特异性hTERT-siRNA介导RNAi在Hela细胞中的实验研究

目的:探讨RNA干扰对宫颈癌Hela细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制效应.方法:化学合成靶向于hTERT基因的4个siRNA片段和1个阴性对照小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)片段,分siRNA1-4、control siRNA和空白对照组共6个组,分别用阳离子脂质体转染法将其导入Hela细胞内,通过RT-PCR和Western Blot方法分别检测宫颈癌细胞转染后细胞hTERT mRNA和蛋白水平,MTS法检测细胞生长增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果:siRNA-3组端粒酶活性明显下降,hTERT mRNA表达水平明显下降,hTERT蛋白表达明显下降.细胞凋亡率明显升高,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05).结论:靶向于hTERT的siRNA能特异性抑制宫颈癌Hela细胞hTERT基因,下调hTERT mRNA及蛋白表达水平,抑制癌细胞生长增殖,促进宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗研究提供实验依据.     

特异性hTERT-siRNA介导RNAi在Hela细胞中的实验研究

目的:探讨RNA干扰对宫颈癌Hela细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制效应。方法:化学合成靶向于hTERT基因的4个siRNA片段和1个阴性对照小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)片段,分siRNA 1-4、control siRNA和空白对照组共6个组,分别用阳离子脂质体转染法将其导入Hela细胞内,通过RT-PCR和WesternBlot方法分别检测宫颈癌细胞转染后细胞hTERT mRNA和蛋白水平,MTS法检测细胞生长增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:siRNA-3组端粒酶活性明显下降,hTERT mRNA表达水平明显下降,hTERT蛋白表达明显下降,细胞凋亡率明显升高,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:靶向于hTERT的siRNA能特异性抑制宫颈癌Hela细胞hTERT基因,下调hTERT mRNA及蛋白表达水平,抑制癌细胞生长增殖,促进宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗研究提供实验依据。     

人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响。方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHⅠ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞。结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,经测序验证无误。将pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞。经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P<0.01),经TRAP-ELISA法检测实验组细胞端粒酶活性出现显著下降(P<0.01)。结果证实,实验成功构建人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性。     

短发夹RNA诱导survivin基因缄默对Jurkat细胞凋亡和增殖的影响

目的研究应用载体表达短发夹 RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术抑制人 T 淋巴细胞白血病细胞株 Jurkat 细胞 survivin 基因的表达,探讨 survivin 基因表达缄默对 Jurkat 细胞凋亡和增殖的影响。方法构建针对 survivin 基因的 shRNA 重组质粒并转染至 Jurkat 细胞,分别用多重 PCR和 Western blot 法检测瞬时转染和稳定转染细胞 survivin 基因 mRNA 和蛋白表达水平的变化;流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染细胞凋亡指数的变化,绘制细胞生长曲线,探讨 survivin shRNA 转染对细胞生长和增殖的影响。结果多重 PCR 结果示与无功能(对照组)shRNA 处理组和磷酸盐缓冲液处理组比较,survivin shRNA 瞬时转染和稳定转染细胞 surivivin 基因 mRNA 表达均显著下降,抑制率分别为66.675% 和60.69%(P<0.05);Western blot 结果显示 survivin shRNA 瞬时转染和稳定转染细胞survivin 蛋白表达水平亦显著降低,抑制率分别为63.41% 和60.18%(P<0.05)。流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染细胞的凋亡率显著增加,分别为(22.41±2.83)% 和(20.73±2.56)%(与对照组比较,P均<0.05),细胞倍增时间显著延长。生长曲线显示稳定转染细胞的生长显著减慢。结论shRNA 重组质粒介导的 RNA 干扰能明显抑制 Jurkat 细胞 survivin 基因 mRNA 和蛋白产物的表达,诱导细胞凋亡和生长抑制。     

靶向RNAi对Mc3细胞中Survivin mRNA表达及细胞增殖的影响

目的 应用RNA干扰技术靶向阻断Survivin基因表达,观察其mRNA表达水平及细胞增殖的变化,探讨其对Mc3细胞的抑制作用.方法 将RNA干扰表达载体Pgenesil-sur通过脂质体介导转染Mc3细胞,采用半定量PCR检测SurvivinmRNA表达量;MTT法检测对黏液表皮样癌细胞的增殖抑制作用.结果 RNA干扰组SurvivinmRNA表达水平(0.61±0.10)比对照组SurvivinmRNA表达水平(3.20±0.11)显著减低,差异有统计学意义(P＜0.01),转染Pgenesil-1空载体组SurvivinmRNA表达水平(3.18±0.12)与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).MTT结果表明转染Pgenesil-sur后细胞增殖受到明显抑制,抑制率达81%;转染Pgenesil-1空载体细胞未受到抑制.结论 靶向SurvivinRNA干扰能阻断肿瘤细胞中Survivin基因mRNA表达,并有效抑制体外培养的Mc3细胞的增殖作用.     

慢病毒介导的RNA干扰HMGA2基因表达对HL-60细胞增殖及细胞周期素B2、A2表达的影响

目的 探讨慢病毒介导的RNA干扰沉默高迁移率族蛋白A2(HMGA2)基因表达对人急性白血病细胞系HL-60细胞增殖及细胞周期素(cyclin) B2、cyclin A2表达的影响.方法 制备表达HMGA2基因短发夹RNA(shRNA)的重组慢病毒载体,转染HL-60细胞.通过半定量RT-PCR和Western blot检测特异性shRNA转染后HL-60细胞HMGA2基因表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞术(FCM)检测细胞周期; RT-PCR及Western blot检测cyclin B2、cyclin A2 mRNA和蛋白表达水平.结果 RT-PCR和测序证实,成功构建了表达HMGA2 shRNA的重组慢病毒载体;RT-PCR和Western blot证实经嘌呤霉素筛选出的阳性克隆转染的HL-60细胞HMGA2 mRNA和蛋白表达水平与空载体组相比明显受抑,抑制率分别达(80.66 ± 7.98)%和(76.35±12.72)%;CCK-8比色结果显示,HMGA2表达受到稳定干扰的HL-60细胞增殖活力明显受到抑制,细胞增殖曲线低平,缺乏指数增殖特征.FCM检测显示,与对照组相比,转染特异性shRNA的HL-60细胞出现了明显的G2/M期阻滞,G2/M期细胞分别为(13.90±4.07)%和(30.00±5.78)%(P<0.05).HMGA2特异性shRNA转染的HL-60细胞cyclin B2 mRNA和蛋白表达与未转染细胞相比,抑制率分别为(67.55±7.69)%和(51.77±4.81)%(P<0.01).而cyclin A2的表达无明显改变.结论 HMGA2基因沉默可下调cyclin B2表达,从而使细胞出现明显的增殖抑制和G2/M期阻滞.     

RNA干扰HDAC1提高人宫颈癌HeLa细胞化疗敏感性研究

目的探讨体外应用RNA干扰技术抑制组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)表达,提高人宫颈癌HeLa细胞对顺铂敏感性的作用及机制。方法体外合成针对HDAC1的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染HeLa细胞,将其分为正常对照组(无干预措施)、阴性对照组(转染阴性对照siRNA)及siRNA干扰组(转染HDAC1基因siRNA)。采用Western blot法检测各组细胞HDAC1蛋白和乙酰化组蛋白H4(Ac-H4)的表达,采用聚合酶链反应(PCR)法检测HDAC1基因和NF-κB基因mRNA表达。HeLa细胞经不同浓度顺铂作用后,采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测对顺铂的敏感性,以及采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果与正常对照组及阴性对照组比较,siRNA干扰组HeLa细胞HDAC1基因mRNA和蛋白表达均降低(P0.05或P0.01),细胞内Ac-H4表达增加(P0.05),同时NF-κB基因mRNA表达降低(P0.05)。经不同浓度顺铂作用后,与正常对照组及阴性对照组比较,siRNA干扰组HeLa细胞对顺铂的50%抑制浓度降低(P0.05或P=0.01),细胞凋亡率增加(P0.01)。结论 HDAC1基因siRNA能够提高宫颈癌HeLa细胞对顺铂的敏感性,增加组蛋白乙酰化水平、抑制HDAC1基因及NF-κB基因表达可能是其作用机制。     

针对人c-Met基因的RNA干扰对晶状体上皮细胞增殖的影响

目的 探讨针对肝细胞生长因子(HGF)受体c-Met的RNA干扰对人晶状体上皮细胞增殖的影响.方法 构建针对人c-Met基因的小干扰RNA(siRNA),转染体外培养的人晶状体上皮细胞,利用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)检测细胞中c-Met mRNA的表达变化,应用MTT法检测HGF诱导后人晶状体上皮细胞增殖.结果 与对照组相比,转染后的人晶状体上皮细胞中c-Met mRNA表达水平明显下降(P《0.01);与单纯HGF诱导组相比,转染后HGF诱导的人晶状体上皮细胞生长明显减慢,增殖能力明显下降(P《0.01).结论 针对人c-Met基因的RNA干扰可以有效阻断人晶状体上皮细胞中c-Met mRNA的表达,并能抑制HGF诱导的人晶状体上皮细胞的增殖.     

整合稳定靶向高迁移率族蛋白B1基因shRNA载体的人脐静脉内皮细胞株建立

目的 构建针对高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)基因的特异性RNA干扰载体,建立稳定转染该干扰载体的人脐静脉内皮细胞株(HUVEC).方法 根据HMGB1基因的编码序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计并合成针对HMGB1基因的特异性shRNA,将其定向克隆到pRNA-u6.1/Neo载体中,同时设立阴性对照,重组载体经脂质体转染HUVEC;转染细胞经类氨基糖抗生素样物质G418筛选,采用实时荧光逆转录-聚合酶链反应检测HMGB1mRNA表达,蛋白质免疫印迹法检测HMGB1蛋白表达.结果 酶切鉴定和测序证实,重组质粒shRNA序列与设计的片段完全一致.HMGB1基因特异性RNA干扰载体能够显著抑制HMGB1在HUVEC细胞中的表达(mRNA:0.4635±0.0342比1.0340±0.0352,蛋白:0.4510 ± 0.0200比1.0210±0.0110,均P＜0.05).结论 成功构建了靶向HMGB1基因的shRNA真核表达载体pRNA-HMGB1,并获得了稳定表达靶向HMGB1基因的shRNA的HUVEC细胞株,为进一步研究HMGB1在HUVEC细胞株中的生物学功能和作用机制奠定了基础.     

Telomerase, cervical cancer, and human papillomavirus

Review of the available data indicates that telomerase is activated in the majority of cervical squamous cell carcinomas as it is in most malignant neoplasms. Telomerase activity can also be detected in some preneoplastic cervical lesions, but the significance of this in unclear, because nonneoplastic, proliferating epithelial cells also can have telomerase activity. The bias introduced by cytologic sampling methods can complicate the interpretation of results. Quantitative telomerase assays may be useful in distinguishing nonmalignant, physiologic activation of telomerase from malignant activation. Studies evaluating telomerase component (hTR or hTERT) expression by evaluation of RNA, mRNA, or antigen have yielded conflicting results, but the observation that many nonmalignant, nontelomerase active cells have detectable hTR and hTERT suggests that many cells express telomerase RNA and catalytic components, but do not have active telomerase. The implication is that a regulatory overlay must exist that controls telomerase activation. Activation of the enzyme in carcinogenesis could conceivably be a physiologic activation that normally accompanies cellular proliferation, a direct appropriation of telomerase activity by the neoplastic process, or both. The presence of inactive telomerase in many cells also raises the possibility of a noncatalytic function for the telomerase complex. An understanding of telomerase interaction with HPV infection in the pathogenesis of cervical neoplasia must await a further elaboration of telomerase regulation. Likewise, application of telomerase detection in cervical cancer screening programs must await a better integration of telomerase regulation in normal and specifically in HPV-infected squamous epithelial cells.     

白血病患者端粒酶活性及相关基因的表达

目的 研究端粒酶活性和相关基因表达在白血病患者中的变化及其在白血病发病机制中的意义。方法 通过半定量端粒重复序列扩增（TRAP）－银染和RT－PCR方法检测了47例白血病患者骨髓细胞的端粒酶活性和相关基因hEST2、TP1、hTR mRNA表达水平。结果 42例白血病进展阶段标本的端粒酶活性和相关基因表达水平高于急性白血病完全缓解期、慢性粒细胞白血病（慢粒）慢性期、正常和贫血标本（P＜0．01）;14例急性白血病完全缓解期和（或）慢粒慢性期标本端粒酶活性和TP1、hTR基因表达水平高于正常和贫血标本（P＜0．05）;在部分正常和贫血标本中检测到相对低水平的端粒酶活性和相关基因表达,3例贫血标本经短期常规培养后检测到端粒酶活性和基因表达增高。结论 端粒酶活性和相关基因表达异常升高是造血细胞恶性转化的特异性标记之五,检测端粒酶活性和相关基因表达有助于白血病患者的疗效观察。正常骨髓的端粒酶活性与具有增殖分化能力的造血干细胞有关。hEST2可能是端粒酶的正调控结构基因,hTR基因表达与端粒酶的反馈调控机制有关。     

AZT对白血病细胞株KG-1a细胞增殖和端粒酶活性的影响

本研究探索端粒酶抑制剂3’-叠氮-2’,3’-脱氧胸腺核苷(AZT)对人急性髓系白血病细胞株KG-1a细胞增殖和端粒酶活性的影响。用MTT法检测不同浓度AZT分别作用24、48、72 h时KG-1a细胞增殖水平;流式细胞术检测AZT对KG-1a细胞周期及细胞凋亡的影响;TRAP-PCR-ELISA法检测细胞端粒酶活性;RT-PCR法检测细胞端粒逆转录酶(hTERT)mRNA的表达。结果表明,AZT能抑制KG-1a细胞增殖,抑制作用具有时间和浓度依赖性;随AZT浓度的增加,处于S期的细胞数目减少,G2/M期细胞数目增加,且出现凋亡峰;AZT作用后实验组细胞的端粒酶活性降低,hTERT-mRNA表达下降,下调程度与AZT浓度呈正相关。结论:AZT在体外能明显抑制KG-1a细胞增殖,并诱导其凋亡,其机制与降低端粒酶活性、下调hTERT mRNA表达有关。     

脐血造血干/祖细胞端粒酶相关蛋白基因hTERT和TEP1的表达及意义

目的：探讨造血／干细胞端粒酶相关蛋白基因hTERT和TEP1在造血过程中对端粒酶活性的调节作用。方法：用RT-PCR和TRAP法分别测定脐血干／祖细胞中hTERT、TEP1mRNA及端粒酶的活性。结果：在新分离的脐血单个核细胞（MNC）和CD34^-细胞中检测不到端粒酶的活性，hTERTmRNA表达阴性；CD34^ 细胞中端粒酶活性低，hTERTmRNA阳性；而TEP1mRNA在MNC、CD34^－细胞和CD34^ 细胞中均为阳性，表达水平差异无显著性。在不同细胞因子组合条件下，CD34^ 细胞体外培养7d，细胞端粒酶活性和hTERTmRNA表达增高，之后随着细胞的分化成熟，二者表达降低，在整个培养过程中，TWEP1mRNA表达无明显变化。结论在脐血造血干／祖细胞中，hTERT基因表达水平与端粒酶活性一致，hTERT基因表达水平对端粒酶的活性起关键作用，TEP1基因作用较弱。     

p53基因对HL-60细胞端粒酶活性和人端粒酶逆转录酶基因表达的影响

为了研究野生型p53基因转染的HL-60细胞端粒酶活性和人端粒酶逆转录酶（hTERT)基因表达的变化，采用脂质体法将野生型p53基因转染HL-60细胞，用TUNEL检测细胞凋亡。用端粒重复扩增法（TRAP）-酶联免疫吸附试验（ELISA）检测端粒酶活性变化，以及用RT-PCR方法检测hTERTmRNA表达的变化。结果显示：转染野生型p53基因的HL-60细胞在32.5℃培养24小时和72小时后，凋亡率分别为8.3%和21.0%,hTERTmRNA和端粒酶活性分别下降至对照组的68.4%和55.8%及27.3%和8.9%。结论：p53基因能下调HL-60细胞hTERTmRNA和端粒酶活性。这可能是野生型p53基因诱导细胞凋亡机制之一。     

端粒酶RNA的反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究

目的研究端粒酶RNA的反义寡核苷酸(As-ODN)抗白血病作用及其机制。方法采用脂质体包裹As-ODN转染入HL-60细胞;用端粒重复序列扩增法(TRAP)-酶联免疫吸附试验(ELISA）检测HL-60细胞的端粒酶活性变化;用细胞形态学观察、DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术检测凋亡细胞。结果0.1～2.0?μmol/LAs-ODN转染入HL-60细胞,培养1～6?d,HL-60细胞端粒酶活性（A值）由1.043±0.045降至0.063±0.011,且有剂量依赖性和时间依赖性。As-ODN转染的HL-60细胞培养后细胞增殖速度减慢,发生了细胞凋亡。而错义寡核苷酸(Ms-ODN)则无此效应。结论As-ODN能特异性抑制HL-60细胞的端粒酶活性,诱导细胞凋亡。     

Treatment of bladder cancer cells in vitro and in vivo with 2-5A antisense telomerase RNA

Bladder cancer is the most common malignant tumor of the urinary tract. Novel treatment approaches are essential because of the failure of current treatment options to cure a high percentage of patients. Telomerase, a ribonucleoprotein, is detected in almost all bladder cancer, but not in normal bladder tissues. Therefore, telomerase is expected to be a very promising candidate for targeted therapy of bladder cancer. In this study, we synthesized a 19-mer antisense oligonucleotide against the RNA component of human telomerase (hTR) linked to a 2-5A molecule (2-5A-anti-hTR) and investigated its antitumor effect against bladder cancer cells. The 2-5A antisense strategy relies on the recruitment and activation of RNase L at the site of targeted RNA sequence. Here we demonstrate that treatment with 2-5A-anti-hTR reduced the viability of seven bladder cancer cell lines (UM-UC-2, UM-UC-3, UM-UC-6, UM-UC-9, UM-UC-14, RT4 and T24) expressing telomerase activity to 21-55% within 4 days. The cytotoxicity was mainly due to induction of caspase-dependent apoptosis. In contrast, normal fibroblast WI38 cells lacking telomerase activity were resistant to the treatment. Furthermore, treatment of subcutaneous UM-UC-2 tumors in nude mice with 2-5A-anti-hTR significantly suppressed the tumor growth through induction of apoptosis (P < 0.001). These findings may offer a strong support to the feasibility of the 2-5A-anti-hTR treatment for human bladder cancer.