宁波地区急性腹泻患者副溶血弧菌表型及分子特征研究

摘要：目的：了解宁波地区急性腹泻患者中副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VP)分布及分子分型特征。 方法：对2012年4~10月宁波地区VP临床分离株进行血清型分型;用PCR检测毒力基因tlh、tdh和trh;对所有菌株进行多位点序列分型(MLST)分析。 结果：962份急性腹泻患者粪便标本中71份VP阳性,分离率为7.38%;71株菌分属17种血清型,O3:K6是最主要的血清型,共44株（61.97%）,其次是O4:K8(5株);毒力基因检测发现71株tlh均呈阳性（100%）,70株tdh阳性98.59%,仅3株trh阳性。MLST分析发现13种序列型（STs）,主要为ST3型45株,占63.38%。 结论：宁波地区急性腹泻患者中VP分离株以O3:K6血清型为主,ST3型为优势序列型。     

全基因组数据应用于多克隆副溶血弧菌感染暴发的病原学分析

目的应用实时荧光PCR方法和基因组重测序分析等技术对一起副溶血弧菌（VP）导致的腹泻暴发事件进行病原学分析。方法收集暴发事件的病例信息,采集病例样本,使用实时荧光PCR方法筛选常见腹泻致病菌,分离鉴定VP并进行血清型鉴定,检测菌株毒力基因,采用微量肉汤稀释法检测菌株对抗菌药物的敏感性,使用全基因组测序技术进行菌株的遗传学分析。结果9份肛拭子共分离出13株VP菌株,其中O4∶KUT血清型7株（trh–/tdh+）,O1∶KUT血清型6株（5株trh+/tdh+,1株trh–/tdh–）。在检测的30种抗菌药物中,所有菌株仅对氨苄西林耐药,对其他29种抗菌药物均敏感。在基于全基因组序列的遗传学分析中,13株VP形成4个相互独立且遗传距离较远的分支,Lineage 1（O4∶KUT、trh–/tdh+,2株）、Lineage 2（O1∶KUT、trh–/tdh–,1株）、Lineage 3（O1∶KUT、trh+/tdh+,5株）和Lineage 4（O4∶KUT、trh–/tdh+,5株）,其中3例患者由来源于3个不同遗传分支的VP混合感染。结论本次事件由多血清型、多克隆的VP感染导致,基因组重测序技术在腹泻病暴发的病原分析中有较好的应用前景。     

基于多重PCR的副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因检测方法的建立与评价

目的 基于多重聚合酶链反应（PCR）建立一种快速方便的检测副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因的方法。方法 结合副溶血弧菌大流行菌群的群特异鉴定方法GS-PCR,与副溶血弧菌致病相关的耐热直接溶血素基因（tdh）和耐热直接溶血素相关溶血素基因（trh）序列设计引物,建立并优化多重PCR检测方法。用已知的大流行菌株和非大流行临床分离株,对其进行特异性、灵敏度等性能的评价。并对224株食品分离株和3株临床分离株副溶血弧菌进行了再鉴定。结果 副溶血弧菌大流行菌群有群特异PCR标识基因和tdh扩增条带。而其他细菌扩增结果呈阴性。检测灵敏度可达到105 CFU/ml。对实验室保存的224株食品分离株和3株临床分离株进行再鉴定表明,其中5株为副溶血弧菌大流行菌群,其中3株为tdh阳性、trh阴性,2株tdh、trh均阴性。结论 本研究所建立的多重PCR方法特异性好、灵敏度高。为副溶血弧菌大流行菌群及其毒力基因的快速大规模检测提供良好的技术支持。     

2016-2019年江苏省南京市人感染副溶血弧菌分子特征分析

  目的  了解江苏省南京市副溶血弧菌临床分离株的分子特征,为其防控提供参考。  方法  收集2016—2019年从腹泻和食物中毒患者分离的副溶血弧菌临床分离株并进行血清型分型,运用聚合酶链式反应（PCR）方法检测菌株的tlh、tdh、trh、toxRS/new、ORF8五种毒力基因,采用多位点序列分型（MLST）对菌株进行分子分型分析。  结果  2016—2019年共收集93株临床分离株,菌株优势血清型为O3∶K6（65/93,69.9%）,均携带tlh基因,73株属于tdh+trh- toxRS/new+的大流行菌群,非大流行菌群菌株中有5株为tdh-trh-非致病株。 共检出13个ST型,以ST3为主（68/93,73.1%）。  结论  南京地区副溶血弧菌以O3∶K6、ST3型大流行菌群菌株为主,非大流行菌群、非致病株并存。     

食源性腹泻副溶血弧菌分离株调查分析

目的 分析食源性腹泻患者副溶血弧菌（VP）季节分布及感染患者年龄特征、毒力基因、血清学分型.方法 对2014年1月至2016年12月急性腹泻患者粪便分离的125株副溶血弧菌进行常规培养、血清分型及PCR毒力基因检测.结果 副溶血弧菌感染发生有明显的季节性,夏秋季高发,尤以6～10月份为高峰期.感染患者中21～30岁占37.6％,31～40岁占24.8％.分离得到17个血清型,其中O3：K6占59.2％.经单重PCR进行毒力基因检测显示：tdh＋/trh-分离株所占比例为88.0％,tdh-/trh-分离株为6.40％,检测到2株携带（tdh＋/trh＋）基因.结论 湖州地区副溶血性弧菌感染发生呈明显的季节分布特征,且感染的患者以青壮年居多,优势血清型为O3：K6;多数菌株携带tdh＋/trh-毒力基因.     

副溶血弧菌病原学流行规律以及特征分析

目的 对宁波市镇海区腹泻患者副溶血性弧菌(VP)流行病学规律以及特征进行分析,从中发现其病原生物学特性并观察患者发生VP感染的危险因素,为控制VP引起的食物中毒提供参考数据。方法 选取2020年1月至2022年2月期间收集腹泻患者粪便标本共515份,共检测出VP菌株共121株(占比23.49%),对VP菌株进行血清分群分析,采用PCR方法对VP菌株中tdh和trh毒力基因进行检测,并完成药敏试验。观察VP感染患者血清分群结果,其毒力基因检测结果及药敏试验结果,观察121例VP感染患者的临床特征,采用二元Logistic回归分析发生VP感染的危险因素。结果 121株分离自患者粪便的副溶血性弧菌经血清凝集后显示O3群-共97株(占比80.17%),O4群共21株(占比17.36%),O10群发现2株(占比1.65%),O8群发现1株(占比0.83%);121株菌株毒力基因tdh均为阳性,trh均为阴性;VP菌株对氨苄西林(AMP)耐药率最高为85.12%,其他三代头孢菌素、氟喹诺酮类比较敏感分别为100%。收集VP菌株对应患者的临床资料情况,存在87.60%的VP感染患者排泄粪便呈水样,2...     

临床副溶血弧菌血清型及基因分型特征研究

目的了解本地区腹泻患者中副溶血弧菌(VP)血清型及分子分型特征,为VP感染的防控提供科学参考。方法对2010~2014年收集到的62菌株进行血清型分型;采用PCR检测溶血素相关毒力基因(tdh和trh);利用多位点序列分型(MLST)进行分子分型。结果 62株菌株分属7种不同的血清型,O3∶K6型居首,共46株,占74.19%,其次是O4∶K68(6株)。毒力相关基因检测发现tdh阳性株占95.16%(59株),而trh阳性者仅3株。分子分型确定7种STs,其中ST3型占85.50%(53株),其他ST型散在分布。结论 O3∶K6血清型VP是本地区最主要的分离株,大多携带tdh毒力基因,ST3型是优势流行型别。     

镇江地区2018年不同来源副溶血性弧菌毒力基因及耐药性分析

目的:分析镇江地区2018年不同来源副溶血性弧菌的检出、毒力基因分布及耐药性。方法:对2018年食品风险监测中要求的食品和疾病病例进行副溶血性弧菌病原学检测,用荧光定量PCR法对副溶血性弧菌菌株进行毒力基因tlh、tdh、trh检测,用微量肉汤稀释法进行15种抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)测定。结果:食品、疾病患者样本的检出率分别为60.00%(21/35)和1.48%(9/608),差异有统计学意义(χ^2=241.82,P<0.01)。30株副溶血性弧菌tlh基因均阳性,食品来源菌株(食品株)tdh基因和trh基因均为阴性;疾病来源菌株(疾病株)tdh基因和trh基因的检出率分别为88.89%和11.11%。食品株和疾病株对头孢唑啉、氨苄西林和红霉素的耐药率较高,食品株分别为100.00%、66.67%和66.67%,疾病株分别为100.00%、88.89%和88.89%;疾病株和食品株的多重耐药率分别为77.78%和52.38%,多重耐药谱均以氨苄西林+头孢唑啉+红霉素为主。结论:镇江地区食品和疾病样本中副溶血性弧菌的检出率存在明显差异,疾病株的毒力基因、耐药率及多重耐药性高于食品株,多重耐药谱相对单一。     

2010年杭州市下城区水产品中 副溶血性弧菌的污染调查

目的 调查杭州市下城区各大农贸市场水产品中副溶血性弧菌(VP)的污染情况。 方法 2010年采集下城区各大农贸市场水产品100份,按国标方法进行VP的分离与鉴定;对分离出的VP做血清分型,耐药性检测,并采用PCR法检测其种特异性基因(R72H)和毒力基因(tdh、trh)。 结果 共分离到24株VP,种特异性基因R72H全为阳性,其中2株毒力基因tdh阳性、trh阴性,其余22株tdh和trh均为阴性。 结论 虽然本次分离到的VP绝大部分都不携带tdh、trh毒力基因,但VP是历年来本辖区内引起食物中毒的主要病原菌,故仍有必要加强对水产品中VP的监测管理。     

多菌型副溶血性弧菌共感染引起集中事件调查分析

目的 分析一起副溶血性弧菌（VP）集中感染事件的菌株特征,明确该起感染事件的性质。方法 在2017年9月,广西某乡镇发生一起疑似食源性疾病暴发,现场采集13例患者肛拭子,分离到10株VP,利用O和K诊断血清对分离株进行玻片凝集实验分型,采用TaqMan水解探针荧光PCR检测分离株毒力相关tlh、tdh、trh和ORF8基因,并分别用Not Ⅰ和Sfi Ⅰ两种酶进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型,导入Bionumerics 6.6软件进行聚类分析。结果 10株VP有5种血清型,6株为O3∶K6,其余4株血清型分别为O4∶K8、O1∶KUT、O2∶KUT和O10∶K19。所有菌株tlh基因均呈阳性,而trh基因呈阴性;6株O3∶K6血清型菌株和1株O4∶K8血清型菌株tdh基因均呈阳性;其余3株tdh基因呈阴性。经Bionumerics 6.6软件聚类分析,Not Ⅰ和Sfi Ⅰ酶切PFGE有8种型别,同为O3∶K6血清型的6株菌可分为4种型别。综合以上3个指标进行分析,该事件分离的10株菌中仅2株菌完全相同。结论 该起集中暴发事件由多种血清、不同PFGE型别的致病和非致病性VP多菌型共感染引起。     

一起副溶血性弧菌引起食物中毒实验室溯源检测

目的 分析一起食物中毒中分离的副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)的血清群分布、毒力基因携带情况及分子分型特征,为溯源提供依据。 方法 血清凝集试验检测菌株血清型别,多重PCR方法检测Vp三种毒力基因tdh(耐热直接溶血素),trh(相对耐热直接溶血素)与tlh(不耐热溶血素)的携带情况。肠道细菌重复基因间共同序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence,ERIC)PCR分型技术分析不同来源菌株基因型特征。 结果 24株分离株中主要血清群为O3:K6(33.3%),均携带tlh基因、均不携带trh基因。66.7%(16/24)的菌株携带tdh基因,O3:K6血清群菌株均携带tdh基因。ERIC PCR分型分为3个克隆群:E1群包括4株O1,2株O2,O4、O5各1株,E2群包括3株O1,2株O5,O2、O4、O10各1株;E3群包括8株O3。 结论 该起食物中毒是由多种型别Vp引起。主要血清群为O3:K6,在食品与患者中都分离出该血清群的菌株,经ERIC分型,这些菌株来自同一个克隆群。除O3血清群外,从食品、加工存放食品的器具及患者中分离出其他不同血清群Vp,经ERIC分型,不同血清群分为2大克隆群,提示此次食物中毒的传染源可能与食品、加工存放食品器具污染Vp相关。     

基于CRISPR-Cas12a蛋白的副溶血弧菌及tdh基因检测分析

目的 将重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统相结合,建立一种快速检测并分型副溶血弧菌的检测方法.方法 通过纯化CRISPR相关蛋白Cas12a,设计和合成RAA引物、crRNA和单链DNA报告分子,建立副溶血弧菌的荧光和试纸条检测方法.采用煮沸法提取细菌核酸,经RAA扩...     

副溶血弧菌TaqMan双重实时-聚合酶链反应检测方法的建立

目的建立副溶血弧菌TaqMan实时-PCR和毒力基因TaqMan双重实时-PCR筛检的实验室检测方法。方法根据副溶血弧菌ItoxR/I基因的保守序列设计引物和TaqMan探针,建立检测副溶血弧菌的实时-PCR方法;根据副溶血弧菌耐热直接溶血素（thermostable direct hemolysin, Itdh/I）和耐热相关溶血素（thermostable related hemolysin, Itrh/I）基因的保守序列设计引物和探针,建立检测致病性副溶血弧菌毒力基因的双重TaqMan实时-PCR方法。对所建立的副溶血弧菌实时-PCR检测方法进行灵敏度和特异度评价。结果副溶血弧菌的检测下限为10sup2/sup拷贝/l,Itdh/I和Itrh/I双重实时PCR的检测下限为10sup2/sup拷贝/l。针对ItoxR/I基因建立的副溶血弧菌实时-PCR方法对11种其他弧菌和肠道细菌的染色体无扩增。结论建立的方法能够特异和敏感地检测副溶血弧菌,并能确定致病性副溶血弧菌的毒力基因,能作为副溶血弧菌的灵敏和快速检测方法。     

tdh+与tdh?副溶血弧菌耐药表型与基因型差异分析

  目的  描述tdh+与tdh?副溶血弧菌表型与基因型耐药差异,分析耐药基因型与耐药表型之间的关系。  方法  采用K-B纸片法检测208株tdh+与73株tdh?副溶血弧菌对临床及水产养殖中常用的7类16种抗生素的敏感性,使用新一代测序技术获得实验菌株的全基因序列,通过序列比对分析基因组中耐药基因及耐药相关基因突变情况。 分析耐药表型与基因型之间的关系。  结果  tdh+菌株和tdh?菌株对亚胺培南均100%敏感。 tdh+菌株对头孢吡肟、阿奇霉素耐药率（0.48%、8.65%）高于tdh?菌株（0.00%、4.11%）;tdh?菌株对氨苄西林、头孢西汀、头孢曲松、环丙沙星、萘啶酸、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、磺胺甲恶唑、复方新诺明、四环素、多西环素、氯霉素耐药率均高于tdh+菌株。 tdh?菌株的多重耐药率（34.25%）高于tdh+菌株（19.23%）。 耐药基因共检出5类7种,其中β-内酰胺类bla_CARB基因在所有的tdh+菌株和tdh?菌株均检出;四环素类tet（34）基因在tdh+与tdh?菌株基因携带率分别为99.52%、98.63%;喹诺酮类耐药基因qnrS5 仅在tdh+菌株中检出;tdh?菌株中叶酸代谢抑制类（sul2）、四环素类［tet（35）、tet（59）］、苯丙醇类（floR）耐药基因检出率高于tdh+菌株。 共在14株（tdh+9株,tdh?5株）细菌中检索出6种耐药基因点突变方式,均为编码16S rRNA的rrs基因突变。  结论  tdh?副溶血弧菌耐药现象较tdh+副溶血弧菌更为严重; 16S rRNA的rrs基因突变是除aph（3'）-Ib、aac（3）-Ⅱ、aac（6’） -I、aph（3'）-Id等耐药基因外副溶血弧菌对氨基糖胺类药物耐药的主要机制之一;副溶血弧菌中,可用bla_CARB耐药基因存在情况预测副溶血弧菌氨苄西林耐药表型;除此之外其余抗生素耐药表型与其对应耐药基因之间未见明确的对应的关系。     

2016-2020年上海市松江区腹泻患者副溶血弧菌耐药性与分子分型研究

目的 了解上海市松江区腹泻患者副溶血弧菌的毒力基因、耐药性和分子分型等,为预防食源性疾病提供科学依据.方法 参照WS 271-2007进行副溶血弧菌的检测和分离,并应用微量肉汤法进行药物敏感性试验,采用PCR方法检测毒力基因,并对菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型.结果 2016-2020年采集腹泻患者肛拭子标...     

Detection of the thermostable direct hemolysin gene (tdh) and the thermostable direct hemolysin-related hemolysin gene (trh) of Vibrio parahaemolyticus by polymerase chain reaction.

Polymerase chain reaction (PCR) protocols were established for specific detection of the tdh and trh genes, the virulence marker genes of Vibrio parahaemolyticus encoding two related hemolysins. The tdh and trh genes are known to have sequence divergence of up to 3.3% and 16%, respectively. Attempts were made to find suitable primer pairs and annealing temperatures to detect each gene without fail. DNAs extracted from 36 representative strains of V. parahaemolyticus were used in the initial screening with various combinations of primer pairs and annealing temperatures. The combinations of primer pairs and annealing temperatures selected were then tested with DNAs extracted from 227 more strains of V. parahaemolyticus and from 133 bacterial strains belonging to 40 species other than V. parahaemolyticus. PCR protocols (primer pairs and annealing temperatures) were established that gave identical results to those obtained with the tdh- and trh-specific polynucleotide probes. These protocols established for the tdh and trh genes could detect 400 fg (100 cells) of cellular DNA carrying the respective gene. Spike experiments demonstrated that the sensitivities of the established PCRs were reduced by a factor of 10(4)-10(5) by an inhibitor(s) present in a normal faecal sample, indicating the need for either DNA extraction or enrichment of the faecal sample in alkaline peptone water for 4 h before the PCR of faecal samples.