Lactacystin诱导PC12细胞胞内嗜酸性包涵体动态变化的研究

目的 研究蛋白酶体抑制剂lactacystin诱导PC12细胞胞浆内嗜酸性包涵体的动态变化过程.方法 PC12细胞中加入不同浓度lactacystin(0、5、10、20μmol/L),孵育24 h后行HE染色及α-synuclein免疫组织化学染色,光镜观察包涵体变化;其中10 μmol/L lactacystin组分别于加入lactacystin后24、36、48、72、96和120 h行上述染色法,光镜观察包涵体变化.结果 lacatacystin作用于PC12细胞24 h后,HE染色显示随着浓度增加.胞浆中嗜伊红包涵体数量逐渐增多.0 μmol/L组胞浆中未看到包涵体,5 μmol/L组胞浆中有少量包涵体出现(3.33%±1.15%),10μmol/L组多数细胞胞浆出现典型球状包涵体(71.33%±4.16%),20μmol/L组几乎每个细胞胞浆中均出现嗜伊红包涵体(90.33%±3.21%),个别包涵体游离于细胞外;10 μmol/L组随着时间延长,包涵体逐渐从胞浆中游离至细胞外,其后胞浆逐渐缺失,在96 h和120 h时仅剩余胞核和球状包涵体.免疫组化染色显示:lactacystin作用24 h时,胞浆中α-synuclein免疫反应阳性物质逐渐由散在颗粒逐渐聚集成球状包涵体;随着浓度的增加和时间延长,α-synuclein染色阳性的球状包涵体游走于细胞外,胞浆逐渐缺失,至96 h和120 h时仅剩余胞核和包涵体.结论 lactacystin作用于PC12细胞后,早期在胞浆中出现散在的嗜酸性和α-synuclein免疫反应阳性的颗粒,随着浓度增加和时间延长,颗粒状物质在核旁聚集,最终形成固缩的包涵体,细胞外包涵体可独立存在.这种包涵体的动态变化过程与以人类帕金森病为代表的神经变性疾病中的包涵体非常相似,可以作为研究包涵体相关问题的有力工具.     

阻断泛素-蛋白酶体通路诱导PC12细胞死亡和泛素阳性包涵体生成

目的探讨泛素蛋白酶体通路的功能障碍对于多巴胺能细胞的活力以及胞质内包涵体生成的影响。方法应用蛋白酶体抑制剂lactacystin(5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L和20μmol/L)处理PC12细胞24h,MTT方法检测细胞活力,WesternBlot方法测定细胞内泛素化蛋白质水平,免疫荧光细胞化学染色观察泛素免疫阳性包涵体的生成。结果经5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L和20μmol/Llactacystin处理24h后,PC12细胞的活力显著降低(细胞存活率分别为81.5%±3.6%、75.4%±2.4%、70.2%±2.7%和60.4%±3.9%),呈现剂量依赖性。WesternBlot证实对照组细胞内未检测到相对高分子质量的泛素化蛋白质;随着lactacystin作用浓度的增加,细胞内相对高分子质量泛素化蛋白质的含量逐渐增高。免疫荧光染色显示对照组中仅有极少数细胞内含有泛素阳性包涵体;20μmol/Llactacystin处理组中含有泛素阳性包涵体的细胞数目显著增多(P<0.01)。结论泛素蛋白酶体通路的功能缺失能诱导多巴胺能细胞死亡,造成细胞内泛素化蛋白质积聚,促进胞质内泛素阳性包涵体的生成,可能在帕金森病黑质多巴胺能神经元变性死亡和Lewy小体形成中发挥重要作用。     

蛋白酶体抑制诱导的PC12细胞帕金森病模型

目的探讨蛋白酶体抑制剂对PC12细胞的作用以及用该药物制作帕金森病(PD)模型的可能性。方法用不同浓度蛋白酶体抑制剂PSI作用于PC12细胞24、48、72 h后,以MTT法检测细胞活性,荧光染色检测凋亡细胞百分率,HE染色观察细胞形态变化,透射电镜观察细胞超微结构变化。结果不同浓度PSI作用于PC12细胞24 h时,细胞存活率无变化;作用48~72 h时,1~20μmol/L PSI使细胞存活率分别降至47.03%~58.98%和19.58%~34.72%;凋亡细胞由1.15%升至5.27%。HE染色显示经PSI处理的PC12细胞胞浆内有嗜酸性包涵体出现,透射电镜下细胞呈凋亡的超微结构特点。结论PC12细胞蛋白酶体受抑模拟了PD的两大病理特点,蛋白酶体功能异常可能是PD的发病因素之一,短期抑制PC12细胞的蛋白酶体功能可作为PD的细胞模型。     

鱼藤酮建立帕金森病细胞模型的方法研究

目的探讨鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞建立帕金森病(Parkinson disease,PD)细胞模型的方法。方法实验分为空白对照组及鱼藤酮0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.5μmol/L、5.0μmol/L组共5组,各组分别于鱼藤酮加入24h、48h点,观察SH-SY5Y细胞形态变化,采用MTT比色法检测细胞活力;于24h时采用Western blot法检测细胞α-突触核蛋白(α-synuclein)表达量;对空白对照组及鱼藤酮0.5μmol/L、1.0μmol/L组于24h、48h行HE染色观察细胞内包涵体形成情况。以激光共聚焦免疫荧光法观察鱼藤酮1.0μmol/L组24h时α-synuclein的分布情况。结果空白对照组细胞生长较密,神经突起细长;在鱼藤酮药物组24时,0.5μmol/L组细胞突起变短,1.0μmol/L组细胞突起短缩更明显,2.5μmol/L组胞体肿胀明显,5.0μmol/L组圆缩细胞增多;各浓度组48h时与24h时比较,细胞突起变短、细胞肿胀、圆缩更明显。MTT试验显示1.0μmol/L鱼藤酮24h组和0.5μmol/L鱼藤酮48h组分别使细胞活性下降到空白对照组的(86.06±9.06)%和(62.06±7.13)%,与对照组比较差异均具有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示鱼藤酮0.5、1.0、2.5和5.0μmol/L组SH-SY5Y细胞内α-synuclein相对表达水平分别为(1.23±0.11)、(1.41±0.20)、(1.77±0.09)和(1.31±0.28),其中1.0μmol/L、2.5μmol/L鱼藤酮组α-synuclein水平高于空白对照组(P0.05);HE染色显示,在1.0μmol/L鱼藤酮24h组和0.5μmol/L鱼藤酮48h组均观察到细胞质内出现嗜伊红、边界清楚的类路易小体样包涵体;免疫荧光染色显示在1.0μmol/L鱼藤酮24h组观察到细胞内出现颗粒状α-synuclein免疫染色阳性聚集体,可被Thioflavin S共定位。结论 1.0μmol/L鱼藤酮24h诱导SH-SY5Y细胞所建立的PD模型能够很好地模拟PD病理改变,可作为研究PD发病机制的细胞模型。     

热休克蛋白对多巴胺能神经细胞的保护作用研究

目的探讨热休克蛋白(HSP)对蛋白酶体抑制剂处理的多巴胺能神经细胞的活力以及细胞内包涵体形成的影响。方法将PC12细胞进行热处理,免疫印迹法鉴定热休克蛋白表达,并确定最佳热处理条件;再应用高选择性的蛋白酶体抑制剂Lactacystin处理PC12细胞。MTT方法检测细胞活力,免疫荧光细胞化学染色观察细胞内包涵体形成的变化。结果免疫印迹法证实PC12细胞热处理2h后HSP70水平即开始迅速升高,一直持续至24h,其中4h的HSP70水平表达较高,故选其为最佳观察条件。未经热处理的对照组经5μM、10μM、15μM和20μMLactacystin处理24h后,PC12细胞的活力显著降低,呈剂量依赖性;热处理组的细胞活力比对照组显著升高,两者有显著性差异(P<0.01)。免疫荧光染色显示对照组细胞的胞浆内包涵体明显增多,而热处理组胞浆内包涵体明显减少。结论热休克蛋白能显著增强细胞活力,减少细胞内包涵体形成,对多巴胺能神经元可能有一定的保护作用。     

蛋白酶体抑制剂诱导多巴胺能神经元变性伴包涵体形成

目的 观察蛋白酶体抑制剂诱导黑质多巴胺(DA)能神经元变性伴胞浆内包涵体形成，探讨蛋白酶体功能在帕金森病发病机制中的作用。方法将蛋白酶体抑制剂Lactacystin立体定向注射至大鼠黑质部位。免疫荧光观察黑质区DA神经元变性缺失及胶质细胞变化。免疫荧光双标法观察DA能神经元内蛋白聚集的包涵体及其主要成分α-共核蛋白(α-synuclein)、Parkin和泛素(ubiquitin)的表达。同时观察。DA能神经元发生细胞凋亡。结果注射Lactacystin第7天大鼠开始出现自发性活动减少，阿扑吗啡可诱导出旋转行为；3周后黑质部位酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞减少，呈剂量依赖性；小胶质细胞增生明显。TH与硫磺素、硫磺素与α-synuclein、硫磺素与Parkin、以及硫磺素与ubiquitin复合染色呈阳性；TH与TUNEL双染亦呈阳性。结论Lactacystin对多巴胺能神经元具有毒性作用，且导致蛋白聚集，包涵体形成。蛋白酶体功能异常可能在帕金森发病机制中起重要作用。     

PSI诱导PC12细胞胞浆内胞核旁嗜酸性包涵体的形成及其演变过程

目的研究蛋白酶体抑制剂PSI诱导PC12细胞胞浆内嗜酸性包涵体的形成及演变过程。方法取进入对数生长期的PC12细胞，孵育24h后，加入PSI（终浓度10μmol／L），分别于给药后3、6、9、12、24、48、72、96、120h取出细胞并甩片固定，行HE染色及α—synuclein免疫组织化学染色，光镜下观察形态变化。结果HE染色：PSI作用6h后，PC12细胞胞浆呈现嗜伊红染色，胞体变大；至12h可见明显的嗜伊红聚集的核心；24h后，几乎所有的细胞都形成了核旁嗜伊红球状包涵体；其后，胞核及胞浆逐渐缺失，于120h仅余聚集的嗜伊红球状包涵体。免疫组化染色：PSI作用3h后，可见到散在于整个胞浆的α—synuclein免疫反应阳性颗粒；6h后，细胞明显增大，胞浆中颗粒增多；12h后，颗粒聚集更加明显，形成明显的聚集中心；24h后，几乎所有的细胞都形成了α—synuclein免疫反应阳性的球状包涵体；随时间延长，胞核及胞浆逐渐缺失，至120h仅见固缩的α—synuclein免疫反应阳性球状包涵体。结论PSI作用于PC12细胞，早期出现散在于胞浆中的嗜酸性和α—synuclein免疫反应阳性的点状颗粒，然后这些颗粒进一步在核旁聚集，形成聚集中心，最后形成固缩的包涵体．细胞外包涵体可独立存在。这种包涵体形成和演变过程与以人类PD为代表的神经变性疾病中的包涵体非常相似，可以作为研究包涵体相关问题的有力工具。     

泛素蛋白酶体抑制剂诱发多巴胺能神经元内质网应激反应及其凋亡的作用

目的 探讨泛素蛋白酶体(ubiquitin proteasome,UP)功能失调诱发的内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress response,ERS)机制在多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性死亡中的作用.方法 通过MTT及流式细胞仪检测UPS抑制剂Lactacystin对NGF诱导的PC12细胞的神经毒性作用,应用RT-PCR和Western blot技术观察Lactacystin处理后ERS通路中XBP1、Grp78、CHOP表达水平的变化及利血平耗竭胞内DA水平后的影响.结果 不同浓度的Lactacystin 5～20μmol/L处理PC12细胞后,细胞活力呈浓度依赖性下降,其中Lactacystin 10μmo1/L作用24h使细胞活力下降51%.在相同浓度条件下(10μmol/L)流式细胞仪显示的细胞凋亡率在4h、8h、1 6h、24h内逐渐增高(6.1%、14.1%、24.9%、30.9%)(P＜0.01).RT-PCR及免疫印迹检测显示UPS抑制剂处理后XBP1、Grp78和CHOP的基因及蛋白表达水平明显增加,分别在8h、16～24h达到高峰(P＜0.05).Caspase-12基因水平也在Lactacystin诱导后16h显著升高(P＜0.05).利血平预处理则使CHOP、caspase-12基因表达减弱(P＜0.05).结论 UPS功能抑制诱发的内质网应激和相关凋亡途径机制是DA能神经元选择性变性死亡的内在环节之一.     

PSI诱导PC12细胞的PD模型中分子伴侣家族的氧化修饰

目的 鉴定蛋白酶体抑制剂(PSI)处理的PC12细胞帕金森病(PD)模型中发生氧化修饰的蛋白质;从蛋白质水平探讨PD的发病机制.方法 本实验分为对照组和实验组.PC12细胞孵育24h后,实验组加入终浓度10 μmol/L的PSI(以DMSO溶解),对照组加入DMSO,继续孵育24h后进行研究.MTT法检测细胞存活率;吖啶橙(AO)和溴化乙啶(EB)染色检测凋亡细胞;HE染色观察细胞内包含体的形成.采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与Western blot技术相结合的方法在PD细胞模型中筛选氧化修饰的蛋白质.结果 在实验组中,MTT法检测显示细胞存活率降至85.46%±1.75%(对照组设为100%),差异有统计学意义(P<0.05);AO和EB染色显示早期凋亡细胞,凋亡百分率为12.41%±3.61%(P<0.05);HE染色可见胞浆内嗜酸性包含体的形成.经2D Evolution软件对Western blot图像及考染的制备胶图像进行分析和统计学处理,与对照组比较实验组有统计学意义的氧化水平显著升高的蛋白点有40个,其中13个蛋白点被质谱鉴定出来,其中3个蛋白点为分子伴侣家族成员:含TCPI的伴侣素亚单位3、葡萄糖调节蛋白58及热休克蛋白700结论首次在PD细胞模型中发现分子伴侣家族蛋白的氧化修饰,为PD发病机制的研究提供了新的线索.     

MG-132激活SHG-44细胞株自噬途径的体外实验

目的 探讨抑制蛋白酶体功能对人胶质瘤SHG-44细胞内自噬途径的激活作用.方法 采用5.0μmol/L蛋白酶体特异性抑制剂MG-132抑制人胶质瘤细胞SHG-44蛋白酶体功能.采用HE染色光镜观察细胞形态变化,AO染色荧光显微镜观察胞质内酸性囊泡细胞器的形成,锇铀铅染色透射电镜观察亚细胞结构变化.差速离心及蛋白印迹分析自噬关联蛋白Beclin及LC3的表达.结果 蛋白酶体功能被抑制后,HE染色光镜下可见SHG-44细胞的胞核呈深蓝色,大小无明显变化,部分染色质轻度浓缩,胞质内可见空泡,胞核附近胞质呈嗜酸性红染;荧光显微镜下见胞核呈黄绿色荧光,细胞核周围的胞质呈点状红色荧光;透射电镜下可见胞核无明显变化,胞质内出现自噬前体、自噬体及自噬溶酶体等亚细胞结构;蛋白印迹分析显示胞质内的Beclin、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ显著增加.结论 抑制蛋白酶体功能可以有效地激活人胶质瘤SHG-44细胞内自噬途径.