNDG07-16,经鉴定均为基因1型乙脑病毒.病毒E基因区段核苷酸和氨基酸序列与乙脑减毒活疫苗株(SA14-14-2株)的同源性分别为87.8%～88.0%和97.2%,新分离病毒E基因区段与疫苗株存在11处氨基酸位点差异,与2002年在辽宁省分离的乙脑病毒相比,未发现氨基酸位点变异.结论自2002年以来在东港市再次分离到基因1型乙脑病毒,与2002年在辽宁分离的基因1型乙脑病毒相比E基因区段氨基酸未发生变异.基因1型乙脑病毒在辽宁省东港市持续存在.     

山东省新分离乙脑病毒(SD08-10株)全基因组序列特征

目的 对山东省新分离乙脑病毒SD08-10株进行全基因组序列测定和分析,全面了解其基因组特征.方法 设计乙脑病毒全基因组序列扩增引物,RT-PCR扩增片段,PCR产物直接测序,拼接后获得全基因组序列.采用Clestal X(1.8)、DNAStar、GENEDOC(3.2)、Mega(4.0)等生物学软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析.结果 新分离乙脑病毒SD08-10株基因组全长10 965个核苷酸,从97位到10 392位,共10 296个核苷酸编码一个开放阅读框,编码3432个氨基酸.与GenBank登录的所有59株乙脑病毒全基因组序列比较发现,其核苷酸总体差异率为0.7%～18.9%,氨基酸总体差异率为0.1%～5.2%.与目前使用的减毒活疫苗株SA-14-14-2株相比较,全基因组共存在1253个核苷酸差异,82个氨基酸差异.全基因组序列系统进化分析显示SD08-10属于基因Ⅰ型乙脑病毒.结论 新分离的乙脑病毒SD08-10株属于基因Ⅰ型,与2007年中国分离株SH17M-07进化关系最接近.     

2008年甘肃省新分离乙脑病毒的分子生物学特征

目的 对2008年甘肃省新分离乙脑病毒的PrM和E基因区段进行序列测定和分析,明确新分离病毒的基因型别并对E基因序列的分子特征进行分析.方法 对新分离乙脑病毒的PrM和E基因区段进行PCR扩增并测定序列.使用ClustalX2.09、MegAlign和Mega4软件对核苷酸和氨基酸序列进行分析并绘制系统发生树.结果 系统进化分析结果显示6株病毒均为基因Ⅰ型乙脑病毒,并且与2001和2002年越南分离株、2004年日本分离株及2004年我国四川省分离株进化关系较近.新分离株与减毒活疫苗株SA14-14-2相比,E基因核苷酸同源性为87.5%～87.9%,氨基酸同源性为96.8%～97.2%.新分离株与疫苗株在E基因区段存在11处共同位点的氨基酸差异.结论 2008年甘肃省分离的乙脑病毒均为基因Ⅰ型乙脑病毒,新分离株E基因氨基酸序列与疫苗株相比有部分差异,但均不属于决定抗原性的关键位点.     

四川省分离的基因1型乙型脑炎病毒分子特征分析

目的 从四川省巴中市采集的蚊虫标本中分离乙型脑炎(简称乙脑)病毒(JEV),确定其基因型别,并分析相关的基因1型乙脑病毒PrM和E基因区段氨基酸序列特征.方法 对2004年采集蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙脑病毒进行生物学、血清学及分子生物学鉴定.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA4软件完成病毒进化分析,GENEDOC(3.2)软件完成氨基酸位点分析,根据蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白三维结构模拟预测分析.结果 共采集4668只蚊虫标本,主要是骚扰阿蚊和库蚊,分离到6株病毒,经鉴定均属于基因1型的乙脑病毒.将四川省分离的6个毒株结合我国新分离的基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株SA14-14-2株的PrM区段和E区段氨基酸比较,发现PrM区段在PrM2、64和65位存在基因1型乙脑病毒独有的氨基酸位点差异,E区段存在14处共同的氨基酸位点差异,其中在E129、222、327和366位点为中国目前分离到的基因1型乙脑病毒所特有的位点特征.结论 从四川省巴中市首次分离到基因1型的乙脑病毒,并发现基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株之间PrM、E基因区段存在氨基酸差异,但现行疫苗株理论上可以保护新分离的基因1型乙脑病毒.     

四川省分离的基因1型乙型脑炎病毒分子特征分析

目的 从四川省巴中市采集的蚊虫标本中分离乙型脑炎(简称乙脑)病毒(JEV),确定其基因型别,并分析相关的基因1型乙脑病毒PrM和E基因区段氨基酸序列特征.方法 对2004年采集蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙脑病毒进行生物学、血清学及分子生物学鉴定.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA4软件完成病毒进化分析,GENEDOC(3.2)软件完成氨基酸位点分析,根据蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白三维结构模拟预测分析.结果 共采集4668只蚊虫标本,主要是骚扰阿蚊和库蚊,分离到6株病毒,经鉴定均属于基因1型的乙脑病毒.将四川省分离的6个毒株结合我国新分离的基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株SA14-14-2株的PrM区段和E区段氨基酸比较,发现PrM区段在PrM2、64和65位存在基因1型乙脑病毒独有的氨基酸位点差异,E区段存在14处共同的氨基酸位点差异,其中在E129、222、327和366位点为中国目前分离到的基因1型乙脑病毒所特有的位点特征.结论 从四川省巴中市首次分离到基因1型的乙脑病毒,并发现基因1型乙脑病毒与减毒活疫苗株之间PrM、E基因区段存在氨基酸差异,但现行疫苗株理论上可以保护新分离的基因1型乙脑病毒.     

乙型脑炎病毒活疫苗生产株SA14-14-2的感染性克隆构建

目的　构建乙型脑炎病毒 (乙脑病毒 )活疫苗生产株SA1 4 14 2的感染性克隆。方法　在对SA1 4 14 2株全长基因组测序基础上 ,引入适当酶切位点和T7RNA聚合酶启动子 ,采用分部连接策略 ,获得全长基因组cDNA ,体外转录RNA后 ,转染细胞获得感染性克隆 ,病毒传代培养、抗体中和试验和乳鼠脑腔攻击试验鉴定病毒。结果　由疫苗株cDNA构建了病毒感染性克隆 ,经鉴定为乙脑病毒 ,且病毒毒力比野毒株弱。结论　获得了乙脑病毒活疫苗生产株SA1 4 14 2的感染性克隆 ,为进一步研究疫苗的减毒机理及开发新一代疫苗奠定了基础     

河南省唐河县分离到基因1型乙型脑炎病毒

目的 从河南省唐河县采集的蚊虫标本中分离乙型脑炎病毒(JEV)并确定其基因分型及E基因区段氨基酸序列特征.方法对2004年采集蚊虫标本进行病毒分离,对新分离的乙脑病毒进行生物学、血清学及分子生物学鉴定.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增新分离JEV的PrM、E区段核苷酸序列,测序后应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA3.1完成病毒进化分析,GENEDOS(3.2)软件完成氨基酸位点分析.结果共采集3722只蚊虫标本,包括:库蚊、骚扰阿蚊、伊蚊及按蚊.从库蚊标本中分离到3株属于基因1型的乙脑病毒,E区段核苷酸和氨基酸与减毒活疫苗株SA14-14-2株的同源性分别为86.9%～87.7%,氨基酸同源性为95.2%～97.0%,存在12处共同的氨基酸位点差异.结论从河南省唐河县首次分离到基因1型的乙脑病毒.E基因与疫苗株相比有部分氨基酸差异,但现行疫苗株理论上可以保护新分离乙脑病毒.     

我国新分离乙脑病毒02-76株的全基因序列特征

目的对我国新分离乙脑病毒02-76株进行全基因序列测定和分析，了解乙脑病毒基因组结构及毒力特性。方法设计乙脑病毒全基因组扩增引物，RT-PCR扩增片段，PCR产物直接测序，拼接后获得全基因序列。通过Clustal X（1．8）、DNASTAR、GENEDOC（3．2）等生物学软件进行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析。结果新分离乙脑病毒02．76株全基因组全长10977个核苷酸，从96位到10391位，共10296个核苷酸编码一个开放阅读框，编码3432个氨基酸。与我国1949年分离的Beijing-1株相比较共存在248个核苷酸差异，16个氨基酸差异。与GenBank中选择的29株乙脑病毒全基因序列比较发现，其核苷酸总体差异率为0．6％-15．1％，氨基酸总体差异率为0．2％-4．6％。通过PrM／C区段、E区段、3’NTR区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因3型乙脑病毒。结论新分离的乙脑病毒02-76株属于基因3型，与中国分离株SA-14进化关系最接近。     

乙脑病毒持续感染模型中变异株性状及NS3区序列分析

目的　研究乙脑病毒变异性状与NS3区基因序列的关系。方法　应用乙脑病毒野生株及一种人肝癌细胞KN73建立持续感染模型 ,采用标准胰蛋白酶消化技术进行细胞传代 ,经反复冻融法收集细胞内变异病毒。采用BHK细胞空斑实验方法进行病毒滴定 ,利用NS3区特异引物进行逆转录 多聚酶链反应以获NS3区基因片段 ,应用ABI PRSMTM310测序系统进行序列分析。结果　在早期 (感染后 2 4～ 36h)细胞培养液中病毒量为 10 6PFU/ml,在后期 (感染后 3年 )细胞培养液中病毒量为10 3～ 4 PFU/ml,细胞内病毒含量一直维持在 10 2～ 3PFU/ml水平。NS3区测序结果可见 :位于核苷酸碱基序列上第 6 6位C→U ,第 72位A→C ,第 2 94位U→C ,第 30 6位A→G及第 342位A→G ,但相应编码的氨基酸未发生变异。结论　变异株存在性状变异 ,即增殖性低于野生株 ;NS3区编码蛋白对野生株及变异株均至关重要 ,亦提示病毒性状变异的原因可能由其它区域蛋白变异或病毒与宿主间蛋白相互作用所致     

2022年江苏省牲畜棚蚊虫种群及重要蚊媒黄病毒携带情况研究

为调查江苏省不同地区牲畜棚蚊虫种群分布及虫媒病毒携带情况，2022年7—9月选择江苏省南京、宿迁、连云港、泰州和镇江5个地区的牲畜棚生境，用诱蚊灯法采集蚊虫样本，通过分子生物学方法检测蚊虫携带的病毒，测序后利用生物信息学软件对病毒序列进行分析。结果显示，采集到蚊虫4属5种共3 795只，其中三带喙库蚊为优势蚊种，占采集蚊虫总数的85.71%。从南京、宿迁、连云港的三带喙库蚊样本中共检测出4株乙脑病毒，批阳性率为3.67%,其他病毒均未检出。对其中南京和宿迁2株乙脑病毒的E基因序列构建系统进化树，发现均属于基因Ⅰ-b型，与基因Ⅰ-b型毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别在95.4%、97.0%以上。与疫苗株SA14-14-2在E蛋白上存在14个氨基酸差异位点，但是不在影响抗原抗体结合的区域。在毒力关键位点上与SA14-14-2疫苗株完全不同，与近几年江苏分离株却完全相同。结果表明，江苏省蚊虫仍具有乙脑传播风险，应加强蚊虫监测与防制工作。     

浙江省基因Ⅰ型乙脑病毒全基因序列的测定及分析

目的 为了获得浙江省乙脑病毒基因组详尽的资料,研究基因Ⅰ型乙脑病毒的分子特征及变异程度,为乙脑病毒分子流行病学及其基因研究提供科学依据.方法 设计特异性引物、RT-PCR分段扩增XJ69和XJP613株全基因,PER产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定.通过生物学软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析和病毒的系统进化分析.结果 新分离乙脑病毒XJ69和NJP613株全基因组全长均为10 964个核苷酸,含有一个开放阅读框架,编码3432个氨基酸.与GenBank中选择的32株乙脑病毒全基因序列比较发现,其核苷酸同源为83.5%～99.2%,氨基酸总体同源性为97.5%～99.7%.通过PrM/C区段、E区段及全基因序列进行系统进化分析均显示该毒株属于基因Ⅰ型乙脑病毒.结论 新分离的乙脑病毒XJ69和XJP613株属于基因Ⅰ型,与上海三带喙库蚊分离株SH17M-07关系最为接近.     

乙型脑炎野毒株和弱毒株（SA14-14-2）在豚鼠体内的病毒血症比较试验

目的 利用豚鼠病毒血症的产生强度对乙型脑炎野毒株和弱毒株病毒毒力进行评价.方法 以不同乙脑野毒株和减毒株及其母株病毒分别接种豚鼠,观察不同时间产生病毒血症的水平.结果 接种后1 d和3 d,不同乙脑野毒株均可检测到不同水平的病毒血症（1.00～3.40 lg pfu）,以相同滴度（104pfu）的病毒接种豚鼠时,疫苗株母株SA14产生较高水平的毒血症（2.41～3.40 lg pfu）并至少持续3 d,而SA14-14-2疫苗株未产生毒血症.结论 豚鼠病毒血症的产生强度可以作为一种新的方法对乙型脑炎病毒的减毒和疫苗株的毒力进行评价.     

武汉市新分离2株乙型脑炎病毒E基因分型及序列分析

目的 对2009年武汉市新分离的2株乙型脑炎（简称乙脑）病毒进行基因分型和序列分析,了解本地乙脑病毒株的分子生物学特性。方法 将2009年从三带喙库蚊中分离的两株乙型脑炎病毒用RT-PCR法扩增E基因,将其进行测序,并用DNAstar and MegAlign软件与其他基因型代表株进行比对。结果 16组样品检出两株阳性（WHJX9-09、WHJX10-09）,这两株阳性均属于GI型。两株新分离JEV之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9％和100％。同目前在武汉市使用的疫苗株SA-14-14-2相比,核苷酸同源性分别为87.4％、87.9％,氨基酸同源性为96.9％。共有15个氨基酸发生变异分布在3个不同结构域,中和位点没有变异但是神经毒力位点仍然存在。结论 武汉市本地新分离乙脑病毒基因型为GI型,不同于1988年在武汉检出的GⅢ型的基因型,和疫苗株SA-14-14-2相比,其神经毒力并没有减弱,但疫苗产生的抗体对新出现的GI型乙脑病毒仍有中和作用。因此提高乙脑疫苗的接种率并配合防蚊灭蚊措施对控制乙脑疫情依然至关重要。同时有必要对本市蚊虫及乙脑患者进行长期的病原学监测工作,为乙脑预测预警体系的建立提供科学依据。     

福建省新分离3株乙型脑炎病毒的分子特征鉴定

目的　确定福建省新分离乙型脑炎病毒 (JEV)的基因分型及其E区段氨基酸序列特征。方法　用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增并克隆新分离JEV(0 2 4 1、0 2 4 3、0 2 10 2 )的PrM、E区段核苷酸序列 ,测序后应用ClustalX软件做碱基配对和比较分析 ,种系发生采用PHYLIP软件包分析。结果　新分离的 3株JEV属于基因Ⅲ型 ,E区段核苷酸和氨基酸与减毒活疫苗株SA 14 14 2株的同源性均在 96 %以上 ,在关键结构域有部分氨基酸差异。结论　福建省新分离的 3株病毒属于基因Ⅲ型JEV ,E蛋白与疫苗株相比有部分氨基酸差异     

四川省流行性乙型脑炎病毒优势基因型的研究

目的了解四川省乙脑主要流行区乙脑病毒的分子生物学特性,为防治提供依据。方法对2007-2010年间分离到的13株乙脑病毒进行PreM和E基因区扩增,采用MEGA5生物学软件完成氨基酸序列和病毒进化树分析。结果基因分型显示13株均属于基因I型。13株病毒之间比较,PreM基因核苷酸和氨基酸同源性为97％-100％和98．7％-100％,E基因核苷酸和氨基酸同源性为97．8％～99．9％和99．6％～100％,其同源性极高。13株病毒与2004年四川分离株比较E基因核苷酸同源性在97．7％～99．6％之间,氨基酸同源性在98．6％-100％之间;PreM基因的核苷酸同源性在96．2％-99．1％之间,氨基酸同源性在97．5％-98．7％之间;与疫苗株P3和SA14—14—2比较E基因核苷酸和氨基酸同源性分别为87．6％～88．3％和97％～97．8％;PreM基因核苷酸和氨基酸同源性分别为84．1％～85．8％和93．7％-96．2％。13株病毒E基因的8个氨基酸毒力位点均没有发生改变。结论四川省乙脑病毒已呈现基因I型为优势型别的态势,其PreM和E区核苷酸和氨基酸高度保守,关键的氨基酸毒力位点没有变化,提示目前使用的疫苗对流行株的感染具有保护作用。