改良Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法体外分离培养大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞

背景:目前常用的嗅鞘细胞培养方法有差速贴壁法、化学抑制法、抗体亲和吸附法、补体法等,各自均存在优缺点,单一使用某种方法时细胞纯化率较低.目的:拟采用改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法体外分离纯化大鼠嗅球及嗅黏膜来源的嗅鞘细胞.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察.于2007-11/2008-05在武汉大学人民医院骨科实验室和消化内科实验室完成.材料:10周龄Sprague-Dauley大鼠10只,由武汉大学人民医院实验动物中心提供,阿糖胞苷由武汉大学人民医院制备.方法:完整取大鼠双侧嗅球及剪取鼻中隔后1/3嗅黏膜,剪碎后胰酶消化,制成单细胞悬液,按1×109L-1密度接种于末包被的25 cm2玻璃培养瓶中,18～20 h后将细胞悬液转移至另一未包被的25 cm2玻璃培养瓶中(第1次差速贴壁),24 h后再将细胞悬液转移至经多聚右旋赖氨酸包被的25 cm2塑料培养瓶或经多聚右旋赖氨酸包被的6孔培养板中(第2次差速贴壁),接种培养48 h后半量换液以去除杂细胞.在差速贴壁培养后二三天,加入3.0～5.0 pmol/L阿糖胞苷去除残余成纤维细胞.主要观察指标:嗅鞘细胞的形态观察、分裂增殖情况、免疫荧光染色鉴定结果及纯度测定.结果:体外培养24 h嗅球源性嗅鞘细胞即可贴壁,而嗅黏膜源性嗅鞘细胞多在培养四五天后贴壁,两种来源的嗅鞘细胞形态相似,以双极或梭形细胞为主,少量为3极及多突起形多级细胞,同时夹杂扁平、煎鸡蛋形细胞.纯化培养10 d的嗅鞘细胞,胶质纤维酸性蛋白、神经生长因子受体p75免疫荧光染色及神经生长因子受体p75+hoechs免疫荧光双染后大部分双极或多极细胞膜、胞体、突起呈阳性,细胞纯度可达90%以上.结论:改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法可在体外成功分离培养出高纯度的嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞,嗅球源性嗅鞘细胞贴壁时间及分裂增殖程度优于嗅黏膜源性嗅鞘细胞.     

单次差速贴壁法纯化培养大鼠嗅神经鞘细胞的实验研究

目的:探讨单次差速贴壁法纯化培养成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的可行性.方法:选取8～10周龄的成年SD大鼠,无菌条件下切取嗅球、剪碎,胰酶消化制成细胞悬液后接种,采用18 h单次差速贴壁的方法纯化培养嗅鞘细胞,定期在倒置显微镜下观察嗅鞘细胞的形态学变化及生长情况,并对其行神经生长因子受体p75抗体(NGFR p75)及碘化丙啶的免疫荧光鉴定,同时计算嗅鞘细胞的纯度.结果:通过18 h单次差速贴壁法纯化培养的嗅鞘细胞经NGFR p75免疫荧光鉴定后,纯度可达70%～80%,形态上以双极和三极细胞为主,伴有少许单极及多极细胞.结论:应用18 h单次差速贴壁法纯化培养嗅鞘细胞是一种简便、稳定、经济、快捷的方法.     

改良差速贴壁＋无血清条件培养液纯化培养大鼠嗅鞘细胞

背景:细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,嗅鞘细胞被认为是最适合的种子细胞之一,但目前对其培养纯化的方法尚无公认标准.目的:运用改良差速贴壁法+含同源嗅鞘上清液的无血清条件培养液来纯化培养嗅鞘细胞,以期建立一种新颖、经济、简单、实用的纯化培养成年大鼠嗅鞘细胞的方法.设计、时间和地点:观察性对照实验.实验于2008-02/06在苏州大学干细胞与组织工程实验室完成.材料:健康成年SD大鼠6只.体质量150-180 g.方法:①无菌条件取大鼠嗅球组织,消化、离心去除上清液后,用含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬,稀释的单细胞混悬液均分成3份,分别用于单纯改良差速贴壁、单纯无血清条件培养液纯化和改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化的实验.②单纯改良差速贴壁:将单细胞混悬液以8000个/cm2密度种植于无包被的25 cm2培养瓶中.经12 h+24 h两次差速培养后,吸出细胞上悬液,计数板计算浓度后,按1×109L-1浓度重新种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中继续培养3周.⑧单纯无血清条件培养液纯化:将单细胞混悬液用预先收集并制备的含同源嗅鞘培养上清液的无血清条件培养液直接种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中,孵育两三天后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F12培养基继续培养3周.④改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化:经12 h+24 h两次差速纯化,吸出上悬液接种于培养皿中继续培养2.0～3.0 d后,改换成无血清条什培养液,孵育36～48 h后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F-12培养基继续培养.以后视情况每3～5 d半量换液1次,培养3周.主要观察指标:运用倒置显微镜观察各组不同时间的嗅鞘细胞生长状况和形态学特征.采用GFAP、NGFRp75和Hoechst33258等抗体,于分离培养14 d后进行细胞免疫荧光染色并检测嗅鞘细胞的纯度.结果:①倒置显微镜观察:差速后3 d内有大量细胞贴壁生长,细胞形态较混杂,辨认嗅鞘细胞较困难.差速后再运用无血清条件培养液2 d后,可见纯度较高的典型嗅鞘细胞形态,以双极梭形和多极为主,细胞突起细长.伴少量扁平状"油煎蛋样"细胞.继续培养至14 d可见细胞立体感及折光性最佳,数量和纯度最高.培养3周后3组细胞开始老化,活力明显下降,成纤维等杂细胞开始挤占原嗅鞘细胞生长空间.②免疫荧光染色显示嗅鞘细胞特异性表达GFAP和NGFRp75,单纯差速后嗅鞘细胞纯度仅有72%～75%,单纯无血清条件培养液纯化后仅为48%～52%,改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化组纯度可达88%～92%.结论:实验建立了完善的成年大鼠嗅鞘细胞培养纯化新方法.     

成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化实验

背景:嗅鞘细胞的纯化方法以及嗅鞘细胞纯度的不同被认为与嗅鞘细胞移植后的效果有关。因此,开发高效、便于统一的纯化方法对嗅鞘细胞移植研究的标准化非常重要。目的:为嗅鞘细胞移植研究的标准化提供一个高效、便于统一的纯化方法。设计:随机对照实验。单位:东南大学临床医学院附属中大医院骨科,东南大学临床医学院中心实验室,东南大学临床医学院实验动物中心。材料:实验于2006-02/08在东南大学临床医学院中心实验室完成。选用28只成年雌性SD大鼠,体质量200￣250g;DMEM/F-12(GIBCO);2.5g/L胰蛋白酶(GIBCO);左旋多聚赖氨酸(SIGMA);牛垂体萃取液(SIGMA);胎牛血清(杭州四季青生物试剂公司);兔抗p75抗体(SIGMA);生物素化羊抗兔IgG(武汉博士德生物技术公司);MTT试剂盒(SIGMA)。方法:将SD大鼠嗅球中分离出嗅鞘细胞的原代培养物,体外培养8d,将培养物分为4组:差速贴壁组、免疫吸附组、改良方法组、对照组。①改良方法组细胞悬液接种到未经包被的培养瓶在37℃、体积分数为0.05CO2的环境中孵育1h,将上清液接种到培养瓶中(底面用1mg/L的兔抗p75抗体润湿后在37℃下烘干,再用DMEM/F-12洗涤1次)。上清液在这种已包被兔抗p75抗体的培养瓶中37℃、体积分数为0.05CO2下孵育45min,DMEM/F-12洗涤5遍以清除未贴壁的细胞,用细胞刮刀收获贴壁细胞、离心、重新悬浮在含20mg/L牛垂体萃取液和10万U/L青链霉素的D/F-10S中;Nash差速贴壁组细胞按Nash的方法进行操作;抗p75抗体免疫吸附组细胞按照Ramo’n-Cueto的方法进行操作;上述纯化方法获得的3组细胞悬液分别接种到包被左旋多聚赖氨酸的24孔细胞培养板中,在37℃、体积分数为0.05CO2的环境中培养14d。对照组未经纯化的细胞悬液同样重新悬浮在含20mg/L牛垂体萃取液和10万U/L青链霉素的D/F-10S中并接种到包被左旋多聚赖氨酸的24孔细胞培养板中,培养条件同其他组。②在各组处理结束后2,5,8,10,12,14d进行嗅鞘细胞纯度比较,每组每个时间点都随机选择15个视野计算嗅鞘细胞比例,这15个数值的平均值代表嗅鞘细胞纯度,从而评估这种改良方法的纯化效率。③分别用MTT法检测处理后第14天各组细胞活力。主要观察指标:各组嗅鞘细胞纯度、处理后14d细胞活力检测结果。结果:①改良方法组每个时间点的嗅鞘细胞纯度都高于其他3组(P<0.05～0.01),各组嗅鞘细胞纯度都随培养时间延长而降低,但改良方法组的纯度变化最小,改良方法组最后1个时间点的纯度仍然很高(92.1±1.2)%,而其他组最高只有(85.2±2.2)%。②处理结束后第14天,改良方法组嗅鞘细胞细胞活力与其他组细胞活力差异无显著性(P=0.895)。结论:本组纯化成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的改良方法是高效的,而且对嗅鞘细胞的活力无额外损害,将有益于嗅鞘细胞研究的标准化。     

酶消化法体外分离培养的大鼠嗅鞘细胞形态及表型特征

目的:目前国内外研究介绍的嗅鞘细胞培养方法存在繁杂或重复性差的问题,不利于实际应用。为此实验应用酶消化法体外分离培养大鼠嗅鞘细胞,观察其形态学及表型特征。方法:实验于2005-11/2006-03在上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所完成。①选取新生1周龄雄性SD大鼠1只,浸入体积分数为0.75的乙醇中3min,碘伏消毒。打开前颅,暴露嗅球,完整取下两个嗅球,放入4℃预冷的DMEM抗菌液中清洗2遍,洗掉嗅球表面的血液等杂质,剥下嗅球被膜,将嗅球用眼科剪剪碎,加入质量浓度为2.5g/L的胰酶,在37℃孵育箱磁力搅拌下孵育15min,DMEM终止消化。细胞液过100μm细胞筛,离心去除上清液,用DMEM稀释细胞浓度至1×109L-1,种植于无包被处理的6孔细胞培养板内常规培养。按差速贴壁法在培养18～20h后吸出细胞悬液,重新种植于包被神经生长因子低亲和力受体p75的6孔细胞培养板内。观察细胞生长情况,每2～3d换液1次,培养14d。②将培养不同时间的嗅球成鞘细胞于倒置显微镜、透射电镜下观察其形态变化,并行苏木精-伊红染色。使用免疫组化法检测嗅鞘细胞的特征性标志神经生长因子低亲和力受体p75的表达情况,阳性表达为棕黄色,无着色为阴性。结果:①倒置显微镜形态学观察:差速贴壁培养第2天可见有较多嗅鞘细胞贴壁生长,细胞突起较短,胞体较大,透亮度一般,成团或散在生长,较难辨认细胞的形态。5～6d可见较典型的嗅鞘细胞形状,主要以梭形和多突起细胞为主,细胞立体感强、透亮、杂质细胞较少、本底清楚,亦可见有少量成纤维细胞开始生长。9d时嗅鞘细胞数量明显增加,其生长方向呈较一致的条索状。至14d无论在细胞数量及质量上都呈明显的降低趋势。②苏木精-伊红染色结果:细胞多呈梭形,还可见扁平细胞,核为圆形或椭圆形,有时见双核,胞浆充实无空泡。③透射电镜形态学观察:细胞形态多为双极梭形,少数为3极,核不规则,核膜明显,可见核仁,染色质均匀分布于核中,异染色质可在核膜下形成块状结构,胞体表面有伪足样短突起,胞浆内有丰富的粗面内质网系统及线粒体。胞膜有时可见伪足样突起形成皱褶。④神经生长因子低亲和力受体p75免疫组化检测结果:大鼠嗅鞘细胞神经生长因子低亲和力受体p75免疫反应呈阳性。结论:酶消化法体外分离培养的大鼠嗅鞘细胞表达特征性标志神经生长因子低亲和力受体p75。     

体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法：差速贴壁＋阿糖胞苷＋胰酶法

目的:通过细胞形态学观察及生物学特性鉴定,建立一种经济实用的体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法。方法:实验于2006-06在武汉理工大学完成。①阿糖胞苷(Sigma,批号w10562);胎牛血清(杭州四季青产品);胰蛋白酶(Amresco);多聚赖氨酸(Sigma);胶质纤维酸性蛋白,神经生长因子受体蛋白抗体(博士德)。②选取出生3d内的Wistar大鼠5只,乙醇浸泡后断头处死,取嗅球的最外两层,通过1.25g/L胰蛋白酶消化分离嗅鞘细胞,体外原代培养。③采用Nash差速贴壁 阿糖胞苷 胰酶法纯化嗅鞘细胞。培养18h后将未贴壁的细胞悬液转种于另一未涂层的器皿中,再培养36h,重复上述步骤移入0.1g/L多聚赖氨酸包被的塑料培养瓶中进行培养,纯化后的细胞在24h内陆续贴壁,常规培养2d,加入终浓度为2mg/L的阿糖胞苷,作用48h后,换上新的培养基,继续培养1d,弃去培养基,用无钙镁的Hanks液清洗2次,然后用1.25g/L的胰酶消化10min,待细胞突起回缩、胞体变圆时,立刻加入纯血清终止,其血清终浓度为20%,制备单细胞悬液。④倒置显微镜下观察其形态变化,苏木精-伊红染色,同时行神经生长因子受体蛋白和胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定嗅鞘细胞,并计算嗅鞘细胞阳性百分率。结果:①活细胞形态观察:分离培养的嗅鞘细胞具有双极或多极突起,且突起细长,相互交织。②嗅鞘细胞的苏木精-伊红染色鉴定:细胞呈三角形或梭形,有长的突起,胞浆被染成粉红色,胞核呈蓝紫色,胞核内深染的为核仁,有1～3个核仁。③嗅鞘细胞的胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定:细胞呈现棕黄色,胞核淡染,阳性细胞成网状连接,胞体多为三角形,有细长突起,阳性率91.5%。④嗅鞘细胞的P75免疫组化染色鉴定:阳性细胞呈绿色,多数细胞染色阳性,阳性率89%。结论:实验所采用的Nash差速贴壁 阿糖胞苷 胰酶法分离纯化培养嗅鞘细胞切实可行,为神经诱导修复材料的研究提供种子细胞。     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法;密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想.目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法.方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度.结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高.     

冷酶消化法分离和培养新生大鼠许旺细胞

背景：常规酶消化法在许旺细胞分离培养实验中应用较多,但由于胰蛋白酶在37℃超过30min对细胞有毒性作用,会对许旺细胞的数量和纯度有一定的影响。目的：探索快速分离和培养大量许旺细胞的新方法。方法：采用4℃胰蛋白酶消化剥离好的乳鼠坐骨神经6~18h分离许旺细胞,培养一段时间,进行MTT实验绘制细胞生长曲线和苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色观察许旺细胞的形态,并对阳性细胞进行计数。结果与结论：结果得到的细胞数量超过1×106,经抗S-100蛋白免疫组织化学染色对细胞进行鉴定,细胞纯度达到90%以上。从培养的细胞形态和细胞生长曲线可见,冷酶消化法是一种简单快捷的方法,其细胞具有良好的生物学特性,在分离时间、细胞数量和纯度、细胞的生物活性均达到临床上的要求。     

冷酶消化法分离和培养新生大鼠许旺细胞

背景:常规酶消化法在许旺细胞分离培养实验中应用较多,但由于胰蛋白酶在37℃超过30min对细胞有毒性作用,会对许旺细胞的数量和纯度有一定的影响。目的:探索快速分离和培养大量许旺细胞的新方法。方法:采用4℃胰蛋白酶消化剥离好的乳鼠坐骨神经6~18h分离许旺细胞,培养一段时间,进行MTT实验绘制细胞生长曲线和苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色观察许旺细胞的形态,并对阳性细胞进行计数。结果与结论:结果得到的细胞数量超过1×106,经抗S-100蛋白免疫组织化学染色对细胞进行鉴定,细胞纯度达到90%以上。从培养的细胞形态和细胞生长曲线可见,冷酶消化法是一种简单快捷的方法,其细胞具有良好的生物学特性,在分离时间、细胞数量和纯度、细胞的生物活性均达到临床上的要求。     

比较羊水细胞原位培养法和胰酶消化法在产前诊断染色体检查中的应用价值

目的 比较载玻片-原位培养法(以下简称原位法)和胰酶消化法在羊水细胞染色体检查中的应用价值。方法 选取2020年7—12月来该院进行产前诊断的1 105例孕妇的羊水标本,分别采用原位法和胰酶消化法进行培养、收获及制片,成功制片后用GSL-120扫描、捕获核型,对两种方法的羊水细胞培养成功率、培养时间、分裂相、核型结果等进行比较分析。结果 1 105例羊水标本同时采用原位法、胰酶消化法两种方法进行培养,这两种方法的培养成功率的差异无统计学意义(χ²=0.33,P>0.05)。原位法和胰酶消化法羊水需求量分别为5、10 mL,培养基用量分别为7、8 mL。与胰酶消化法相比,原位法羊水细胞培养时间短,分裂相及优质分裂相数目多,差异均有统计学意义(Z=-31.83,P<0.001;Z=-2.937,P=0.003;Z=-2.943,P=0.003)。两种方法的羊水染色体核型分析均检出972例正常核型、128例异常核型,其中染色体数目异常真嵌合7例,染色体核型结果符合率为100%。结论 与胰酶消化法相比,原位法具有培养时间短、培养基用量少、羊水需求量少、操作步骤...     

成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分离培养及鉴定

目的:已证实来自嗅球及鼻腔嗅黏膜的嗅鞘细胞均能够促进中枢神经系统轴突再生.目前用于移植的嗅鞘细胞多来源于嗅球,因嗅黏膜在取材上更加快捷、安全且易于临床应用,本实验拟进一步验证改良Nash差速贴壁法分离培养鼠鼻腔嗅黏膜细胞后,获取嗅鞘细胞的情况.方法:实验于2007-01/09在新疆医科大学第一附属医院实验动物科学研究部完成.①动物:清洁级SD大鼠4只,由新疆医科大学动物实验中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:大鼠麻醉后断头,去除额骨和鼻骨,完整取下包含嗅黏膜和骨质的鼻中隔,中性蛋白酶Ⅱ 胰酶联合消化,离心去上清,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液,种植于无多聚赖氨酸包被处理的培养皿,18 h后将培养液吸出过滤,种植于另一个无多聚赖氨酸包被处理的培养皿,继续培养36 h后,加入适量培养液与原培养液混匀,重新种植于包被多聚赖氨酸的24孔细胞培养板.③实验评估:倒置相差显微镜下观察细胞生长情况,于体外培养第5,7,10,14天进行免疫细胞化学鉴定.通过活细胞镜下观察和免疫细胞化学染色相结合,计算嗅鞘细胞纯度.结果:①细胞形态学观察:培养的嗅鞘细胞主要呈双极(梭形)、三极及扁圆形,其中以双极(梭形)细胞为主.②免疫细胞化学特征:大部分双极(梭形)、三级细胞呈胶质纤维酸性蛋白或神经生长因子受体p-75免疫反应阳性,少量扁圆细胞也呈胶质纤维酸性蛋白或神经生长因子受体p-75阳性.③嗅鞘细胞数量与纯度:随着培养时间的延长,嗅鞘细胞数量逐渐增多,14 d左右可达平台期.培养6～10 d的细胞纯度约为80%.结论:采用改良Nash差速贴壁法成功分离培养出嗅黏膜嗅鞘细胞,简单实用,嗅鞘细胞纯度较高.     

大鼠嗅球嗅鞘细胞的体外分离培养及纯化

背景:差速贴壁+Thy1.1抗体及补体纯化法的应用较多,细胞换液过程中使用含血清的培养基主要针对成纤维细胞的去除,而对神经元的去除作用不明显.目的:根据神经元体外培养需要血清的特性,拟利用无血清培养基在体外建立一种分离培养嗅鞘细胞的简单方法.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/2009-01在哈尔滨医科大学动物实验中心完成.材料:成年SD大鼠10只,由哈尔滨医科大学实验动物中心提供.方法:在差速贴壁+Thy1.1抗体及补体纯化法的基础上,剪开大鼠颅骨,显露位于颅腔前方的嗅球,取出2只嗅球,在显微镜下去除嗅球表面的软脑膜和毛细血管及外周组织,保留富含嗅鞘细胞的嗅神经层和嗅球颗粒层,剪成1 mm3小块分离获取单细胞悬浮液,调整细胞密度至1×107L-1,接种在用poly-l-lysine包被的培养瓶或培养板中,于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养,第3天用无血清DMEM/F12培养基换液培养.主要观察指标:嗅鞘细胞的形态学观察、生长曲线分析、免疫荧光染色结果.结果:培养前3 d细胞数目无明显增加,甚至减少;然后细胞数目逐渐增多,13d细胞基本长满;传10代后细胞形态发生明显变化,胞浆内出现许多空泡,细胞增殖速度减慢或停止.纯化培养10 d后,培养板内双极和三极细胞均呈GFAP,NGFRp75阳性.结论:在差速贴壁+Thy1.1抗体及补体纯化法的基础上,利用无血清DMEM/F12培养基进行换液培养可使嗅鞘细胞迅速增殖,是一种效率较高的体外培养方法.     

人胚胎嗅鞘细胞的分离培养与纯化

目的：大量的实验证实，嗅鞘细胞是能促进已损伤的中枢神经重新恢复功能最有效的种子细胞之一。实验拟建立一种简便易行、省时、经济，临床应用更安全，临床效果更好的培养和纯化嗅鞘细胞的方法。 方法：实验于2004—12／2006—12在山东省泰安荣军医院细胞实验室完成。流产胚胎（4～6个月，由家属自愿捐献）。实验方法：在无菌条件下，用显微外科器械将胚胎的嗅球取出，在解剖显微镜下仔细剥离嗅球表面的软膜和血管，尽量保持嗅球完整性，然后用眼科剪反复剪碎，剪成0．5～1．0mm^3大小的组织块，将组织块移人离心管内，加入含有13％胎牛血清的D／F12培养液，用弯头吸管来回轻轻吹打组织块制成细胞悬液，用含有阿糖胞苷的无血清纯化液纯化嗅鞘细胞，胰蛋白酶消化收集细胞，制成单细胞悬液并进行计数。 结果：胚胎嗅鞘细胞在24h后开始部分贴壁，胞体呈球形、星形，有一个甚至多个突起，但突起短小。贴壁3d后，大部分细胞迅速生长，突起延伸变长。贴壁5～7d后，随着培养时间的延长，嗅鞘细胞成簇密集排列生长，细胞突起相互交织越来越多，形成网状。可见3种比较典型的嗅鞘细胞：双极或梭形、多突起形和扁圆或油煎蛋形。主要以梭形和多突起形细胞为主。细胞培养至7～14d时细胞数量不再有明显增加，但是细胞仍生长旺盛，活性好，细胞纯度高达95％～98％。 结论：实验建立的人胚胎嗅鞘细胞培养的方法简便易行，经济，细胞纯度较高。     

嗅鞘细胞与神经干细胞共培养后增殖及向神经元的分化

背景: 影响神经干细胞增殖分化的外在因素包括细胞因子和微环境,嗅鞘细胞能分泌多种细胞因子,与神经干细胞共培养时改变其微环境.目的: 观察不同浓度嗅鞘细胞对神经干细胞增殖及分化的影响.方法: 体外分别培养Wistar大鼠神经干细胞和嗅鞘细胞,5×107L-1神经干细胞分别和1×107L-1,1 ×109L-1,1×1011L-1嗅鞘细胞共培养,同时设立正常对照组,不加嗅鞘细胞.倒置荧光显微镜下观察神经干细胞增殖情况,诱导7 d后行NSE免疫细胞化学染色,计算阳性细胞,细胞总数得出阳性细胞百分比.结果与结论: ①3种浓度嗅鞘细胞与神经干细胞共培养3 d后,均促进了神经干细胞增殖,以1×109L-1嗅鞘细胞共培养组作用最显著,明显优于1×107L-1嗅鞘细胞组、1×1011L-1嗅鞘细胞组.②神经干细胞与1×109L-1嗅鞘细胞共培养7 d后,神经干细胞分化为神经元样细胞的百分比最高,与正常对照组相比差异有显著性意义(P<0.01).     

体外原代培养成年大鼠许旺细胞的实验方法：组织块反复种植＋低浓度酶消化＋差速贴壁

目的:探讨获得高纯度成年SD大鼠许旺细胞的有效方法。方法:实验于2006-12在武汉理工大学完成。①许旺细胞原代培养:无菌条件下暴露SD大鼠左侧坐骨神经,切断神经,结扎后缝合臀大肌及皮肤。7d后处死大鼠,切取左侧预变性坐骨神经,并取右侧正常坐骨神经做对照,显微镜下尽量去除神经外膜及黏连组织,将神经剪成1mm3的组织块,植入培养瓶中进行培养,组织块间距以1cm为宜。②许旺细胞传代及纯化:培养7d后,将组织转移到新的培养板中继续培养,继之依次应用低浓度酶消化法、差速贴壁分离法去除成纤维细胞,纯化许旺细胞。③许旺细胞的观察和计数:在倒置相差显微镜下观察许旺细胞的形态和增殖情况,定期随机采集细胞图像,并用MTT法测试其增殖能力。④许旺细胞的鉴定:对纯化的许旺细胞进行S-100蛋白酶联免疫细胞化学染色鉴定。结果:①许旺细胞的分离培养和纯化:预变性组许旺细胞密度高于正常对照组,培养7d后两组的密度差别尤为显著。②许旺细胞的形态学观察:许旺细胞为典型的长梭状,具有双极或多级,两端突起较长,汇合成片并交织呈网状。正常对照组细胞密度较低,生长较慢,胞体较长,细胞多呈三角形或多角形。MTT生长曲线显示:预变性组许旺细胞倍增时间为3d,正常为4d。③许旺细胞的免疫化学鉴定:许旺细胞胞体及突起呈棕褐色,而成纤维细胞为扁平状且未着色,呈透明状。预变性组许旺细胞纯度为95%,正常对照组为86%。结论:本实验所采用的组织块反复种植 低浓度酶消化 差速贴壁法分离纯化许旺细胞切实可行,可有效获得大量高纯度许旺细胞。     

基因修饰嗅鞘细胞治疗脊髓损伤研究:可能成为首要的选择

背景:近年来许多研究表明,嗅鞘细胞在脊髓损伤治疗中可以作为靶细胞运载目的基因而发挥作用,但是这种治疗方式还存在着许多问题.目的:就目前不同基因修饰嗅鞘细胞后的功能及基因修饰与细胞表达存在的问题作一综述.方法:以"嗅鞘细胞,脊髓损伤"为中文检索词;以"olfactory ensheathing cells,spinal cord injury"为英文关键词,检索中国期刊全文数据库(CNKI)和PubMed数据库.纳入与基因修饰的嗅鞘细胞在脊髓损伤治疗中的相关基础研究;排除重复性研究与基因修饰无关研究.保留29篇文献做进一步分析.结果与结论:研究表明,嗅鞘细胞自身能分泌多种神经营养因子、细胞外基质及细胞骨架,准确形成靶特异性轴突连接促进功能恢复.对其基因修饰后能高效表达目的基因,产生大量基因产物,影响脊髓损伤处微环境的重建和神经元的生长,从而恢复神经功能.这些细胞因子能拮抗抑制因子,保护神经元并促进神经元发育,是嗅鞘细胞促进神经再生及功能修复的主要因素.文章对几种细胞因子基因的特性、研究进展及基因修饰嗅鞘细胞还存在的问题进行了分别叙述.     

重复利用Ⅳ型胶原以差速贴壁法分选表皮干细胞

目的:观察表皮干细胞对Ⅳ型胶原的黏附特性,评价重复利用Ⅳ型胶原以差速黏附法在分选表皮干细胞中的效果。方法:实验于2004-09/2005-06在解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所基础部完成。①包皮来自解放军空军总医院泌尿外科收治的7～25岁行包皮环切术患者。②未包被胶原的培养瓶作为对照1组,首次Ⅳ型胶原和3次Ⅳ型胶原包被的培养瓶分别作为对照2组和实验组1,将包被Ⅳ型胶原并曾黏附细胞的培养瓶消化后作为实验组2。③人角质形成细胞分别接种其上,15min后对贴壁细胞进行显微摄像并计数;对贴壁细胞的生长及增殖活性进行观察;并用β1整合素、鼠抗人角蛋白19对贴壁的细胞进行鉴定。结果:①胶原包被组的贴壁细胞数明显增多(P≤0.05),并于5d铺满培养瓶底,而对照1组2d后仍未铺满瓶底。对照1组15min细胞贴壁数显著低于对照2组、实验1组、实验2组[(119.0±3.0),(246.3±19.6),(241.3±15.3),(262.0±11.1)个/100倍视野,P≤0.01];对照2组与各实验组差异无显著性意义(P>0.05)。②贴壁细胞β1整合素和鼠抗人角蛋白19表达阳性。结论:表皮干细胞对Ⅳ型胶原具有较好的黏附特性,回收利用Ⅳ型胶原对表皮干细胞的黏附特性几乎无影响,并可节约费用。