不同冷冻速率冻存C6/36细胞复苏效果比较

[目的]选择C6/36细胞最适宜冷冻速率。[方法]用4种冷冻速率冻存处于对数生长期的C6/36细胞,运用MTT法测定细胞活性,计算冷冻存活率,并同步观察复苏细胞形态。[结果]A法冷冻存活率(92.9%±1.5%)高于B法、C法和D法(71.6%±1.8%、69.9%±2.1%和35.2%±1.2%)。光镜观察,A法冻存后细胞,复苏即时镜下90%以上的细胞呈现透明,类圆形饱满良好的活细胞形态;而B法、C法和D法冻存的细胞都有不同程度的形态性破坏,可见细胞碎片。[结论]A法是C6/36细胞的最适宜冷冻速率,冷冻速率的改变对其冷冻存活率的影响很大(P<0.01)。     

不同温度冻存对杂交瘤细胞及其单克隆抗体活力的影响

目的：观察冻存对分泌抗大肠癌SW1116细胞单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞存活率的影响，以及对抗大肠癌SW1116细胞的McAb效价的影响。方法：杂交瘤细胞在12．5％DMSO下，于4℃、-30℃、-60℃及-196℃下分别冻存1、3、6、12及24个月，复苏，用台盼蓝拒染法测其存活率。McAb在等量甘油下，于4℃、-10℃、-20℃及-60℃下分别冻存1、3及12个月后，测其效价。结果：杂交瘤细胞置-196℃保存2年仍有78％的存活率；-60℃保存3、6及12个月的存活率分别为73％、40％及0％；不宜于-30℃及4℃保存。McAb在-20℃以下保存1年，效价未见下降；-10℃保存1年下降1个稀释度；4℃保存1年下降1—2个稀释度。结论：杂交瘤细胞短期保存可用-60℃冻存，长期需液氮保存。McAb长期保存最好于-20℃以下冻存。     

非冻存低温下维持悬浮培养细胞

目的 建立非冻存低温条件下维持悬浮培养细胞的细胞保存技术.方法 常规培养悬浮生长的人白血病细胞Jurkat,分别正常培养、室温和4℃冰箱条件下保存,间隔10天进行细胞形态观察和细胞存活率分析,然后室温和4℃冰箱保存的细胞再加入新鲜培养剂转入正常培养.结果 两种非冻存低温条件下细胞存活率降低,与正常培养组有显著性统计学差...     

MDCK、HEp-2、Vero细胞混合冻存适用于分离培养常见病毒研究

目的建立犬肾细胞（MDCK）、人喉表皮癌细胞（HEp-2）和非洲绿猴肾细胞（Vero）3种细胞（MHV）混合细胞瓶冻存复苏方法,经冻存复苏的混合细胞用于分离常见呼吸道和肠道病毒,建立病毒性病原检测的方法学平台。方法对数生长期的MDCK、HEp-2和Vero细胞等量保存在含8%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DM-SO）冷冻保存液中,液氮经冻存4个月后复苏并进行细胞计数;在复苏后0 h、24 h和48 h倒置显微镜下观察细胞形态、细胞汇合;并用于分离培养常见呼吸道、肠道病毒,观察致细胞病变效应,采用直接与间接免疫荧光法鉴定。结果在液氮中保存4个月的MHV混合细胞,细胞复苏存活率超过99.20%,镜下细胞折光度好,细胞形态良好,均见到相应的致细胞病变效应和免疫荧光检测阳性结果。结论 MDCK、HEp-2和Vero细胞等量保存在含8%DM-SO冷冻保存液中液氮保存4个月复苏存活率高。混合细胞直接冻存复苏方法建立,为常见的病毒性病原分离培养提供了宽泛的合适细胞宿主,保证了病毒性传染病的快速诊断、实验室病毒性传染病监测的可操作性。     

兔骨髓基质干细胞的分离生长及冻存技术研究

目的：建立兔骨髓基质干细胞(MSC)体外分离、培养、增殖、冻存的方法，以及探讨其生物学特性。方法：抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出MSC，并增殖。观察MSC的生长特性，测定其贴壁率及第3、8、13、18代的生长曲线，并评价其生物学特性。MSC在12．5％DMSO条件下经液氮或-60℃冻存复苏，测其成活率。结果：MSC为贴壁生长，以均一的梭形的成纤维细胞样生长，贴壁及增殖能力强，所测各代的生长曲线呈相似的S型，倍增时间约为35h。MSC需液氮保存，短期也可-60℃冰箱保存。结论：获得的兔MSC生长旺盛、增殖能力强，其分离、培养、纯化、增殖、冻存方法是可行的，可较长时间稳定地培养增殖、冻存，传代的MSC可保持其原代的生物学特性。MSC将是组织工程理想的种子细胞。     

体外人原代肝细胞分离与培养及冻存研究

目的通过对人原代肝细胞分离、培养、冻存,研究冻存前后肝细胞的形态功能,以期为生物人工肝、肝细胞移植的研究及应用提供细胞来源。方法采用多点穿刺两步灌流法分离原代肝细胞,体外预培养24 h,经程序降温盒冷冻法短期冻存。复苏后对细胞的活力、形态、微生物污染及相关功能基因表达进行测定。结果复苏后,肝细胞存活率达到(71.6±2.2)%,相较新鲜分离的肝细胞,存活率达到90%以上,体外培养时间长达12天,无微生物污染,复苏前后白蛋白(ALB)、谷氨酰胺合成酶(GS)、氨甲酰磷酸合酶1(CPS1)以及细胞色素酶P450 3A4(CYP3A4)功能基因表达无统计学差异(P>0.05)。结论初步建立了人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为生物人工肝及相关肝细胞治疗奠定了研究基础。     

永生化人晶状体上皮细胞的体外培养

目的:建立永生化人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cell,HLEC)培养、冻存与复苏技术。方法:传代培养人晶状体上皮细胞系B-3,并进行细胞冻存与复苏,台盼蓝染色法判断细胞活力。结果:接种后的HLEC在短时间内即可贴壁及延伸,12～24 h后大部分细胞贴壁生长,具有上皮细胞的形态特点,约3～4 d细胞基本融合。冻存后复苏的HLEC活力超过90%,保持正常的细胞形态,并可长期传代培养。结论:成功建立永生化HLEC培养、冻存与复苏技术,为白内障相关研究提供理想的细胞材料。     

组织细胞新的保存方法研制成功

基层防疫站保存细胞相当困难,需要-70℃超低温冰箱或液氮及其容器。无上述设备条件的单位只有靠细胞传代,导致人力、物力的浪费;且细胞传代次数多易退化衰老,测定病毒滴度时敏感性差,甚至无法进行实验。为减少细胞传代次数,延长细胞寿命,能使基层正常开展病毒抗体检测和病毒分离工作,我们对人喉癌细胞(Hep-2)及正常人羊膜细胞(FL)的保存,做了长期的实验和探索,探索出一种新的保存方法,换一次液可保存一个月,细胞复苏良好。现将方法简述如下:     

不同冷冻速率在Vero细胞冻存复苏中的应用效果分析

目的：为了选择Veto细胞最佳的冷冻速率。方法：对Vero细胞应用不同的速率进行冻存，观察复苏效果。结果：采用一步直接法可获得90％以上的复活率。结论：不同的细胞具有不同的特性，其在冷冻过程中的生理变化及对保护剂的要求也不同，并具有不同的最适冷冻速率。     

外周淋巴细胞的冻存在肿瘤免疫治疗中的应用研究

目的通过建立体外分离高活性和高复苏率的淋巴细胞冻存方法,用于抗肿瘤自体免疫细胞回输治疗。方法按照人体回输细胞的临床应用要求,改良Ficoll梯度密度离心法,从外周血分离淋巴细胞,测定淋巴细胞活力和回收率。采用二甲亚砜作为细胞防冻剂,细胞冻存液分为含胎牛血清组和自体血浆组,纯化的淋巴细胞保存于-150℃气态液氮中,在1、3、6、12、24个月时复苏免疫细胞并评价效果。采用SPSS13.0统计学软件分析数据。结果改良的Ficoll梯度密度离心法获得的淋巴细胞活力为(99.6±0.6)%,淋巴细胞回收率(62.4±13.6)%,日处理血量500ml。在冻存了1、3、6、12、24个月后两种细胞冻存液均使淋巴细胞活率保持在95%以上,质量控制体系经过2年的运行,稳定可靠。结论通过体外人工分离淋巴细胞的方法可以获得足量的高活性淋巴细胞,经长时间冷冻保存后仍可维持高活性,有利于临床抗肿瘤免疫细胞回输疗法的实施。     

以支持细胞为饲养层培养冻存后大鼠精原干细胞研究

目的：研究冻存的精原干细胞体外分离培养的生物学特性,为今后冻存精原干细胞的批量培养和长期利用提供依据。方法：取7～8d的sD雄性大鼠,分离睾丸组织,用两步酶消化法和差速时间贴壁法,分离精原干细胞和支持细胞。以二甲基亚砜（DMSO）作冷冻保护液,将分离到的精原干细胞放置于液氮中冻存;利用体外培养体系,进行支持细胞的培养和饲养层的制备;然后将复苏的精原干细胞接种到支持细胞饲养层上培养,并利用碱性磷酸酶鉴定精原干细胞。结果：用两步酶消化法和差速贴壁法能分离到纯度较高的精原干细胞和支持细胞,冻存的SSCs解冻后能在支持细胞饲养层上贴壁、生长、增殖,碱性磷酸酶活性鉴定呈阳性。结论：冻存后精原干细胞在体外支持细胞饲养层上呈集落样生长,并能长时间维持细胞集落形态及数目,可为体外研究药物或毒物干扰精原干细胞提供细胞模型。     

冷冻复苏软骨细胞的培养及对其生物学特性研究

目的了解冻存复苏过程对保持软骨细胞生物学特性的影响。方法对冻存1周组、1个月组和新鲜制备组的软骨细胞进行倒置相差显微镜动态观察、生长曲线、HE染色以及Ⅱ型胶原免疫组化等观察,在其形态和功能方面进行比较。结果各组间软骨细胞的生长过程、Ⅱ型胶原免疫组化染色结果差异均无显著性,但随冻存时间的延长,其存活率有所下降。结论冻存软骨细胞与新鲜制备的软骨细胞相比保持了一些相似的生物行为,但冻存时间长短对冻存的软骨细胞存活率有影响。     

HepG2细胞培养方法与条件的探讨

目的 探讨HepG2细胞最优培养方法与培养条件。方法 对比40℃先溶解后37℃水浴恒温与传统37℃复苏方法效果以选择最佳的复苏方法；观察不同比例胎牛血清培养基下细胞生长情况以确定最佳的血清含量；观察不同汇合度下细胞生长趋势及死活细胞比例以选择恰当的传代时机；观察不同消化方法的消化效果以选择合适的消化方法。结果 40℃先溶解后37℃水浴恒温的复苏存活率(85．7％)明显高于传统37℃复苏方法(68．4％)；在含12％以上胎牛血清的I)MEM中细胞生长良好；汇合度达95％～100％．时细胞生长趋势达到平台期，100％以后活细胞逐渐减少而死细胞逐渐增加；应用先P'BS洗涤后0．25％胰酶消化的传代方法易于控制，消化效果好。结论 HcpG2细胞采取40℃先溶解后37℃水浴恒温的复苏方法，含12％胎牛血清DMEM培养基培养，采用先PBS洗涤后胰酶消化的方法于汇合度95％～100％时传代的方法进行培养，能获得最佳培养效果。     

小鼠精原干细胞冷冻保存技术的研究

[目的]探讨精原干细胞(SSCs)冷冻复苏后与Sertoli支持细胞共培养的增殖分化能力。[方法]以7~8 d龄小鼠为材料,Percoll密度梯度离心,并将分离后的SSCs液氮冷冻,复苏后接种至Sertoli饲养层上,37℃下共培养,在倒置相差显微镜下观察细胞的生长特点,并对培养细胞进行C-Kit受体检测。[结果]增殖细胞的生长特点及形态学特征与文献报道精原干细胞的特征相符合。C-Kit受体显示细胞膜呈强阳性。这些均符合精原干细胞的生物学特征。[结论]冷冻复苏后精原干细胞在未加入细胞因子的Sertoli饲养层中能较长时间生长并分裂增殖。     

Ⅰ号冻存液改善小鼠肝细胞冻存质量研究 FREE

目的对自行配制组方的Ⅰ号冻存液冻存小鼠肝细胞进行研究,探索一种效果较好的冻存液以改善冻存肝细胞质量。方法以体重20～30 g的昆明小鼠为肝细胞供体,用改良的胶原酶灌注法分离肝细胞。将分离好的肝细胞分别以Ⅰ号冻存液（实验组）和标准冻存液（对照组）进行逐级降温缓慢冻存,置液氮中。于0.5、1、1.5、2个月快速复苏肝细胞,观察并测定细胞活率、功能和形态学。结果冻存小鼠肝细胞2个月后复苏检测,实验组的肝细胞活率台盼蓝（TB）染色为（80.18±2.44）%,对照组肝细胞活率TB染色为（49.71±3.51）%,两组差异有显著性（t=23.64,P＜0.05）;血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率的值,实验组分别为（14.03±2.21）U/L、（15.14±3.03）U/L、（15.11±2.10）U/L,而对照组分别为（24.28±1.96）U/L、（25.44±2.06）U/L、（26.22±3.23）U/L,两两比较,差异均有显著性（t分别为8.84、8.58、8.32,均P＜0.05）;合成清蛋白的值,实验组为（3.24±0.18）g/L,对照组为（2.56±0.33）g/L,两组差异有显著性（t=9.25,P＜0.05）。同一组各个复苏时段,实验组与对照组的肝细胞活率,肝细胞ALT、AST、LDH的漏出率,合成清蛋白的能力之间无差别（均P＞0.05）。结论在本研究中,冻存小鼠肝细胞2个月,Ⅰ号冻存液较常规冻存液能有效减轻小鼠肝细胞的损伤,发挥良好保护作用。小鼠肝细胞在Ⅰ号冻存液的保护下,置液氮中保存2个月,不影响肝细胞活性。     

精液冷冻复苏后精子活动力结果分析

目的 比较不同民族之间精液冷冻复苏后精子活动力有无差异.方法 将171名正常供精者（汉族74名、哈萨克族51名、维吾尔族46名）标本进行精液常规分析,按精液和冷冻保护剂等比例混匀,用程序降温仪通过三步降温法冻存于-196℃液氮中编号冻储.取出样本管放置于37℃水浴复苏,再次进行精液常规分析.结果 冷冻复苏后,汉族供精者精子前向运动百分率和总活动率分别为（27.50±4.51）％和（38.53±7.39）％;哈萨克族供精者精子前向运动百分率和总活动率分别为（17.20±3.67）％和（23.82±5.12）％;维吾尔族供精者精子前向运动百分率和总活动率分别为（15.79±6.63）％和（24.60±5.31）％.经x2检验,汉族和哈萨克族、维吾尔族供精者精子前向运动百分率和总活动率差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 汉族与哈萨克族和维吾尔族精液冷冻复苏后精子活动力结果有差异,其原因有待进一步研究.     

关于脐带血的疑问

广东省脐血库一份冻存长达15年的脐带血造血干细胞成功救治一名11岁急性髓细胞白血病女孩,在刷新了广东省脐血库冻存时间最长的脐带血临床应用记录的同时,也成为国内临床应用的脐带血冻存年限之最.据了解,这份冻存了15年的脐带血移植前复苏活性检测高达94.2％. 2012年3月,北京市脐血库为北京道培医院提供了一份冻存14年的脐带血,这份脐带血是1998年冻存的,解冻时活性达96％以上.它用来救治了一位49岁,体重达87公斤的白血病患者.     

影响冻融胚胎存活的相关因素分析

目的:探讨年龄、受精方式、胚胎冷冻方法及胚胎冻存时间对冻融胚胎存活的影响.方法:回顾分析冻融胚胎移植(FET) 1255个周期,根据年龄、受精方式、胚胎冷冻方法及胚胎冻存时间进行分组,比较各组的冻融胚胎存活率、完全存活率及临床妊娠率.结果:玻璃化冷冻组冻融胚胎存活率、完全胚胎存活率及临床妊娠率分别为93.4％、95.9％、48.8％,程序化冷冻组冻融胚胎存活率、完全胚胎存活率及临床妊娠率分别为81.2％、54.9％、30.1％,两组差异有统计学意义(P＜0.05);年龄、受精方式、胚胎冻存时间对冻融胚胎存活率及完全胚胎存活率无明显影响(P＞0.05).结论:玻璃化冷冻胚胎技术比程序化冷冻胚胎技术能获得更高的冻融胚胎存活率、完全胚胎存活率及临床妊娠率,3年内的冻融胚胎可不考虑冻存时间对胚胎存活的影响.     

应用气-液界面染毒技术研究柴油机尾气对16HBE细胞的毒性作用

[目的]应用气-液界面染毒技术探索柴油机尾气对人支气管上皮(16HBE)细胞急性毒性作用. [方法]在流速为20 mL/min,37℃的条件下,用柴油机尾气分别对生长在多孔膜上的16HBE细胞持续染毒5、10、15、20、30 min,分别使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测法、乳酸脱氢酶(LDH)释放法、中性红摄入法(NRU)检测柴油机尾气对细胞存活率的影响;对细胞存活率约50％以上的染毒组用流式细胞术检测柴油机尾气对细胞凋亡率的影响;同时对每个染毒组分别设置用滤膜过滤的洁净空气作为对照组,暴露时间和检测方法均与染毒组-致. [结果]3种存活率检测方法的结果表明,染毒组与对照组相比,柴油机尾气持续染毒15 min及更长时间以后,细胞存活率降低,差异有统计学意义(P＜ 0.05),且呈随染毒时间延长而逐渐降低的趋势.3种方法比较表明,低流速短时间柴油机尾气对16HBE细胞的损伤作用以细胞膜损伤最为显著,其次是线粒体损伤.用柴油机尾气持续染毒10、15 min,染毒组细胞早期凋亡率、晚期凋亡及坏死率较对照组均升高,差异均有统计学意义(P＜ 0.05).10、15 min染毒组的晚期凋亡及坏死细胞多于早期凋亡细胞(P＜0.05). [结论]气-液界面染毒技术可以应用于柴油机尾气等气溶胶有害物质的体外毒性研究;同时发现柴油机尾气导致的16HBE细胞急性毒性为细胞膜损伤、线粒体损伤及细胞凋亡.     

甲型肝炎减毒活疫苗生产中病毒释放的最低方法探索

目的：探索甲肝炎减毒活疫苗（简称甲肝活疫苗）生产中感染细胞释放病毒的最佳方法。方法：采用超声波细胞粉碎仪、－70℃及液氮冻融3种方法粉碎细胞,对细胞破碎情况、病毒抗原滴度和感染性滴度进行了比较。结果：超声波连续粉碎 3次（90秒／次）、－70℃反复冻融粉碎4次和液氮冻融粉碎6次,细胞破碎率分别为94％、82％和81％;病毒抗原滴度和感染性滴度均达高峰;抗原滴度均为1：256,感染性滴度（logCCID50/ml)分别为8．67、6．5和6．0。继续超声和－70℃冻融粉碎细胞,病毒抗原滴度和无感染性滴度基本不变,而液氮冻融至第10次时,抗原滴度无明显变化,感染性滴度下降2．0lgCCID50/ml。结论：超声波破碎率最高,细胞碎片最小病毒充分释放,且不损伤病毒;－70℃和液氮冻融破碎率较低,细胞碎片较大,病毒释放效率低,病毒损伤以液氮冻融为重。