脱细胞软骨基质三维支架的制备及特性研究

[目的]探索脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备及其应用于关节软骨组织工程的可行性。[方法]新鲜牛膝关节软骨粉碎后,梯度离心法获取软骨微粒,采用改进的Courtman改良法处理细胞后,再冷冻干燥,制备脱细胞软骨基质三维多孔支架。然后,采用京尼平对三维支架进行交联,再次冷冻干燥后,对支架材料进行大体、组织学染色及扫描电镜观察,分别测定支架的孔隙率、溶胀率、降解率。最后,分离培养兔骨髓基质细胞(BMSCs),采用MTT法检测BMSCs在支架材料上的生长、增殖情况,以柱形图表示。[结果]大体观察显示支架呈疏松多孔状,京尼平交联后整体呈深蓝色。组织学观察显示支架材料无软骨细胞碎片残留,HE染色、甲苯胺兰染色观察均未见软骨细胞残留。测量示支架孔隙率为90%,溶胀率为(1314±337)%,降解率2周为(13.69±7.3)%,4周为(25.99±8.9)%。MTT法显示细胞在支架上生长良好,与对照组DMEM培养液吸光度值比较,差异无统计学意义(P0.05),提示支架无细胞毒性。扫描电镜显示支架内孔洞较明显,BMSCs通过细胞突起黏附于支架表面,黏附良好,能较好地在其上生长。[结论]经改进的Courtman改良法处理的软骨基质三维多孔支架脱细胞更彻底,保留了软骨的天然细胞外基质成分,天然交联剂京尼平交联后支架的细胞相容性好,抗降解性得到了提高,是一种适用于软骨组织工程的良好载体。     

新型脱细胞骨基质-壳聚糖复合支架的生物相容性研究

[目的]评价新型脱细胞骨基质-壳聚糖(ABECM/CS)骨组织工程复合多孔支架的生物相容性和安全性,为临床应用提供实验依据.[方法]采用联合脱细胞方法对猪股骨进行处理后制备脱细胞骨基质/壳聚糖骨组织工程复合支架.分离、培养兔骨髓间充质干细胞传代后进行实验.采用MTT法观察材料浸提液于1、3、5、7d时进行细胞毒性实验观察细胞的活性;将材料浸提液与稀释血混合离心后观察红细胞溶血情况,检测OD值计算相对溶血率;将材料浸提液经静脉注入兔体内进行热原实验,在规定时间内观察兔体温变化.[结果]细胞毒性实验显示,培养1、3、5、7d后各时间段内三组OD值两两比较(P＞0.05)无显著差异,表明材料无毒性.在溶血实验中观察实验材料的溶血率为3.0％,在标准值溶血率5％范围内,提示无溶血现象发生.热原实验结果显示每只兔体温升高均低于0.6℃,且3只兔体温升高总度数低于1.4℃,符合热原检测规定,复合材料无致热作用.[结论]经联合脱细胞处理制备的ABECM/CS复合支架无细胞毒性、无溶血反应、无热原性,具有良好的生物相容性和安全性,可作为构建组织工程骨的支架载体材料.     

多孔左旋聚乳酸-脱细胞软骨基质支架性能研究

目的 研究不同实验条件下制备的多孔左旋聚乳酸-脱细胞软骨基质支架的结构与性能,分析其作为软骨组织工程支架材料的可行性.方法 在三种实验温度下,应用热致相分离法将左旋聚乳酸与猪脱细胞软骨基质按不同比例混合,制备生物多孔复合物支架,并对各支架材料孔径、孔隙率、亲水性、生物力学强度和降解率进行研究.结果 多孔左旋聚乳酸-脱细胞软骨基质支架孔径为100～300μm.形态自然圆润,取向规则,脱细胞软骨基质在左旋聚乳酸三维结构中均匀分布,其结构和性能均符合软骨组织工程支架材料的要求.结论 左旋聚乳酸-脱细胞软骨基质支架可用于软骨组织工程研究.     

可塑形脱细胞软骨基质材料的制备及性状研究

目的 利用牛膝关节透明软骨进行脱细胞处理,制备新型可塑形生物材料,探讨脱细胞软骨基质作为组织工程载体材料的可行性. 方法 采集新鲜牛膝关节,切取关节表面透明软骨,冻干后低温粉碎为软骨微粒,胰酶、Triton X-100及低张Tris-HC1溶液联合作用进行脱细胞处理,冷冻干燥塑形,紫外线交联后制备脱细胞软骨基质材料.采用组织学、免疫组织化学、扫描电镜、孔隙率测定及生物力学检测等对材料的理化性状进行观察分析.取4只成年新西兰白兔骨髓制备BMSCs,传至第3代进行实验.观察浓度分别为100%、10%及1%的材料浸提液培养BMSCs 0、24、48及72 h后相对乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放率,以含5?S的DMEM培养基作为阴性对照,观察细胞毒性作用;并将浓度为1×107 个/mL的BMSCs单细胞悬液与材料复合培养,观察细胞黏附情况. 结果 制备的脱细胞软骨基质材料呈白色多孔状结构.HE染色示材料由纤维状的软骨微粒形成网状结构,基质内无细胞成分残留;阿尔新蓝染色示微颗粒呈蓝色.材料Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性.扫描电镜材料为多孔状海绵结构,孔径30～150μm.压汞法测定材料平均孔隙率为89.37%,平均孔径为90.8μm.力学分析示脱细胞软骨基质材料的压缩模量为(17.91±0.98)MPa,未经脱细胞处理的软骨微粒材料压缩模量为(15.12 ±0.77)MPa,差异无统计学意义(P>0.05);与正常牛关节软骨的(26.30±1.98)MPa比较差异均有统计学意义(P<0.05).细胞毒性实验显示,培养0、24、48及72 h,100%、10%、1%浓度材料浸提液条件培养基和阴性对照DMEM培养基相对LDH释放率差异无统计学意义(P>0.05).细胞黏附实验显示细胞可黏附于材料上,生长状态良好. 结论 牛关节软骨经脱细胞处理后,制成的多孔状脱细胞软骨基质材料,既保持了软骨基质中的主要成分,又具有良好的理化性质和生物相容性,可作为组织工程研究的一种新型载体材料.     

脱细胞软骨基质来源的多孔支架复合山羊髓核细胞体内初步构建组织工程髓核的实验研究

[目的]探讨脱细胞软骨基质多孔支架复合PKH26标记的山羊髓核细胞体内异位构建组织工程髓核的可行性.[方法]制备脱细胞软骨基质来源的多孔支架,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察、天狼星红染色、HE染色观察、MTT毒性检测;分离山羊髓核细胞,通过倒置显微镜观察、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色进行鉴定;将PKH26标记的山羊髓核细胞接种支架上,体外培养3d后进行LIVE/DEAD活性染色,将细胞支架复合物置入裸鼠皮下,培养6周,病理切片,荧光显微镜下观察,进行番红O、Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色.[结果]扫描电镜观察支架孔隙相连通且分布均匀,天狼星红染色支架呈黄绿相间色,HE支架淡染,MTT检测细胞增殖曲线无统计学差异(P＞0.05);P1代髓核细胞呈软骨样细胞形态,番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色均阳性,PKH26标记后的细胞呈红色荧光;体外LIVE/DEAD染色细胞呈绿色荧光,体内培养6周后,带红色荧光的细胞填满支架孔隙,番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,Ⅰ型胶原免疫组化染色弱阳性.[结论]以脱细胞软骨基质多孔支架复合山羊髓核细胞在体内能够形成组织工程髓核样组织.     

软骨脱细胞基质支架材料的软骨组织工程实验研究

目的应用软骨脱细胞基质作为支架材料，按照组织工程的原理再生软骨，为修复软骨缺损探索新的途径。方法取新西兰大耳白兔1只，体重2．4kg，按改良Courtman法对兔耳软骨行脱细胞处理后用于实验。选用纯种6月龄新西兰大耳白兔18只，雌雄不限，体重2．4～2．6kg。每只耳形成2处1cm&#215;1cm软骨缺损，按修复方式不同随机分为3组，每组24处缺损。A组，软骨脱细胞基质加软骨膜；B组，软骨脱细胞基质；C组软骨膜，作为对照。术后每日观察兔耳修复区的大体变化，并分别于4、12周每组处死3只动物，于修复区切取标本，行HE染色、藏红花红一奥尔新蓝染色、II型胶原基因探针原位杂交实验。结果术后4周内A、B组大体形态无明显改变；术后12周可见修复区轻度增厚，触摸时质地较正常软骨稍硬。C组术后2周，2只2处修复区形成痂皮，术后5周痂皮脱落形成穿孔。术后4周，A、B组HE染色可见软骨脱细胞基质周边有轻度的炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，未形成包囊，藏红花红．奥尔新蓝染色均阴性；C组软骨缺损处的软骨膜塌陷，无细胞增殖现象；各组修复区均未见II型胶原基因探针原位杂交显色。术后12周，A组HE染色示部分软骨脱细胞基质内有新生细胞，细胞排列不规律，ECM嗜碱性增强，藏红花红-奥尔新蓝染色呈阳性，II型胶原基因原位杂交显色示新生细胞内均有大片棕黄色阳性染色区域；B组HE染色示软骨脱细胞基质无吸收现象，周边无包囊，炎性细胞消失，藏红花红一奥尔新蓝染色呈阴性，未见II型胶原基因原位杂交显色；C组HE染色示近软骨断端处可见部分形成新生组织，藏红花红一奥尔新蓝染色呈阳性，II型胶原基因原位杂交显色可见棕黄色阳性染色细胞。结论脱细胞软骨可诱导软骨膜细胞向其中生长而重建软骨，软骨膜和脱细胞软骨复合移植是软骨组织工程的另一种选择。     

不同去细胞神经支架制备方法的对比研究

目的比较不同化学方法制备去细胞神经支架的效果，提供有效的组织工程神经支架。方法2月龄雄性SD大鼠15只，体重200～250g，取双侧坐骨神经，随机分为3组，每组10条。根据处理方法不同，A组为正常未处理组；B组为传统Sondell法化学处理组；C组为采用Triton X-200、SB-10、SB-16处理的改良法组。制备后行HE染色、免疫组织化学染色及扫描电镜观察，并对去细胞程度、脱髓鞘程度及神经纤维管道完整性进行量化评价。结果HE染色：A组神经纤维横断面呈圆形，胞核呈深蓝色，髓鞘呈网格状结构；B组轴突及细胞核均消失，神经内膜结构破坏明显；C组轴突及细胞核均消失，神经内膜形成不规则圆形空腔。层粘连蛋白免疫组织化学染色：A组基底膜围绕在髓鞘外周，中间有蓝染SC核；B组SC核及髓鞘结构消失，神经基底膜结构不完整；C组SC核及髓鞘结构消失，神经基底膜形成不规则圆形空腔。S-100蛋白免疫组织化学染色：A组SC及髓鞘呈棕褐色；B组及C组未见明显髓鞘染色。扫描电镜观察：A组髓鞘、轴突等内容物形态清晰；B组髓鞘、轴突等结构均消失，基膜管壁排列欠规则；C组基膜管壁胶原纤维排列有序。去细胞程度及髓鞘染色深度评分：B、C组均优于A组（P〈0．05），其中髓鞘染色深度评分C组均优于B组（P〈0．05）；神经纤维管道完整性评分：C组优于B组（P〈0．05），与A组相似（P〉0．05）；综合评价去细胞处理方法以C组方法为佳。结论改良法所获得的去细胞神经的去细胞效果与传统Sondell法相似，而脱髓鞘及组织结构保留的效果优于后者，可作为一种新的神经支架材料。     

胶原-透明质酸-硫酸软骨素复合三维支架体外构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨以胶原(collagen,Col)透明质酸(hyaluronic acid,HA)硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)为支架材料构建组织工程软骨的可行性.方法以乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐为交联剂通过冷冻干燥的方法制备Col-HA-CS复合支架及单纯Col支架.通过扫描电镜、HE染色对Col-HA-CS复合支架材料形态进行观察.分离培养幼兔关节软骨细胞,将体外扩增的软骨细胞接种在两种支架上,通过组织学、扫描电镜观察软骨细胞在支架上的生长形态;通过生物化学功能检测细胞-支架复合物中DNA、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;RTPCR方法检测在Col HA CS复合支架上的软骨细胞ColⅡ的表达情况.结果软骨细胞在Col-HA-CS复合支架材料上增殖分化良好,并保持软骨细胞特异的分化ColⅡ表型,培养21 d后已有软骨样组织形成,出现软骨陷窝.DNA和GAG含量测定显示软骨细胞在复合支架上随时间增加逐渐扩增并分泌大量的GAG,含量明显高于单纯Col支架材料,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Col-HA-CS复合支架材料可为软骨细胞生长分化及组织形成提供一个良好的环境,在软骨组织工程的支架材料领域有较广泛的应用前景.     

壳聚糖在软骨组织工程中的应用

目的 对高分子生物材料壳聚糖在软骨组织工程中的应用现状进行综述。方法 广泛查阅近年来有关壳聚糖在组织工程中应用的文献，综合分析，讨论 其生物相容性、可降解性及其应用。结果 壳聚糖具有良好的生物相容性、可降解性，除能提供细胞生长所需的三维支架作用外，还能提供类似软骨基质的细胞外环境，维持细胞表型及功能。结论壳聚糖在软骨组织工程中具有良好的应用前景。     

关节软骨组织工程支架的研究进展

目的对软骨组织工程支架材料的研究现状进行综述,并对其发展前景进行展望。方法广泛查阅近年来关节软骨组织工程支架的相关文献,并对多种天然生物支架材料和人工合成支架材料的相关实验及临床应用效果进行分析总结。结果软骨组织工程支架的设计对软骨组织损伤修复成功与否至关重要,理想的软骨支架可以引导并促进新生软骨组织的形成。目前所应用的支架材料均有其局限性。结论进一步深入研究软骨组织工程支架,对未来临床软骨损伤的修复具有重要意义。     

胶原-透明质酸支架的制备及其与软骨细胞复合培养的实验研究

目的制备胶原-透明质酸支架,评价其与兔髁状突软骨细胞的生物相容性,探讨其应用于关节软骨组织工程的可行性。方法冷冻干燥法制备胶原-透明质酸复合多孔海绵支架材料,将其与碳化二亚胺[1-ethyl-3-（3-dimethyl aminopropyl）carbodiimide,EDC]进行化学交联。分别采用体积法和体外酶解实验测定支架材料孔隙率和降解率,扫描电镜观察交联前后支架材料的形态变化。取3周龄新西兰兔髁状突软骨细胞,体外培养5d后,甲苯胺蓝染色,倒置相差显微镜下观察行细胞鉴定。取消化后第2代软骨细胞接种至支架材料复合培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。复合培养1、3、5、7和10d后,PBS液清洗3次,置入24孔板并以0.25%胰酶和0.1%EDTA消化细胞,采集细胞进行细胞计数并绘制细胞生长曲线。另取部分样本继续培养5d,行组织学和扫描电镜观察。结果胶原-透明质酸支架材料经化学交联后,具有合适的三维多孔结构,孔隙率为83.7%,孔径100-120μm;交联后抗酶解能力显著增加。髁状突软骨细胞在其表面和内部贴附良好,形成细胞-材料复合体,细胞增殖实验显示,复合培养1d,材料中细胞数为3.7×104/支架,10d后增至8.2×104/支架。电镜观察见细胞周围有基质分泌。结论EDC交联后的胶原-透明质酸支架具有良好空间结构和生物相容性,可作为支架材料用于髁状突软骨组织工程的研究。     

脱细胞基质在软骨组织工程中的应用

目的 综述脱细胞基质(acellular matrix,ACM)在软骨组织工程中的应用与研究进展. 方法 广泛查阅近年国内外相关文献,进行回顾与综合分析. 结果 许多研究者联合采用了渗透溶液法、冷冻干燥法和理化交联法等技术对软骨ACM支架进行了改进.软骨ACM支架用于构建组织工程软骨的实验结果 与ACM的特性密切相关. 结论 ACM在软骨组织工程领域有着广泛的应用前景,其特性的改进与完善非常重要.     

组织工程细胞外基质材料研究进展

目的综述细胞外基质(extracellular matrix,ECM)材料在组织工程中的研究现状及临床应用进展。方法查阅近年来国内外ECM材料制备方法、生物相容性、生物力学特性、可降解性能和临床应用等方面的相关文献,并进行分析总结。结果 ECM制备方法的改进和免疫特性认识的深入,为其用于组织的修复重建奠定了一定基础。一系列动物实验研究表明了小肠黏膜下层、膀胱ECM、脱细胞真皮等ECM材料应用于尿道、膀胱、动脉、皮肤等组织器官修复重建的可行性和有效性,显示其具有广阔的临床应用前景。结论 ECM材料是一种良好的生物衍生支架材料,有望成为组织修复重建中替代材料的重要来源。     

椎间盘组织工程支架材料研究进展

目的 综述椎间盘组织工程支架材料及其应用的研究现状。方法 广泛查阅近年来有关椎间盘组织工程支架材料及其应用的文献，进行综述。结果 琼脂糖凝胶、藻酸盐凝胶、Ⅰ型胶原以及聚羟基乙酸和聚乳酸等仍然是目前椎间盘组织工程的主要支架材料，均具有较好的生物相容性。结论 研究开发具有良好性能的支架材料仍是椎间盘组织工程研究的热点和难点之一。     

BMSCs构建组织工程软骨的研究进展

目的综述BMSCs构建组织工程软骨的进展。方法查阅近10年来有关BMSCs构建组织工程软骨的文献，并进行综述。结果支架为软骨细胞的生长提供了理想的环境，细胞因子和基因修饰可促进BMSCs分化为软骨细胞，三者在软骨组织工程中具有重要作用。结论三维支架的改良、合理使用细胞因子及基因修饰技术的提高，将推动临床上软骨重建技术的发展。