树突状细胞及其负载胃癌细胞总RNA的抗肿瘤作用

目的以小鼠胃癌细胞总RNA负载树突状细胞(DC),研究其抗肿瘤免疫作用.方法磁性细胞分选器(MACS)自小鼠脾细胞中分选出CD11c+的DC作短期培养,以小鼠前胃癌细胞株的总RNA脉冲DC,分别以RNA脉冲的DC(RNA/DC)和未脉冲的DC(UDC)皮下注射免疫小鼠2次;免疫后7 d,皮下接种小鼠前胃癌细胞MFC 5×105/鼠,以未作免疫注射的小鼠作为对照.接种肿瘤细胞后21 d,处死实验动物,测量肿瘤体积,检测自然杀伤细胞(NK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性和血清IL-12含量.结果RNA/DC免疫组、UDC免疫组和对照组的皮下肿瘤体积分别为(0.3688±0.6571)、(0.7536±0.3659)、(2.6323±1.1435)cm3.RNA/DC免疫组外周血和脾细胞NK活性均明显升高,较对照组分别高出66.2%和65.4%;其肿瘤特异性CTL也明显升高,较对照组升高49.5%.UDC组NK和CTL活性也明显高于对照组.结论短期培养的DC和以肿瘤细胞总RNA作为抗原脉冲的DC均可诱导较强的抗肿瘤免疫.     

树突状细胞联合重组腺病毒Ad-Mig基因治疗小鼠淋巴瘤的实验研究

目的 观察树突状细胞(DC)和腺病毒介导的小鼠Mig基因对小鼠淋巴瘤的抗肿瘤效果.方法 利用EG7细胞皮下注射C57BL/6小鼠建立小鼠淋巴瘤模型,单独或联合应用DC和携带Mig基因的重组腺病毒(Ad-Mig)直接进行瘤内注射治疗,观察小鼠皮下肿瘤生长情况.采用HE染色观察肿瘤组织的变化.用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL和NK的杀伤活性.结果 DC能显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤的生长.使肿瘤组织中炎细胞数量增多而肿瘤细胞数量明显减少,能显著增强荷瘤小鼠脾细胞NK和CTL杀伤活性.与单独应用DC相比,DC与Ad-Mig联合应用可明显提高抗肿瘤效果.结论 DC对小鼠淋巴瘤有显著治疗效果.且与Ad-Mig基因联合应用能进一步提高抗肿瘤效果.     

MAGE-3抗原肽脉冲树突状细胞对小鼠胃癌移植瘤的免疫防护作用

目的观察MAGE3抗原肽脉冲的树突状细胞(DC/MAGE3)作为肿瘤疫苗抑制小鼠胃癌移植瘤生长的作用。方法检测了MAGE3抗原肽诱导出的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对小鼠前胃癌细胞株MFC细胞的杀伤活性。在免疫保护实验中先用DC/MAGE3(1×106个细胞/只)于小鼠皮下注射免疫两次,然后接种MFC细胞(5×105个细胞/只);在免疫治疗实验中先接种MFC细胞(5×105个细胞/只),然后在皮下注射DC/MAGE3(1×106个细胞/只)两次,并以感冒病毒核蛋白抗原肽脉冲的DC(DC/Nup)及空白DC作为对照,观察小鼠肿瘤的生长情况及其存活期并进行统计学处理。结果(1)MAGE3抗原肽诱导出的CTL细胞对MFC细胞有较高的杀伤活性;(2)在免疫保护实验和免疫治疗实验中DC/MAGE3可以明显地延缓肿瘤的生长,延长小鼠的生存时间(P<0.05)。结论MAGE3抗原肽脉冲的DC可通过加强抗原递呈激活肿瘤特异性CTL而具有明显的抗肿瘤活性。     

凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠血清免疫因子水平以及免疫细胞增殖、活性的影响

目的 探讨凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠血清免疫因子水平以及免疫细胞增殖、活性的影响.方法 取对数生长期大肠癌CT26细胞制备凋亡、坏死肿瘤细胞.取Balb/c小鼠20只,分离T淋巴细胞亚群及自然杀伤(NK)细胞、获取巨噬细胞,并制备细胞毒性T淋巴细胞(CTL).将小鼠CTL、NK细胞、巨噬细胞分别经相应肿瘤细胞处理后,均分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组,应用51 Cr释放实验测定各组CTL、NK细胞、巨噬细胞的活性,细胞计数(CCK-8)法检测各组CTL、NK细胞和巨噬细胞的增殖情况.另选取Balb/c小鼠分为凋亡肿瘤细胞组、坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组各10只,分别将凋亡、坏死、对数生长期CT26细胞按通过皮下及静脉输注小鼠,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组小鼠血清可溶性Fas(sFas)、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)4、IL-10、IL-12、转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平.结果 与坏死肿瘤细胞组及肿瘤细胞对照组比较,凋亡肿瘤细胞组中不同效靶比的CTL、NK细胞及巨噬细胞活性均降低(P＜0.05).CCK-8法检测结果显示,凋亡肿瘤细胞组的CTL、NK细胞及巨噬细胞的A450值均低于坏死肿瘤细胞组、肿瘤细胞对照组(P＜0.05).ELISA检测显示凋亡肿瘤细胞组sFas相对表达量低于坏死肿瘤细胞组和肿瘤细胞对照组(P＜0.05).凋亡肿瘤细胞组IL-4表达水平高于肿瘤细胞对照组(P＜0.05),IL-10、TGF-β表达水平则高于其他两组(P＜0.05),IL-12表达水平低于其他两组(P＜0.05).结论 凋亡大肠癌CT26细胞能够抑制小鼠特异性CTL、NK细胞、巨噬细胞增殖及其活性,影响大肠癌小鼠正常免疫功能.     

GM-CSF基因免疫治疗小鼠骨髓瘤的实验研究

目的:探讨mGM-CSF基因免疫小鼠是否可以诱发小鼠对肿瘤的免疫应答。方法:用SP2/0肿瘤细胞皮下接种Balb/c小鼠建立肿瘤动物模型,再以皮下或肌肉注射空质粒或重组质粒4次,共400μg。8周后观察小鼠的抑瘤率、肿瘤质量、肿瘤组织淋巴细胞的浸润情况,检测血清中IFN-γ和IL-2浓度,MTT法体外检测CTL、NK细胞活性。结果:基因免疫Balb/c小鼠8周后,重组质粒皮下注射组肿瘤质量[(0.880±0.405)g]轻于对照组[(1.548±0.221)g,P<0.01];重组质粒肌肉注射组肿瘤质量[(0.378±0.411)g]明显轻于对照组[(1.554±0.249)g,P<0.001];重组质粒肌肉注射组肿瘤组织可见淋巴细胞浸润;IFN-γ和IL-2的浓度及CTL、NK细胞活性显著高于对照组。结论:GM-CSF基因免疫能诱发小鼠抗肿瘤作用,肌肉注射比皮下注射效果好。     

RNA致敏树突状细胞治疗胶质瘤的实验研究

目的:肿瘤RNA致敏树突状细胞(DC)治疗颅内荷瘤小鼠,观察DC疫苗对脑胶质瘤的治疗作用,探讨免疫反应的机理,为DC疫苗的临床应用提供实验基础。方法:用G422胶质母细胞瘤RNA冲击致敏DC制成DC疫苗,检测DC疫苗的CTL活性,瘤内和皮下两种途径注射荷瘤小鼠以进行免疫治疗,观察小鼠生存期,并与PBS、单纯DC组进行比较,同时检测血清IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4等细胞因子,并行病理检查。结果:DC疫苗的CTL活性明显高于对照组(P<0.01)。两种途径注射DC疫苗,治疗组小鼠生存时间均明显延长(P<0.01),血清IFN-γ显著升高(P<0.01),IL-10明显下降(P<0.05),病理提示肿瘤出现坏死。两种注射途径间以上指标无明显差异。结论:肿瘤RNA冲击致敏DC注射荷瘤小鼠具有明显的免疫治疗作用,能显著延长动物生存期,并能诱导特异性抗肿瘤细胞免疫反应,其机理主要是Th1细胞介导的细胞免疫反应,且免疫反应的程度与注射途径无关。     

白细胞介素-12基因治疗肿瘤及抑制肝转移

[目的]探讨经静脉转染表达mIL-12的DNA质粒在肿瘤的治疗及抑制肝转移中的作用.[方法]经皮下和腹腔接种M5076细胞建立荷瘤模型,用水流动力学方法将mIL-12基因转染荷瘤C57BL/6小鼠,观察实验组与对照组的生存率及肿瘤转移灶数目,用ELISA法检测血清中细胞因子水平,用小鼠脾细胞的细胞毒性实验评价CTL和NK细胞活性.[结果]转染pGEG.mIL-12小鼠血清中白细胞介素-12(IL-12)及IFN-γ水平明显升高.经皮下接种肿瘤细胞建立荷瘤模型的转染pGEG.mIL-12小鼠组抑制肿瘤细胞作用、抑制肿瘤细胞肝转移和生存时间与对照组相比较差异均有统计学意义.经腹腔接种肿瘤细胞建立荷瘤模型转染pGEG.mIL-12小鼠组与对照组相比较明显抑制腹腔内肿瘤播散,延长生存时间,差异有统计学意义.M5076细胞对转染pGEG.mIL-12小鼠脾细胞的CTL和NK细胞破瘤细胞活性均不敏感.[结论]用水流动力学方法转染小鼠细胞因子基因产生的高水平IL-12对CTL不敏感的M5076肿瘤有治疗和抑制肝转移的作用.     

人胃癌细胞RNA转染树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的实验研究

目的：观察人胃癌细胞株RNA转染的树突状细胞（DC）所诱导的行异性抗肿瘤免疫效应，探讨肿瘤细胞RNA直接转染DC进行胃癌生物治疗的可能性。方法：胃癌细胞株AGS体外培养，提取RNA；正常人外周血，进行体外DC的培养扩增；胃癌RNA直接转染DC，MTT法检测胃癌RNA活化DC所诱生的淋巴细胞对胃癌AGS、视网膜母细胞瘤SoRb-70的体外杀伤效应。结果：正常人外周血来源的DC，经胃癌AGS细胞株RNA直接转染后，成功诱导特异性抗肿瘤免疫反应，AGS RNA组CTL在靶效比为20：1时对AGS、SoRb-70的杀伤率分别为84．54％、1．53％，而对照组对这两种细胞的杀伤率分别为1．34％和1．70％。结论：肿瘤RNA转染DC可以诱导特异性抗肿瘤免疫，是一种有前景的胃癌治疗手段，有进一步研究的价值。     

树突状细胞对去脾小鼠荷S180瘤的治疗效果

目的 :观察在无脾状态下小鼠荷S180骨肉瘤时 ,对脉冲树突状细胞 (dendriticcell,DC)的治疗反应 ,初步探讨脾脏与DC在抗肿瘤免疫中的关系。方法 :33只昆明小鼠 ,分为手术对照组、去脾组、去脾 +DC治疗组 3个大组 ,每大组内 5只皮下荷瘤 ,6只腹腔荷瘤。实验开始 8周后 ,每只皮下荷瘤鼠均于右后腿腋下注射S180 2× 10 6,腹腔荷瘤鼠每只腹腔注射S180 1× 10 6。用冻融S180细胞冲击致敏DC后 ,腹腔注射脉冲致敏的DC每只 4× 10 4,1周后重复 1次。检测皮下瘤体大小和称重。结果 :DC对去脾腹腔荷S180小鼠的免疫治疗效果显示 ,3组间肿瘤腹水增长速度和死亡时间接近 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;DC对去脾皮下荷S180小鼠的免疫治疗效果显示 ,去脾组肿瘤发生率与手术对照组相比差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,但多数鼠 (4/ 5 )死亡时间短于对照组 ;去脾 +DC治疗组鼠荷瘤生存期明显延长 ,80 % (4/ 5 )荷瘤生存时间超过 6 0d ,而手术对照组和去脾组鼠分别为 4 0 % (2 / 5 )和 2 0 % (1/ 5 )。结论 :去脾小鼠荷瘤生存时间缩短 ;DC对去脾后一定时间内的皮下荷S180小鼠可介导抗肿瘤免疫反应。     

树突状细胞介导的肝癌免疫治疗实验研究

目的探讨以树突状细胞（DC）为介导的原发性肝癌免疫治疗新方法。方法采用肝癌细胞制备肿瘤细胞性抗原冲击致敏体外培养的DC,体外混合淋巴细胞反应检测抗原致敏DC;刺激同基因T淋巴细胞增殖的能力,观察负载肿瘤抗原的DC;体内外诱导产生肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）及其抗肿瘤能力。结果经肝癌细胞抗原致敏的DC;能诱导较强的自体T细胞增殖,且诱导特异性CTL,该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率明显高于DC和未经肝癌细胞抗原致敏的DC;激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率,而对非同种肿瘤细胞无明显的杀伤作用,经BEL7402肿瘤细胞抗原致敏的DC;经皮下免疫小鼠可诱导有效的免疫保护作用,可抵抗野生型BEL7402细胞的再攻击,肿瘤生长受到明显抑制,瘤体出现延迟,生长减慢。结论DC具有强大的刺激T淋巴细胞增殖和诱导产生特异性CTL的能力,在体内外均能激发特异性抗肿瘤免疫应答。     

干细胞来源的胰岛素分泌细胞的研究进展

Ⅰ型糖尿病是由于胰岛β细胞被自身免疫系统攻击、破坏,不能正常释放胰岛素,导致血糖升高.患者需终生注射胰岛素,由于给药过程缺乏理想的血糖感应系统,常导致糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、神经病变及糖尿病足等慢性并发症的发生,是糖尿病死亡的主要原因[1].为了有效控制血糖,防止糖尿病并发症的发生,提高糖尿病患者的生存质量,目前主要采用两种治疗策略来改进胰岛素的治疗,一是胰岛素输入方式的改进:临床上广泛应用的胰岛素泵就是通过24 h不停地向患者体内输入微量胰岛素,模拟正常胰岛素分泌模式,控制血糖水平,减少并发症的发生.其次是寻找方法替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞,包括胰腺或胰岛移植、对非β细胞进行基因修饰以及对干细胞的诱导分化.70年代初,Lacy等成功地证明了移植胰岛细胞能够改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植开始蓬勃开展起来.     

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究

目的体外分离培养骨髓间充质干细胞,并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件.方法采用直接贴壁法,分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞,应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等,对分离的细胞进行鉴定.以10～40 ng/ml的表皮生长因子处理第3代MSCs,观察细胞角蛋白的表达.用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系.结果原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CD106、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性,CD34为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征.MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7 d后,免疫细胞化学结果显示,EGF浓度为30 ng/ml和40 ng/ml时,细胞角蛋白出现阳性表达;体外诱导14 d,呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加,同时integrin β1表达量下降.结论体外培养的MSCs在EGF诱导下,具有分化为表皮细胞的倾向,同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用.     

鼠胶质瘤细胞上清液诱导人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨鼠胶质瘤细胞上清液对其向神经元样细胞的诱导分化。方法：利用Percoll梯度分离法,培养人MSCs。采用鼠胶质瘤细胞上清液对MSCs进行诱导分化。观察人MSCs经诱导后细胞的形态变化,采用免疫细胞化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。 结果：诱导24 h后,细胞胞体收缩呈锥形或球形,有突起长出,细胞间突起相互连接,交错成网,为典型的神经元样形态。免疫细胞化学结果显示,经诱导培养后的神经元样细胞的胞体及部分突起NSE和NF染色呈强阳性表达,而GFAP 染色呈阴性。诱导组出现NSE阳性的细胞率为(79.5±3.2)%,而对照组出现NSE阳性的细胞率为(12.1±2.0)%,两组之间比较差异有显著性 (P<0.01)。诱导组出现NF阳性的细胞率为(41.2±2.4)%,而对照组为阴性。结论：鼠胶质瘤细胞上清液可以诱导MSCs向神经元样细胞分化。     

CIK、DC-CIK细胞杀伤胃癌MKN-28细胞的作用比较

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与树突状细胞(DC)共培养后对胃癌MKN-28细胞株的杀伤作用。方法取正常人外周血,分离出外周血单个核细胞(PBMC),加入不同的细胞因子分别诱导出DC和CIK细胞,共培养成DC-CIK细胞,以MTS法测定不同组CIK细胞对MKN-28杀伤活性。结果与单纯CIK细胞相比较,DC-CIK组细胞增殖速率明显提高(P<0.05);具有更强的杀伤胃癌MKN-28细胞株的活性(P<0.05),效靶比为20.0∶1时,DC-CIK组对MKN-28的杀伤活性为(38.02±2.06)%,>CIK组的(29.78±1.84)%,差异有统计学意义。结论 DC-CIK细胞是一种增殖活性和细胞毒作用均高于单纯CIK细胞的免疫活性细胞。     

Expansive effects of aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells on hematopoietic stem cells from embryonic stem cells

Background Hematopoietic stem cells (HSCs) give rise to all blood and immune cells and are used in clinical transplantation protocols to treat a wide variety of refractory diseases, but the amplification of HSCs has been difficult to achieve in vitro. In the present study, the expansive effects of aorta-gonad-mesonephros (AGM) region derived stromal cells on HSCs were explored, attempting to improve the efficiency of HSC transplantation in clinical practice.Methods The murine stromal cells were isolated from the AGM region of 12 days postcoitum (dpc) murine embryos and bone marrow（BM）of 6 weeks old mice, respectively. After identification with flow cytometry and immunocytochemistry, the stromal cells were co-cultured with ESCs-derived, cytokines-induced HSCs. The maintenance and expansion of ESCs-derived HSCs were evaluated by detecting the population of CD34+ and CD34+Sca-1+cells with flow cytometry and the blast colony-forming cells (BL-CFCs), high proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFCs) by using semi-solid medium colonial culture. Finally, the homing and hematopoietic reconstruction abilities of HSCs were evaluated using a murine model of HSC transplantation in vivo.Results AGM and BM-derived stromal cells were morphologically and phenotypically similar, and had the features of stromal cells. When co-cultured with AGM or BM stromal cells, more primitive progenitor cells (HPP-CFCs ) could be detected in ESCs derived hematopoietic precursor cells, but BL-CFC’s expansion could be detected only when co-cultured with AGM-derived stromal cells. The population of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells were expanded 3 times,but no significant expansion in the population of CD34+Sca-1+ cells was noted when co-cultured with BM stromal cells. While both CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells and CD34+Sca-1+ cells were expanded 4 to 5 times respectively when co-cultured with AGM stromal cells. AGM region-derived stromal cells, like BM-derived stromal cells, could promote hematopoietic reconstruction and HSCs’ homing to BM in vivo.Conclusions AGM-derived stromal cells in comparison with the BM-derived stromal cells could not only support the expansion of HSCs but also maintain the self-renewal and multi-lineage differentiation more effectively. They are promising in HSC transplantation. Chin Med J 2005; 118(23):1979-1986     

基质细胞对髓性白血病细胞的促分化作用

髓性白血病存在着骨髓基质细胞的异常。本文从基质细胞对骨髓造血细胞的支持作用、基质细胞异常与髓性白血病的关系、基质细胞对髓性白血病细胞株的促分化作用以及细胞因子对髓性白血病的促分化作用等几个方面对国内外文献进行了综述,阐明基质细胞对髓性白血病细胞的促分化作用,并描述基质细胞的应用前景。     

肝干细胞--肝卵圆细胞的研究进展

对于肝卵圆细胞的研究已有一定时间，但近几年才明确其属于干细胞范畴，笔者简要综述了肝卵圆细胞的特征、来源、调控分化及与肝病的关系。     

Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Cells to Neural Cells

Summary： To explore the possibility and condition of differentiation of bone marrow mesenchymal ceils （BMSCs） to neural ceils in vitro, BMSCs from whole bone marrow of rats were cultured. The BMSCs of passage 3 were identified with immunocytochemical staining of CD44 （ ＋ ）, CD71 （ ＋ ） and CD45（-）, There were type I and type H ceils in BMSCs. Type I BMSCs were spindlehaped and strong positive in immunocytochemical staining of CD44 and CD71, whereas flat and big type H BMSCs were lightly stained. The BMSCs of same passage were induced to differentiate into neural ceils by β-mercaptoethanol （BME）. After induction by BME, the type I BMSCs withdrew to form neuron-like round soma and axon-like and dendrite-like processes, and were stained positively for neurofilament （NF）. The type H BMSCs did not change in the BME medium and were negatively or slightly stained of NF.     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞。方法以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1。传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能。结果hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长。经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织。结论SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能。     

SNL细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的 为便于人胚胎干细胞(ES细胞)的培养和研究,寻找一种建系细胞作为人ES细胞的饲养层细胞.方法 以小鼠成纤维细胞系SNL细胞作为饲养层细胞培养人ES细胞株hES1.传代17代后,检测hES细胞表面特异性标志,包括碱性磷酸酶(AKP)、Oct-4、阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和SSEA-4的表达;同时观察细胞的多向分化潜能.结果 hES1细胞在SNL细胞饲养层上能持续生长.经多次传代后持续表达人ES细胞表面特异性标志,其注射于重症联合免疫缺陷小鼠皮下仍能形成畸胎瘤组织.结论 SNL细胞能够作为饲养层细胞用于人ES细胞的培养,且操作更方便;该细胞已转染了耐受新霉素的基因,为将来对人ES细胞基因操作时进行药物筛选提供了可能.