恶性疟原虫海南株CSP3’末端基因的克隆及序列分析

目的构建恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)CSP3’末端基因的原核表达载体，并对CSP3’末端基因进行序列测定。方法根据恶性疟原虫CSP编码的基因序列设计引物，采用PCR技术扩增出CSP3’末端基因，将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌JM109；阳性重组质粒经PCR、酶切鉴定，用双脱氧链末端终止法进行序列测定。结果从恶性疟原虫基因组中扩增出CSP3’末端基因，其片段大小为225bp，构建的阳性重组质粒pGEX-4T-1／CSP3’末端经PCR和酶切鉴定与预期结果一致，测序结果进一步确认了插入片段的正确性。结论成功地构建了CSP3’末端的原核重组质粒，为进一步研究其功能奠定了基础。     

恶性疟原虫海南株CTP基因的克隆测序及序列分析

目的 测定恶性疟原虫（P.f）海南株CTP基因序列,了解该虫株CTP基因序列与其它种类的CTP基因序列的差异,用于药物靶位的筛选。方法 用PCR的方法特异性的扩增CTP基因,并将此基因克隆于测序载体pUC19,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序。结果 我国海南株的CTP基因序列与其它的CTP基因有不同程度的差异。结论 P.f CTP作为潜在的抗疟药物靶值得进一步深入研究。     

恶性疟原虫海南株CSP3′末端基因的克隆及序列分析

目的　构建恶性疟原虫海南株 (FCC1 HN)CSP3′末端基因的原核表达载体 ,并对CSP3′末端基因进行序列测定。方法　根据恶性疟原虫CSP编码的基因序列设计引物 ,采用PCR技术扩增出CSP3′末端基因 ,将其克隆入原核表达载体pGEX 4T 1,转化大肠杆菌JM10 9;阳性重组质粒经PCR、酶切鉴定 ,用双脱氧链末端终止法进行序列测定。　结果　从恶性疟原虫基因组中扩增出CSP3′末端基因 ,其片段大小为 2 2 5bp ,构建的阳性重组质粒pGEX 4T 1 CSP3′末端经PCR和酶切鉴定与预期结果一致 ,测序结果进一步确认了插入片段的正确性。　结论　成功地构建了CSP3′末端的原核重组质粒 ,为进一步研究其功能奠定了基础。     

恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCCl／HN)侧翼核酸内切酶-1(FEN-1)基因序列，比较FCC1／HN株与国外分离株FEN-1基因序列的差异。方法 根据FEN-1基因已知序列设计合成1对引物，应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出FEN-1基因，构建重组质粒PMD18-T-FEN-1。阳性克隆的重组质粒经酶切鉴定后进行测序。应用DNAMAN分析软件进行不同分离株FEN-1基因序列的同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株FEN-1基因序列，基因全长1947bp，A T含量为56％，G C含量为44％。酶切鉴定获得了正确的PMD18-T-FEN-1重组质粒。测序表明，恶性疟原虫FCC1／HN株与国外Gambia株和3D7株的FEN-1基因序列有较高的同源性。结论 成功克隆恶性疟原虫FCC1／HN株FEN-1基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫FCC1／HN株与国外已报道各株的FEN-1基因序列有高度同源性。     

恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析

目的　克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)侧翼核酸内切酶 1(FEN 1)基因序列,比较 FCC1/HN株与国外分离株FEN 1基因序列的差异。　方法　根据 FEN 1 基因已知序列设计合成 1 对引物,应用 PCR技术从 FCC1/HN株基因组DNA中扩增出FEN 1基因,构建重组质粒PMD18 T FEN 1。阳性克隆的重组质粒经酶切鉴定后进行测序。应用DNAMAN分析软件进行不同分离株FEN 1基因序列的同源性比较。　结果　PCR扩增得到特异的 FCC1/HN株FEN 1基因序列,基因全长1 947 bp,A+T含量为56%,G+C含量为44%。酶切鉴定获得了正确的PMD18 T FEN 1重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株与国外Gambia株和3D7株的FEN 1基因序列有较高的同源性。结论　成功克隆恶性疟原虫FCC1/HN株FEN 1基因。序列测定及同源性分析表明,恶性疟原虫FCC1/HN株与国外已报道各株的FEN 1基因序列有高度同源性。     

恶性疟原虫FCC1／HN株特异基因片段的克隆及部分序列分析

本研究通过分离、培养恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ分离株，提取、纯化其基因组ＤＮＡ，用ＢａｍＨ１部分酶切，并克隆ｐＵＣ１８载体，转化受体菌株大肠杆菌ＪＭ１０３，用基因组ＤＮＡ探针筛选转化子，对杂交信号最强的克隆片段ｐＨＦ１作部分序列分析，在国内首次明确恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ特异ＤＮＡ部分序列。ｐＨＦ１克隆片段约１．２ｋｂ，两端分别测定了３２８和２７１个碱基。Ｇ＋Ｃ含量为２６．８％，并有较多的酶切位点，便于作亚克隆，该序列还可用作ＤＮＡ探针或ＰＣＲ扩增模板有较大实用价值。     

恶性疟原虫FCC1／HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶（GDH)基因并测定其序列,比较FCC1／HN株与国外分离株GDH基因序列的差异。方法 根据GDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增GDH基因,并将其克隆入pMD18-T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株GDH基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因全长1329bp,编码442个氨基酸。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株GDH基因;序列测定及同源性分析表明,FCC1／HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性。     

恶性疟原虫FCC1／HN株丙酮酸激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的 扩增恶性疟原虫海南株FCCl／HN的丙酮酸激酶(PK)的编码基因，构建其原核和真核表达重组质粒，测定其序列，并了解它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫3D7和人PK基因之间的差异。方法 根据3D7的PK基因设计合成一对引物，用PCR从FCCl／HN株基因组中扩增PK基因；将它分别定向克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1和真核表达质粒pcDNA3，分别转化大肠杆菌JM109感受态细菌；经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆，用双脱氧链末端终止法测定其序列，用生物信息学软件分析PK序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCCl／HN株PK基因，大小为2235bp，编码744个氨基酸。其氨基酸序列与3D7的同源性高达99．9％，与约氏疟原虫的同源性为70．2％，但与弓形虫和人的PK的同源性分别只有20．9％和21．6％～25．4％。结论 从FCCl／HN株基因组中获取了PK基因，成功构建了其原核和真核表达质粒，并测定了其序列；它与3D7的PK高度同源，但与人的PK基因同源性很低，可能是一个药物靶标。     

恶性疟原虫HRP—Ⅲ基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南（FCC1／HN）株HRP－Ⅲ基因序列,比较FCC1／HN株与国外分离株HRP－Ⅲ基因序列的差异。方法 根据HRP－Ⅲ基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增HRP－Ⅲ基因。通过定向克隆,构建真核表达重组质粒pcDNA3-HRP－Ⅲ。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用分子生物学软件进行不同分离株HRP－Ⅲ基因序列的同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的pcDNA3-HRP－Ⅲ重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因全长802bp包含一个内含子,编码224个氨基酸,序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的Itg2,FC27及IMTM22株HRP－Ⅲ基因序列有较高的同源性。结论 成功克隆恶性疟原虫FCC1／HN株HRP－Ⅲ基因。序列测定及同源性分离表明,FCC1／HN株与其它分离株的HRP－Ⅲ基因序列有高度的同源性。     

恶性疟原虫FCC1/HN株谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的克隆恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)谷氨酸脱氢酶(GDH)基因并测定其序列,比较FCC1/HN株与国外分离株GDH基因序列的差异.方法根据GDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增GDH基因,并将其克隆入pMD18-T载体.阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR鉴定后,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定.应用DNAstar软件比较不同分离株GDH基因序列的同源性.结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株GDH基因序列.酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-GDH重组质粒.测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因全长1 329 bp,编码442个氨基酸.序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的FCQ27、K1株GDH基因编码的氨基酸序列有少量的差异.结论克隆了恶性疟原虫FCC1/HN株GDH基因;序列测定及同源性分析表明,FCC1/HN株与其它分离株的GDH基因序列有较高的同源性.     

急性白血病端粒酶活性及端粒酶基因表达的研究

目的 :研究初发急性白血病 (AL)患者骨髓、外周血单个核细胞端粒酶活性及端粒酶逆转录酶基因(hTERT)的表达 ,探讨其临床意义。方法 :采用端粒酶PCR ELISA法检测 2 4例初治AL患者的端粒酶活性 ;采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测hTERT基因mRNA的表达水平。结果 :在 2 4例初发AL患者骨髓、外周血样本中 ,18例 (75 .0 % )表达端粒酶活性 ,其吸光度 (A )均值分别为 0 .5 38± 0 .0 6 2和 0 .4 6 3± 0 .0 5 4 ,而 12例正常人外周血中只有 1例表达端粒酶活性 A 均值为 0 .16± 0 .0 12 ,前二者分别与后者比较差异有极显著性意义 (P <0 .0 1)。在 2 4例AL患者中 ,19例 (79.2 % )表达hTERT基因mRNA。 2 4例AL骨髓样本中 ,17例既有端粒酶活性表达 ,又有hTERT基因mRNA表达 ,端粒酶活性的表达和hTERT基因mRNA的表达具有明显的一致性。结论 :初发AL患者骨髓、外周血细胞端粒酶活性及hTERT基因mRNA表达明显高于正常 ;AL患者细胞端粒酶活化与其hTERT表达密切相关。     

恶性疟原虫传播阻断抗原的化学拼接与克隆

采用缺口填补法将恶性疟原虫有性期Pfs230和Pfs48／45抗原中的2个T细胞表位，3个B细胞表位以及人白介素-Ⅰ中的一个T细胞激活位点按预设方案，拼接成复合多价基因PfSI。复合基因全长147bP，编码43肽复合抗原，经分离、纯化后，插入质粒pcDNA3的多克隆位点，构建重组载体pcDNA3／PfSI。再将重组载体转化大肠杆菌JM109，用氨苄青霉素和PCR扩增法筛选阳性克隆，最后用限制性内切酶对阳性克隆进行鉴定。复合基因PfSI拼接、克隆的成功为在体外高效表达恶性疟原虫传播阻断抗原创造了条件。     

恶性疟原虫FCC1/HN株醛缩酶编码区基因的克隆及表达

目的　克隆恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)株糖酵解醛缩酶 (ALD)编码区基因。　方法　利用已知ALD基因序列设计一对特异性引物,从基因组DNA中用PCR扩增ALD基因,将其克隆入pQE30载体,阳性克隆经酶切鉴定后测序,在此基础上将重组质粒转化大肠埃希菌M15进行表达。　结果　PCR扩增后获得特异性扩增片段,测序结果显示我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与恶性疟原虫3D7株ALD基因序列完全相同。重组融合蛋白通过镍 次氮基三乙酸(NiNTA)亲和层析及阳离子交换层析进行纯化。　结论　我国的恶性疟原虫FCC1/HN株与文献报道的恶性疟原虫3D7株ALD编码区基因序列相同,该融合蛋白在大肠埃希菌中获得表达     

恶性疟原虫海南株子孢子期SSU rRNA编码基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株子孢子期小亚基核糖体核糖核酸(SSU rRNA)编码基因片段,分析其序列特征.方法 根据恶性疟原虫基因库相关核酸序列设计1对引物,采用PCR方法从海南恶性疟患者血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSU rRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接,构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆经双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,采用BLAST软件分析其特征.结果 恶性疟原虫子孢子期SSU rRNA基因扩增片段大小约为347bp;阳性克隆重组质粒双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段;核酸序列测定显示插入的SSU rRNA基因扩增片段含有347个核苷酸,与GenBank中的恶性疟原虫3D7株相同序列进行比对,其同源性为100%,而与7G8株的同源性则为98.0%,其中第153位碱基发生了缺失,第184位碱基由C取代了T,而第188位T碱基与第189位A碱基为插入碱基,第243位碱基则由T取代了C.结论 成功克隆恶性疟原虫海南株孢子期SSU rRNA编码基因序列,该序列相对保守,不同地理株间存在单核苷酸多态性.     

端粒酶逆转录酶基因反义寡核苷酸抑制肺癌细胞端粒酶活性和诱导细胞凋亡

目的 研究端粒酶逆转录酶（hTERT)基因反义寡核苷酸（ASODN）对肺癌细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响。方法 实验分为ASODN组、正义寡核苷酸（SODN）组和空白对照组,所用ASODN和SODN的浓度分别为10μmol/L,脂质体为16mg/L,采用端粒重复扩增法、逆转录－聚合酶链反应、Western Blot及流式细胞术分别观察各组端粒酶活性、hTERP mRNA和蛋白质表达以及细胞凋亡。结果 ASODN组显著下调或抑制肺癌细胞端粒酶活性和hTERT表达,但直到第21天才出现细胞凋亡增多。结论 端粒酶活性与hTERT表达密切相关。     

人端粒酶催化亚单位的研究进展

人端粒酶是染色体末端的DNA蛋白酶，对维持染色体稳定至关重要，在细胞增殖、衰老、永生化及癌变中起重要作用。人端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶激活的主要限制因素，与肿瘤的发生发展密切相关，因此，认识其调控机制及在肿瘤诊治的研究广泛开展。目前，hTERT用于临床肿瘤诊断的意义已被认可，并且已有利用其进行肿瘤治疗的Ⅰ期临床试验。     

不同食管病变中端粒酶活性与端粒酶RNA组分、端粒酶逆转录催化亚单位的相关性及其意义

目的　探讨不同食管病变中端粒酶活性 (TA)、端粒酶RNA组分 (hTR)及端粒酶逆转录催化亚单位 (hTERT)的表达 ,彼此间相关性及其预后意义。方法　采用TRAP 银染、原位杂交及免疫组化技术检测TA、hTR及hTERT在 38例食管鳞癌组织、15例不典型增生及 12例正常食管粘膜中的表达情况。结果　食管鳞癌TA、hTR及hTERT的阳性表达率分别为 84 2 1%( 32 /38)、71 0 5 %( 2 7/38)及 81 5 8%( 31/38) ,不典型增生组织中TA、hTR及hTERT阳性表达率分别为 6 0 0 0 %( 9/15 )、33 33%( 5 /15 )及 40 0 0 %( 6 /15 ) ,与正常组织比较 ,具有显著性差异 (P <0 0 5 ) ,TA与hTR及hTERT的表达具有相关性 (P <0 0 5 )。TA、hTR及hTERT的表达与临床病理因素无关 (P >0 0 5 )。结论　TA、hTR及hTERT在食管癌的发生发展中起着重要作用 ;hTR及hTERT能够反应端粒酶活性 ,三者均为食管鳞癌恶性表型增高的标志 ;hTR及hTERT具有独立的预后意义。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株环子孢子蛋白基因片段的亚克隆及表达

目的 构建恶性疟原虫FCC－1／HN株CSP基因的重组真核表达质粒pBK－CSP,在大肠杆菌中进行表达,并进行鉴定。方法 采用限制性内切酶法从重组的大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒pBCG5.6/CSP中分离出经过测序鉴定的CSP基因片段,将其亚克隆于pBK－CMV真核表达载体,构建重组真核表达质粒pBK-CSP.经IPTG诱导,重组质粒在大肠杆菌DH5α中进行表达,并进行SDS－PAGE及免疫印迹分析。结果 从pBCG5.6/CSP中分离出SP基因片段,成功构建pBK-CSP重组质粒;SDS－PAGE及免疫印迹分析结果显示特异性蛋白条带的相对分子质量约为42000。结论 从pBCG5．6／CSP中成功分离出CSP基因片段,并成功构建pBK-CSP重组质粒,诱导表达CSP非融合蛋白,为恶性疟原虫DNA疫苗的研制奠定了基础。