大鼠背根神经节持续压迫后miRNA差异表达谱的分析及功能研究

摘要 目的：对大鼠背根神经节（dorsal root ganglion, DRG）持续压迫后所致神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）模型的DRG组织进行miRNA测序,应用生物信息学技术分析差异表达的miRNA及其靶基因在疾病中的定位与功能。 方法：采用随机分组法将大鼠分为2组,每组12只,分别为假手术组、CCD背根神经节持续压迫（chronic compression of the dorsal root ganglion, CCD）模型组,术后进行行为学检测。确定痛觉敏感的天数后重复造模,取材后进行miRNA转录组测序。利用生物信息学手段筛选具有显著性差异的miRNA,预测相关靶基因并对其GO功能及KEGG富集情况进行分析,使用在线数据库对miRNA与靶基因之间的属性关系建立miRNA-靶基因的调控网络。最后,通过qPCR验证差异最为显著的4条miRNA在CCD模型DRG组织中的表达情况。 结果：CCD造模7天后,大鼠痛觉最为敏感。重复造模,在第7天取材并进行miRNA转录组测序。将差异表达的miRNA以|log2（fold change）|>1且P<0.05为阈值,筛选符合要求的miRNA,与假手术组相比,有57种miRNA在CCD模型组表达上调,有17种miRNA在CCD模型组表达下调。差异表达的miRNA对应的靶基因主要富集在外泌体、细胞质、细胞膜、线粒体、内质网等结构,在细胞固有免疫、炎症信号传导、氧化应激等生物学过程中发挥重要作用,在PI3K-AKT、MAPK、JAK-STAT、钙信号等通路上均存在富集。经实验验证,miR-21-3p、miR-675-5p、miR-487b-5p、miR-3585-3p的表达与测序结果一致。 结论：在大鼠背根神经节慢性压迫所致NP模型的DRG组织中,异常表达的miRNA及其富集的相关信号通路可为NP诊断和治疗的新靶点提供新的思路。     

同种异体血液输注对创伤性失血患者血浆外泌体miRNA表达的影响

目的 通过观察异体输血对创伤性失血患者外泌体miRNA的差异表达,筛选出差异表达的外泌体miRNA,为后续靶基因和通路的研究奠定基础。方法 分别采集外伤患者在输异体血前和输血后外周血标本各3例,通过对血浆标本分离收获后的外泌体miRNA高通量测序,分析比较输血前后两组外泌体miRNA差异表达情况,同时以荧光定量PCR法进一步验证差异基因表达情况。结果 通过高通量测序分析,共测序到1570个miRNA存在差异表达,实验组比较对照组,上调的有1189个,下调的有381个,以倍数变化Foldchange≥2.0,P-value≤0.05作为差异miRNA筛选的阈值,筛选出显著变化的差异表达miRNA有14个,其中显著上调的miRNA有5个,分别为miR-499a-5p、miR-200a-3p、miR-372-3p、miR-novelchr12＿5583、miR-novel-chr22＿24253;显著下调的miRNA有9个,分别为miR-6852-5p、miR-452-5p、miR-1287-5p、miR-204-3p、miR-375-3p、miR-502-3p、miR-345-5p、miR...     

大鼠脊髓背角TRPV4在背根神经节持续受压致神经病理性疼痛中的作用

目的:探讨大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)持续受压(chronic compression of right side dorsal root ganglion,CCD)后脊髓背角瞬时感受器电位离子通道4(TRPV4)基因及蛋白变化,明确脊髓背角TRPV4在CCD致神经病理性疼痛中的作用。方法:采用健康成年雄性Wistar大鼠,共36只,随机分为3组,分别为空白对照组、CCD手术组、CCD+钌红组。制备大鼠背根神经节持续受压模型,于术前1天、术后第7天、给药前及给药2h后,测量大鼠机械刺激缩爪反应阈值,观察机械痛阈的变化;利用RT-PCR及Western Blot技术检测各组大鼠手术侧脊髓背角TRPV4基因及蛋白表达的变化。结果:与空白对照组相比,术后第7天,CCD组大鼠术侧机械痛阈值明显下降(P0.001),同侧脊髓背角TRPV4基因及蛋白表达升高(P0.05);与给药前相比,给予钌红2h后,术侧机械痛阈值明显升高(P0.001),同侧脊髓背角TRPV4基因及蛋白表达下降(P0.05)。结论:CCD后大鼠术侧机械痛阈下降,脊髓背角TRPV4基因及蛋白表达升高;钌红可部分逆转CCD后痛觉过敏,部分降低脊髓背角TRPV4基因及蛋白表达。脊髓背角TRPV4参与CCD后大鼠神经病理性疼痛形成。     

不同碘水平下甲状腺结节患者血清外泌体中miRNA生物学标志物的筛选* "(1., b.流行病学教研室,济南250000;2.,山东成武274200;3.泰安市中心医院a.甲状腺外科, b.检验科,山东泰安271000;4.山东第一医科大学第二附属医院a.甲状腺外科,b.检验医学科,山东泰安271000)

摘要:目的比较不同碘水平下甲状腺结节患者与健康人血清外泌体微小核糖核酸( microRNA, miRNA)表达谱的差异,分析其共同点,为筛选不同碘水平下甲状腺结节早期诊断标志物提供参考依据。方法收集10例不同碘水平下甲状腺结节患者及体检健康者的外周血样本,采用砷饰催化分光光度法测定各组血清碘水平;提取外泌体miRNA,利用高通量测序技术测定血清miRNA的表达水平;预测差异靶基因,并进一步进行CO( Gene ontology)分析和KECG(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)分析。结果在不同碘水平的甲状腺结节患者与健康人群中存在6个表达下调的miRNA,分别为 miR-324-5p.miR-6511b-3p, miR-9903 ,miR-550a-3p、miR-50O1-3p、miR-3688-3p。差异表达的外泌体 miRNA可调控MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、VEGF信号通路及NF-KB信号通路。结论筛选出6个差异表达miRNA,有望作为不同碘水平下甲状腺结节早期诊断的生物学标志物。     

脐带间充质干细胞分泌的外泌体对骨性关节炎模型大鼠的镇痛作用

目的:观察脐带间充质干细胞分泌的外泌体对骨性关节炎模型大鼠疼痛行为、软骨修复及背根神经节(DRG)中转录激活因子3(ATF-3)及生长相关蛋白43(GAP-43)表达的影响,并探讨外泌体治疗关节炎疼痛的可能机制。方法:采用随机数字表法将54只雄性SD大鼠分为假手术组、模型组和外泌体组,每组18只,除假手术组外,其余2组...     

大鼠坐骨神经切断后P-Erk1/2在相应背根神经节中的表达变化

目的研究坐骨神经切断后P-ERK1／2在成年大鼠相应背根神经节中的表达变化。方法选取健康成年雄性Wister大鼠80只,随机分为假手术组和坐骨神经切断组,分别于术后1、2、4、6、8周五个时相处死后取患侧L4-L6背根神经节,应用Western Blot和免疫组织化学技术检测P-ERK1／2在背根神经节中的表达变化．将两组所得数值进行统计学分析。结果假手术组中背根神经节中P-EILK1／2,有少量表达并维持一定的水平．坐骨神经切断组,1周时P-ERK1／2表达已经增加并达高峰,2周后逐渐下调,8周恢复至对照组水平。结论坐骨神经切断后可通过激活MAPK／ERK1／2信号通路的方式,对背根神经节中感觉神经元的凋亡进行调控。     

肝星状细胞来源外泌体不同提取方法的比较

目的采用超速离心法(UC)和优化后的排阻超滤组合法提取肝星状细胞(HSC)来源外泌体,比较两种提取方法所得外泌体的纯度、浓度和总蛋白量。方法分别用UC法和优化后的排阻超滤组合法提取HSC来源外泌体。使用透射电镜观察外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)检测外泌体浓度及大小,二喹啉甲酸(BCA)试剂盒检测外泌体总蛋白浓度,Western blotting法检测外泌体表面标志物肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)、分化抗原9(CD9)的表达。结果两种方法均可得到圆盘形的30~150 nm膜性囊泡。优化后的排阻超滤组合法所得外泌体,在电镜下可见明显的“茶托”形结构,背景较干净,纯度较高。UC法和优化后的排阻超滤组合法所得外泌体浓度分别为2×10^9、3.6×10^11 particles/ml,平均粒径分别为112.6、121.7 nm。优化后的排阻超滤组合法所得外泌体总蛋白浓度及TSG101的表达高于UC法。结论优化后的排阻超滤组合法虽然操作繁琐,成本较高,但提取的HSC来源外泌体浓度、总蛋白浓度和纯度较超速离心法高,可以作为外泌体分离的有效方法。     

急性心肌梗死患者血浆外泌体miR-21-3p/PTEN/AKT 表达水平及诊断价值研究

目的　探讨急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）患者血浆外泌体miR-21-3p/PTEN/AKT 表达水平及诊断价值。方法　选取2019 年2 月~ 2021 年8 月于陕西省汉中市三二〇一医院内分泌与风湿免疫科住院并诊断为急性心肌梗死的120 例患者作为AMI 组,另选同期在该科住院,经冠脉造影发现冠脉无明显狭窄患者120 例为对照组。提取所有研究对象的血浆外泌体,并采用透射电镜和Western blot 鉴定。qRT-PCR 法检测外泌体中miR-21-3p 表达水平,Western blot 检测外泌体中蛋白酪氨酸酶基因（PTEN）和丝苏氨酸激酶（AKT）蛋白的表达水平。Pearson 相关分析明确AMI 患者血浆外泌体中miR-21-3p,PTEN 与AKT 表达水平之间的相关性。绘制受试者工作特征（receiver operatorcharacteristic curve,ROC）曲线,根据曲线下面积（area under curve, AUC）分析血浆外泌体miR-21-3p,PTEN 及AKT对AMI 的联合诊断价值。结果　透射电镜观察到,血浆外泌体呈双层膜的泡状结构,且外泌体特征蛋白CD9,CD63和CD81 在外泌体中表达明显升高。与对照组相比,AMI 患者的miR-21-3p（1.45±0.31 vs 1.05±0. 17）和AKT（1.23±0.27 vs 1.03±0.15）表达显著上升,而PTEN（0.68±0.10 vs 1.01±0. 23 ）表达水平显著下降,差异有统计学意义（t=125.735,112.628,72.309,均P ＜ 0.001）。Pearson 相关性分析显示,AMI 患者血浆外泌体中miR-21-3p 和PTEN 呈明显负相关（r=-0.440,P=0.000）,PTEN 和AKT 呈明显负相关（r=-0.674,P =0.000）,而miR-21-3p 和AKT 之间无明显相关性（r=-0.072,P=0.438）。ROC 曲线结果显示,血浆外泌体miR-21-3p,PTEN 及AKT 单独检测时,其对应曲线下面积（AUC）分别为0.805,0.782 及0.720,联合检测时AUC 为0.885,比单独检测更具有诊断价值,差异有统计学意义（P<0.001）。结论　AMI 患者血浆外泌体中miR-21-3p 表达上升,其与PTEN 呈负相关,PTEN 又负向调控AKT 表达。三项指标均可作为辅助诊断AMI 的潜在标志物,且联合检测对AMI 有较高的诊断价值。     

血清外泌体来源的miRNA-122对肝癌诊断的研究

目的探讨原发性肝癌(HCC)患者血清中外泌体来源的miRNA-122的表达水平,以评价其在肝癌早期的诊断价值。方法以外泌体提取试剂盒分离纯化HCC患者和健康体检者血清中外泌体,通过蛋白免疫印迹(Western blot)检测Hsp70,CD63和Alix外泌体标记蛋白分子,透射电镜鉴定血清外泌体形态;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测82例HCC患者和79例健康体检者中miRNA-122的水平;以外泌体miRNA-122水平鉴别HCC患者和健康体检者的诊断效能。结果 Western blot显示出血清外泌体Hsp70,CD63和Alix等标记分子的表达,透射电镜鉴定外泌体形态符合一般外泌体特征;qRT-PCR结果表明,HCC组中的miRNA-122[log10(0.62±0.89)]较健康对照组[log10(-0.78±0.77)]血清外泌体升高,差异有统计学意义(P0.001);血清外泌体来源的miRNA-122诊断肝癌的敏感度为81.93%、特异度为82.05%,曲线下面积为0.89(95%CI:0.84~0.94)。结论血清外泌体来源的miRNA-122可作为一种新的肿瘤标志物用于原发性肝癌的早期临床诊断。     

肝癌细胞HepG2外泌体对其自身生长行为的影响及其机制研究

目的探讨肝癌细胞HepG2外泌体对细胞增殖、迁移、周期和凋亡的影响及其机制。方法培养肝癌细胞HepG2并用差速离心法提取其外泌体,采用粒径分析、透射电镜、蛋白质印迹法(Western blot)等方法对其进行鉴定。将外泌体与肝癌细胞HepG2共培养,采用细胞划痕实验比较其对细胞增殖能力的影响;采用Transwell实验比较其对细胞迁移能力的影响;采用流式细胞仪分析其细胞周期变化;采用实时荧光定量PCR检测实验组和对照组的细胞周期蛋白(Cyclin D)、细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1(CKS1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关x蛋白(Bax)的相对表达水平。结果提取后的外泌体经过Western blot实验,CD63和CD9均有条带出现,颗粒大小在30～100nm,电镜形态正常。与对照组比较,实验组的细胞增殖率较高,肿瘤迁移能力提升;细胞G1期缩短,G2期延长;Cyclin D、CKS1和Bax相对表达水平均上升,Bcl-2相对表达水平降低。结论肝癌细胞HepG2外泌体通过调控Cyclin D、CKS1基因缩短其细胞周期,调控Bax、Bcl-2基因抑制细胞凋亡,从而对其增殖和迁移能力起促进作用。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

The characteristics of interpretation of results of analysis of protein amount in urine of pregnant women

The adequacy of implementation of present proteinuria diagnostic thresholds under examination of pregnant women was examined. The analysis was applied to all urine samples of pregnant women from December 2009 to March 20010. The amount of protein in urine was concurrently evaluated by turbidimetric analysis with sulfosalicylic acid, colorimetric analysis with pyrogallol red, "dry chemistry" technology (the diagnostic strips). It is established that the mentioned techniques of analysis of protein in urine provide independent results. The results of colorimetric analysis are characterized by better precision and adequacy. However, in case of pregnant women the diagnostic threshold of protein concentration should be shifted from 0.120 to 0.150 g/l.     

超声评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响

目的 探讨超声在评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响的价值。方法 回顾性收集经病理学证实为头颈部肿瘤、放疗前后的颈动脉超声资料以及其他基线资料完整的患者93例,比较放疗前后放疗侧颈动脉和非放疗侧颈动脉粥样硬化斑块和溃疡斑块的总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积。结果 放疗前后颈动脉超声检查的平均间隔时间为（6.1±1.9）年;放疗前放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积与非放疗侧比较差异均无统计学意义（P均>0.05）;放疗后放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积均较非放疗侧加重,差异有统计学意义（P均<0.05）。结论 放疗可导致头颈部肿瘤患者颈动脉粥样硬化斑块的形成和进展,且斑块具有易损性特点。     

心力衰竭病人延续性护理现状调查

[目的]了解心力衰竭病人延续性护理实施现状,探讨心力衰竭病人延续性护理方法及发展方向。[方法]用自行设计的调查问卷对114例心力衰竭病人的一般资料、自我护理状况及生活质量进行调查。[结果]不同文化程度、性别、职业、婚姻状态的病人生活质量得分不同,差异有统计学意义(P0.01),病人出院后的延续性护理以家人照顾为主,自我护理状况不理想。[结论]延续性护理模式在我国尚属初步实施阶段,临床医护工作者应积极倡导实施,鼓励家属参与及进行社区护理干预提高病人自我护理能力,提高生活质量。     

Evaluation of the aesthetics of physical methods of euthanasia of anesthetized rats

Dissection of living brain tissue for in vitro experiments requires the use of a rapid euthanasia method. However, the method must not subject animals to unnecessary pain and must be aesthetically acceptable to experimenters. The purposes of the current study were to assess the aesthetics of 6 euthanasia methods, measure the procedure duration, and evaluate brain for pathology after each procedure. We digitally recorded euthanasia of isoflurane-anesthetized rats by 6 physical methods: anesthetic overdose, cardiac exsanguination, decapitation, closed intrathoracic transection of the great vessels and heart, thoracic percussion, and thoracotomy with rupture of great vessels. Volunteer researchers and animal caretakers watched the video and completed an associated questionnaire. Anesthetic overdose and cardiac exsanguinations were rated most aesthetically pleasing, although these procedures took the longest to complete. In contrast, decapitation and thoracic percussion were the least aesthetically pleasing, but these methods were the quickest. No demographic factor was identified that could predict whether a given euthanasia procedure would be favored for aesthetic reasons, and participants provided a wide variety of rationales for the aesthetic ratings they assigned. Although all of these euthanasia methods meet the criteria of approved methods of euthanasia of anesthetized rats as defined by the AVMA, aesthetic features and the scientific need for rapid euthanasia are both considerations in selecting a method.