SNHG3调控miR-186-5p/ZEB1促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化的机制研究

［摘要］　目的　探究SNHG3调控miR-186-5p/E盒结合锌指蛋白1（ZEB1）促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化（EMT）的机制。方法　在HepG2细胞中转染siRNA干扰片段敲除SNHG3、转染pcDNA3.1(+)/SNHG3使SNHG3过表达,通过实时荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）检测是否转染成功。克隆形成实验检测HepG2细胞增殖,细胞划痕实验检测HepG2细胞迁移率,Transwell小室实验检测HepG2细胞侵袭数量,双荧光素酶活性检测验证SNHG3与miR-186-5p、miR-186-5p与ZEB1的靶向关系,FQ-PCR和Western blot法检测SNHG3、ZEB1、E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、vimentin、MMP-9、Snail的表达水平。结果　肝癌组织中SNHG3表达量高于正常组织,SNHG3表达量低/中的肝癌患者的生存预后优于SNHG3表达量高的肝癌患者,差异有统计学意义（P<0.05）。克隆形成实验结果显示,与pcDNA3.1(+)组相比,pcDNA3.1(+)/SNHG3组HepG2细胞增殖数量显著增加（P<0.05）。细胞划痕实验结果显示,pcDNA3.1(+)/SNHG3组HepG2细胞迁移率显著高于pcDNA3.1(+)组（P<0.05）。Transwell小室实验结果显示,pcDNA3.1(+)/SNHG3组HepG2细胞侵袭数量显著高于pcDNA3.1(+)组（P<0.05）。双荧光素酶活性检测结果显示,miR-186-5p mimic和pGL6-SNHG3-WT共转染后,荧光素酶活性低于其他组,miR-186-5p mimic和pGL6-ZEB1-WT共转染后,荧光素酶活性低于其他组,差异有统计学意义（P<0.05）。FQ-PCR和Western blot检测结果显示,当SNHG3过表达时,E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量显著下调,N-cadherin、MMP-2、vimentin、MMP-9和Snail mRNA和蛋白相对表达量以及ZEB1蛋白相对表达量显著上调;当SNHG3敲除后,E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量显著上调,N-cadherin、MMP-2、vimentin、MMP-9和Snail mRNA和蛋白相对表达量以及ZEB1蛋白相对表达量显著下调,差异有统计学意义（P<0.05）。结论　SNHG3调控miR-186-5p/ZEB1可促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,表明SNHG3是肝癌潜在的治疗靶点。     

有效抑制小鼠小胶质细胞上Toll样受体9表达的siRNA的筛选

目的：筛选有效抑制小鼠小胶质细胞（BV-2细胞）上Toll样受体9（TLR9）表达的小干扰RNA（siRNA）序列,并检测转染复合物的细胞毒性。方法设计并合成针对TLR9的3对siRNA（siRNA-836、siRNA-1549和siRNA-2410）及一条带绿色荧光标记（FAM）的通用阴性对照FAM-siRNA。在X-tremeGENEsiRNA转染试剂介导下转染BV-2细胞。倒置荧光显微镜下观察转染后BV-2细胞FAM-siRNA的分布,流式细胞仪检测转染效率,q-PCR检测TLR9的mRNA表达,Westernblot检测TLR9蛋白的表达,并比较其抑制率,筛选出有效抑制靶基因表达的siRNA。CCK-8检测细胞存活率的变化。结果BV-2细胞转染FAM-siRNA后6h,胞质内可见绿色荧光分布。FAM-siRNA表达阳性率为（91.87±4.77）％。转染TLR9siRNA后,BV-2细胞中TLR9mRNA表达明显下降。与阴性对照组及序列siRNA-836、siRNA-2410相比,序列siRNA-1549的TLR9沉默效能最高,使BV-2细胞上TLR9mRNA表达于24h和48h分别降低（77.89±4.23）％和（65.36±11.07）％,TLR9蛋白表达分别下降（48.37±20.56）％和（44.30±14.31）％。CCK-8检测TLR9siRNA转染组与对照组相应时间点比较,BV-2细胞存活率无明显变化（P＞0.05）。结论序列siRNA-1549对BV-2细胞上TLR9表达的抑制效果最大,利用RNA干扰处理BV-2细胞,对细胞基本无毒性作用。     

雄激素和雄激素受体对肝癌细胞株PEG10表达的作用

目的 探讨雄激素和雄激素受体(AR)对肝癌细胞株PEG10表达的调控作用.方法 设计合成针对人ARsiRNA,并转染HepG2和7404肝癌细胞株.用双氢睾丸酮(DHT)干预HepG2细胞.Western Blot检测AR和PEG10表达水平.结果 从3对AR siRNA中筛选到1对siRNA(AR siRNA-3),它在2种肝癌细胞株中均可有效抑制AR的表达,其抑制作用呈剂量依赖关系.2种肝癌细胞株中,浓度为240 nmol/L的AR siRNA-3在转染后24 h,对AR抑制效率可达80%以上,且抑制效果可持续至72 h.AR siRNA-3转染24h后PEG10表达水平降低,转染48 h后,PEG10表达水平降低非常明显,72 h后PEG10表达有所上升.DHT可促进HepG2细胞PEG10的表达,呈剂量依赖关系.DHT对AR表达未见明显作用.结论 雄激素和AR参与了肝癌细胞株PEG10表达的调控.这可能是男性肝细胞癌发病率较高的原因之一.     

耐索拉非尼肝癌细胞株的构建及耐药机制研究

［摘要］　目的　构建耐索拉非尼肝癌细胞株并探讨其耐药机制。方法　应用HepG2、Huh7细胞通过浓度递增法建立耐索拉非尼细胞模型。通过CCK8法检测细胞对不同浓度索拉非尼的敏感性。通过划痕实验检测细胞的迁移能力。通过流式细胞术分析细胞凋亡情况。通过荧光实时定量RT-PCR和Western blot实验检测凋亡相关因子caspase-3和自噬标志因子P62、LC3的表达水平。结果　获得耐索拉非尼肝癌细胞株HepG2-SR、Huh7-SR。随着索拉非尼药物干预浓度的升高，耐药细胞株及野生型细胞株的存活率均逐渐降低。HepG2-SR细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）显著高于HepG2细胞［（15.74±0.38）μM vs （7.27±0.44）μM ；t=5.450，P<0.001］；Huh7-SR细胞的IC₅₀显著高于Huh7细胞［（11.73±0.27）μM vs （4.92±0.31）μM；t=4.807，P<0.001］。相较于野生型细胞株，耐药细胞株具有更高的抗凋亡和迁徙能力。耐药细胞株的caspase-3、P62表达水平显著低于野生型细胞株（P<0.05），而LC3表达水平显著高于野生型细胞株（P<0.05）。结论　耐索拉非尼肝癌细胞株HepG2-SR、Huh7-SR具有更强的抗凋亡、抗生殖抑制和迁移能力，且自噬水平更高，为研究肝细胞癌对索拉非尼的耐药机制提供了基础。     

FTO、GSDMD在胃癌组织中的表达及其作用机制研究

［摘要］　目的　探讨肥胖相关蛋白（FTO）与消皮素D（GSDMD）在胃癌（GC）组织中的表达及其作用机制。方法　通过TIMER 2.0数据库分析FTO及GSDMD在GC组织中的差异表达。收集2022年1月至2023年3月广西医科大学第二附属医院手术切取的GC组织及其对应癌旁组织(距离肿瘤边缘3～5 cm)各45例,并收集患者的临床病理资料。采用免疫组织化学染色法检测组织中FTO、GSDMD的表达情况,分析其与患者临床病理特征的关联性。通过转染低表达FTO慢病毒构建低表达FTO的AGS细胞（FTO低表达组）,并以转染空载体慢病毒的细胞作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测两组细胞FTO mRNA、GSDMD mRNA的表达水平;采用细胞划痕实验及细胞迁移实验分析两组细胞迁移能力。结果　基于TIMER 2.0数据库的分析结果及免疫组织化学染色结果显示,FTO、GSDMD在GC组织中呈高表达（P<0.05）。FTO和GSDMD高表达均与肿瘤侵犯深度、淋巴结转移密切相关（P<0.05）。细胞实验结果显示,FTO低表达组的GSDMD mRNA表达水平显著低于对照组（P<0.05）,划痕愈合率更低,细胞迁移数更少,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论　FTO可能通过调控GSDMD表达促进GC细胞转移。     

介导EGFR siRNA转染肝癌HepG2细胞的试剂筛选及条件优化

目的筛选介导表皮生长因子受体（EGFR）小干扰RNA（siRNA）转染肝癌HepG2细胞的试剂,并优化转染条件。方法设计靶向EGFR的特异性siRNA,分别用Lipofectamine 2000、siPORT Amine、ICAFectin 442、N-TER nanoparticle、X-tremeGENE、polyMagnetofection、combiMAGnetofection介导转染肝癌HepG2细胞48、72 h。实时定量RT-PCR检测HepG2细胞的EGFR mRNA,计算敲除EGFR mRNA率,据此筛选出最佳转染试剂,继续进行不同试剂用量、不同siRNA浓度、正反向转染的对比。测算转染后细胞存活率及转染率。结果 Lipofectamine2000、siPORTAmine及combiMAGnetofection介导转染72 h后,HepG2细胞的EGFR mRNA敲除率均超过65%。2μl的combiMAGnetofection及200 nM的EGFR siRNA组合、72 h时HepG2细胞的EGFR mRNA沉默效率最高（90%±1%）,其细胞存活率为94%±8%,转染率超过95%。结论介导EGFR siRNA转染HepG2细胞的最佳试剂是combiMAGnetofection,优化转染条件为2μl的combiMAGnetofection、200 nM的EGFR siRNA、转染72 h。     

转化生长因子-β1在人和小鼠口腔鳞癌组织中的表达比较

［摘要］　目的　检测转化生长因子-β1（TGF-β1）在人和小鼠正常口腔黏膜、异常增生及鳞癌组织中的表达情况,探讨其在口腔癌发生与发展中的意义。方法　采用免疫组织化学技术,分别检测人和小鼠正常口腔黏膜、中重度异常增生、高分化鳞癌组织各12例中TGF-β1的表达情况,并对人和小鼠各型组织中TGF-β1的表达进行分析。结果　正常口腔黏膜组中人和小鼠TGF-β1表达率分别为33.3%（4/12）和41.7%（5/12）;口腔异常增生组中人和小鼠TGF-β1表达率分别为50.0%（6/12）和58.3%（7/12）;口腔鳞癌组中人和小鼠TGF-β1表达率均为75.0%（9/12）。结论　随着组织恶性程度的升高,人和小鼠各型组织中TGF-β1的阳性表达率逐渐增加,表达部位与强度具有相似性,表明TGF-β1是参与肿瘤发生与发展过程中的一个重要因子,并且人与小鼠口腔癌的发展过程具有相似性。     

细胞信号转导抑制因子-1表达下调对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的大量研究表明,内皮细胞的凋亡参与了动脉粥样硬化的发生与发展。另外有研究表明,细胞信号转导抑制因子-1(SOCS1)的表达下调可促进某些细胞的凋亡。然而,SOCS1表达下调是否与内皮细胞的凋亡有关,目前未见相关报道。为此,本研究利用RNA干扰沉默SOCS1的表达,然后观察内皮细胞凋亡的变化,探讨SOCS1与动脉粥样硬化之间的关系。方法 (1)培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cel,HUVEC),利用RT-PCR和Western Blotting检测SOCS1在HUVEC中的表达。(2)设计并化学合成4对靶向SOCS1的siRNA:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4。(3)将带有荧光标记的阴性对照siRNA配制成25、50、75、100 nmol/L的4组,利用脂质体转染细胞,并在荧光显微镜下观察转染效率,得出有最佳转染效率的浓度。(4)HUVEC根据不同的处理因素分成8组:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4和阳性对照组、阴性对照组、转染试剂组、空白对照组。将均为有最佳转染效率浓度的各组siRNA转染细胞,48小时后收获细胞。利用RT-PCR和Western Blotting,筛选出1对对SOCS1沉默效率最高的siRNA。(5)将筛选出来的沉默效率最高的siRNA和阴性对照siRNA以有最佳转染效率的浓度转染细胞,转染24小时后分为4组:①阴性对照siRNA;②阴性对照siRNA+缺氧20小时/复氧4小时;③SOCS1 siRNA;④SOCS1 siRNA+缺氧20小时/复氧4小时。最后,利用Western Blot检测Caspase3和Bax的表达,利用流式细胞仪检测凋亡。结果 (1)siRNA在50 nmol/L时有较高的转染效率。(2)4对siRNA干扰后,SOCS1的表达水平与四个对照组相比明显下调(P<0.05),其中siRNA-3的沉默效率最高(P<0.05)。(3)对HUVEC进行RNA干扰和缺氧复氧处理后,SOCS1 siRNA+缺氧复氧组的Caspase3、Bax蛋白表达水平与其它3组相比明显升高(P<0.05),阴性对照siRNA+缺氧复氧组的Caspase3、Bax蛋白表达水平与阴性对照siRNA组相比明显升高(P<0.05),阴性对照siR     

PDK1基因shRNA慢病毒载体构建及干扰效应鉴定

［摘要］　目的　构建PDK1基因短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,鉴定其对PC-3细胞PDK1基因的干扰效应。方法　在GenBank数据库检索PDK1基因序列,参考该序列设计PDK1特异性过干扰序列,酶切过表达用载体LV3,纯化酶切产物后进行定向连接。将重组干扰病毒质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,测定病毒滴度。将构建的慢病毒感染PC-3细胞,采用real-time RT-PCR法鉴定其PDK1基因干扰效应。结果　测序结果证实成功构建PDK1基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,慢病毒滴度为1×10⁸ TU/ml。real-time RT-PCR结果显示,LV3-PDK1-shRNA慢病毒感染PC-3细胞可显著抑制其PDK1 mRNA的表达（P<0.05）。结论　成功构建PDK1基因RNAi慢病毒载体,获得稳定沉默PDK1基因的PC-3细胞株,为后续研究PDK1基因在前列腺癌细胞模型中的作用奠定基础。     

XAF1基因在肝癌细胞凋亡中的诱导作用

背景：X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）与凋亡抑制和肿瘤细胞耐药现象密切相关。目的：研究XIAP相关因子1（XAF1）基因抑制人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2增殖和诱导凋亡的作用。方法：以腺病毒Ad5／F35为载体,构建重组腺病毒Ad5／F35-XAF1、对照空病毒Ad5／F35-Null和报告病毒Ad5／F35-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,分别以相同感染复数（MOI）感染人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2,并设立空白组作为对照。作用48h后,以荧光显微镜检测Ad5／F35-EGFP的感染效率;分别以逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白质印迹法检测XAF1 mRNA和蛋白表达;以MTT法检测细胞活力;以Annexin V—FITC／PI双染法和原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡率。结果：Ad5／F35-EGFP感染48h后,几乎所有Bel-7404和HepG2细胞均表达EGFP。Ad5／F35-XAF1感染48h后,两种肝癌细胞中XAF1 mRNA和蛋白表达均明显增高．细胞活力呈剂量依赖性地降低,细胞凋亡率显著增加。结论：重组腺病毒Ad5／F35-XAF1在人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2中的感染效率高,XAF1在不同的肝癌细胞株中恢复表达后,能显著抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡,有可能成为肝癌基因治疗的新靶点。     

水飞蓟宾缓解油酸诱导的HepG2细胞脂质沉积的机制探讨

［摘要］　目的　构建油酸诱导的HepG2细胞脂肪变性模型,探索水飞蓟宾调节HepG2细胞脂质沉积的作用机制。方法　通过0.4 mM油酸刺激HepG2细胞24 h构建脂肪变性模型。根据实验目的设置对照组、油酸组（OA组）、油酸+水飞蓟宾组（OA+S组）、油酸+氯喹组（OA+CQ组）和油酸+氯喹+水飞蓟宾组（OA+CQ+S组）。每组4样本。通过油红O染色以及甘油三酯(TG)检测评估各干预组细胞脂质沉积情况。通过Western blot检测各干预组自噬标志蛋白LC3B的表达情况。结果　OA组HepG2细胞胞内染色脂滴数量明显多于对照组,且TG含量高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。OA+S组经水飞蓟宾干预后胞内染色脂滴数量减少,TG含量下降,与OA组比较差异有统计学意义（P<0.05）。OA+CQ+S组在油酸刺激后,用自噬抑制剂氯喹预处理1 h,再加水飞蓟宾干预24 h,HepG2细胞内出现显著脂质沉积,TG含量上升,与OA+S组比较差异有统计学意义（P<0.05）,而与OA组水平相当（P>0.05）。Western blot检测结果显示,OA组LC3BⅡ/LC3BⅠ水平较对照组降低（P<0.05）;OA+S组LC3BⅡ/LC3BⅠ水平显著高于OA组,与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）;OA+CQ组、OA+CQ+S组的LC3BⅡ/LC3BⅠ水平显著高于OA组和OA+S组（P<0.05）。结论　0.4 mM油酸可引起HepG2细胞脂肪变性。水飞蓟宾通过增强HepG2细胞自噬而改善油酸引起的脂质沉积。     

原发性肝癌破裂出血48例诊治的临床分析

［摘要］　目的　总结原发性肝癌破裂出血诊治的经验。方法　对48例原发性肝癌破裂出血患者的临床资料进行回顾性分析。结果　保守治疗5例,其中4例保守治疗成功,1例保守治疗后经肝动脉栓塞（TAE）治疗。TAE治疗19例,15例治疗成功,2例自动出院,2例死于肝性脑病和肝肾功能衰竭。手术治疗24例,20例治疗成功,4例术后死于肝肾功能衰竭、肝性脑病和失血性休克。治疗总有效率为87.50%（42/48）,病死率为12.50%（6/48）。结论　充分评估病情及选择适当的治疗方法对原发性肝癌破裂出血治疗有重要意义。     

DEK基因在肝癌中的表达及靶向抑制其表达对肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨DEK基因在肝癌中的表达及RNA干扰抑制其表达对肝癌细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法以人正常肝细胞HL-7702作为对照,RT-PCR检测人肝癌HepG2、Huh-7、SMMC-7721、SNU-475细胞中DEK mRNA表达;DEK-siRNA转染HepG2细胞,同时转染阴性对照和空白对照,转染48 h后Western blotting检测各组细胞中DEK、Cleaved caspase 3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达;CCK8实验和流式细胞仪分别检测细胞的增殖及凋亡情况。结果各个肝癌细胞中DEK mRNA表达均显著高于正常细胞,差异有统计学意义(P0.01);DEK基因在HepG2细胞中表达最高,选择作为后续研究对象;转染DEK-siRNA后DEK蛋白表达显著降低;DEK-siRNA组细胞存活率及β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于空白对照组和阴性对照组,细胞凋亡率和Cleaved caspase 3蛋白表达显著高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P0.01)。结论抑制肝癌HepG2细胞中DEK基因可降低癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制与Wnt/β-catenin信号通路的调控有关。     

小鼠半胱天冬酶-12特异性小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）基因特异性小干扰RNA（siRNA）表达载体并检测其表达。方法 参照siRNA模板设计原则，设计并合成3对针对caspase-12不同位点的siRNA，分别在脂质体介导下转染小鼠肝癌细胞株Hepal-6，24h收集细胞；RT-PCR分析不同位点siRNA对靶基因mRNA表达的抑制，筛选出抑制效率最高的位点；将此位点siRNA模板序列插入质粒pRNAT-H1．1Neo中，PCR分析及基因测序进行鉴定；构建成功的重组质粒转染Hepal-6细胞48h和72h后，实时荧光定量PCR分析caspase-12 mRNA表达；Western印迹检测Caspase-12的表达。数据行t检验。结果 RT-PCR分析表明，第-对siRNA（siRNA＊1）对caspase-12基因表达的抑制效率最高；重组质粒pRNAT-H1．1Neo-caspasel2（pRNAT-caspl2）经PCR分析及测序表明，siRNA＊1模板序列成功插入预计位点，且序列正确；pRNAT-caspl2转染Hepal-6细胞48h和72h后，与空质粒对照组相比，caspase-12 mRNA水平分别下降72．5％和59．5％（P〈0．05）；pRNAT-caspl2转染后，caspase-12酶原表达量在24、48和72h分别下调17．1％、37．3％和60．1％，48h和72h的抑制率比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 成功构建小鼠caspase-12特异性siRNA真核表达载体，它对小鼠肝癌细胞caspase-12基因的表达具有显著和特异的抑制作用。     

La蛋白与乙型肝炎病毒mRNA稳定性和蛋白质表达的相关性

目的研究La蛋白与乙型肝炎病毒（HBV）mRNA稳定性和蛋白质表达之间的相关性。方法设计并合成La蛋白mRNA特异性小干扰RNA（siRNA），转染HepG2．2．15细胞，继续培养3d后分别裂解转染和未转染siRNA的细胞l抽提蛋白质，Westernblot检测La蛋白含量变化；于转染后的第1、2、3、5、7、9天分别收集细胞培养上清液，实时荧光定量聚合酶链反应技术检测上清液中HBVDNA的变化情况，电化学发光分析技术检测乙型肝炎表面抗原，乙型肝炎e抗原含量变化情况。结果La蛋白在转染siRNA的HepG2．2．15细胞中表达明显低于未转染siRNA的细胞；转染siRNA的细胞分泌到上清液中乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎e抗原和HBVDNA的含量也明显低于未转染siRNA的细胞。结论在HepG2．2．15细胞内，La蛋白与HBVmRNA稳定性和蛋白质表达具有功能相关性。     

CENPM表达在肝移植术后肝癌复发患者中的临床意义

［摘要］　目的　研究促肝癌基因着丝粒蛋白M（CENPM）在肝移植术后肝癌复发患者中表达与临床特征的相关性以及对预后的影响。方法　纳入肝移植术后肝癌复发患者82例，未复发组40例，对切除肝标本进行免疫组织化学染色观察CENPM表达水平，收集患者临床资料及预后情况，分析高表达组与低表达组临床特征、复发特征和预后的差异。结果　复发患者82例中位随访时间为22（8～38）个月，CENPM高表达比例为70.7%，而未复发组为50.0%，差异有统计学意义(P=0.025)。复发患者中，高表达组与低表达组相比，无疾病生存时间差异有统计学意义(P=0.036)；高表达组总体生存时间低于低表达组，差异有统计学意义(P=0.019)。结论　CENPM表达与肝移植术后肝癌较快复发及转移有关，并影响患者预后。     

siRNA降低COX-2基因表达对肝癌细胞系HepG2增殖的影响

目的: 探讨小干扰R N A 降低环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)基因对肝癌细胞He pG2增殖与细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)表达的影响.方法: 将人肝癌细胞株HepG2细胞分为4组:COX-2 siRNA干预组、阴性对照siRNA组、空脂质体组、空白对照组. 脂质体转染法将COX-2 siRNA转染入HepG2细胞; MTT法测定转染后24, 48, 72 h的增殖抑制率; 流式细胞仪测定转染后24 h的细胞周期分布; 半定量RTPCR与Western blot检测转染后24 h肝癌细胞COX-2和ERK1/2的表达.结果: COX-2 siRNA干预组的增殖抑制率明显高于阴性对照组和空脂质体转染组(67.08%vs 2.45%, 1.56%, 均P<0.01); COX-2 siRNA干预组G1期细胞明显增多, 与空白组、空脂质体组及阴性对照组相比, 均具有显著差异(72.80% vs 50.27%, 50.97%, 53.13%, 均P<0.05); RT-PCR显示: COX-2 siRNA干预组COX-2, ERK1, ERK2 mRNA表达(0.58, 0.32,0.48)明显降低, 与空白组(0.93, 0.76, 0.72)、空脂质体组(0.89, 0.64, 0.67)及阴性对照组(0.83, 0.71, 0.65)比较, 差异具有统计学意义(均P<0.05), Western blot显示以上各项指标表达趋势与RT-PCR相同.结论: 小干扰RNA可降低肝癌细胞He pG2的COX-2基因表达, 抑制肝癌细胞的生长.COX-2促进肝癌生长可能与ERK1/2通路调控有关.     

AEG1促进肝癌细胞HepG2分泌细胞因子IL-6、IL-1β的实验研究

目的研究AEG1能否促进肝癌细胞HepG2分泌细胞因子IL-6、IL-1β,探讨AEG1是否参与改变肿瘤微环境。方法用脂质体稳定转染法分别转染pcDNA3.1(-)-AEG1(AEG1全长质粒)、psilencer 2.0-shAEG1(AEG1干扰质粒)至HepG2细胞,相对应以转染空质粒pcDNA3.1(-)、psilencer 2.0的HepG2细胞为对照组;采用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)、Western blotting检测AEG1 mRNA和蛋白表达变化;采用实时荧光定量RT-PCR和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞因子IL-6、IL-1β的表达和分泌。结果与转染相应空载体的阴性对照组和未转染的空白对照组相比,分别转染AEG1全长质粒/AEG1干扰质粒后,HepG2细胞中AEG1的蛋白表达明显增高/降低。转染AEG1全长质粒的HepG2细胞中IL-6、IL-1βmRNA均较对照组和空白组明显增强(P均<0.05),细胞培养介质中IL-6、IL-1β蛋白浓度也显著高于对照组(P均<0.05);转染AEG1 shRNA的HepG2细胞中IL-6、IL-1βmRNA均较对照组和空白组降低(P均<0.05),细胞培养介质中IL-6、IL-1β蛋白浓度也低于对照组(P均<0.05)。结论成功构建稳定过表达和沉默AEG1的HepG2细胞,AEG1能调控IL-6、IL-1β的表达和分泌。     

GSK-3β特异的siRNA腺病毒对高脂诱导内皮细胞GSK-3β表达的影响

目的构建糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)特异的RNA干扰(RNAi)腺病毒,观察其抑制高游离脂肪酸(FFA)诱导下人脐静脉内皮细胞(HUVEC)GSK-3β的表达情况。方法利用体外同源重组技术构建GSK-3β特异的siRNA腺病毒表达载体,在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑以实验法测定病毒滴度。GSK-3β特异的siRNA腺病毒感染HUVEC,以Western印记法测定其对GSK-3β蛋白表达的影响。结果成功构建了GSK-3β特异的siRNA腺病毒,获得高滴度的腺病毒液;构建的重组腺病毒感染HUVEC,可显著抑制正常培养及游离脂肪酸诱导下的细胞的GSK-3β蛋白的表达,Ad-DEST组与Ad-640组比较,Ad-640组明显下降(P0.05)。结论构建的GSK3β特异的RNAi腺病毒能有效抑制HUVECGSK-3β蛋白的表达,有可能保护高脂诱导的HUVEC损伤。     

CCL11和CCL26基因3′UTR真核表达载体的构建和意义

［摘要］　目的　构建CCL11、CCL26基因3′非翻译区（3′UTR）真核表达载体。方法　多聚酶链式反应（PCR）扩增获得CCL11、CCL26基因3′UTR目的片段,双酶切目的基因片段及pMIR REPORT真核表达质粒后,将目的基因片段插入pMIR REPORT质粒,再将重组质粒转化感受态DH5α菌株,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及测序分析。结果　成功构建CCL11、CCL26基因3′UTR真核表达载体。结论　CCL11、CCL26基因3′UTR真核表达载体成功建立,为进一步研究CCL11、CCL26基因与MicroRNAs的关系提供实验基础。