三氧化二砷去甲基化作用对白血病细胞株HL-60中SHP-1和c-kit基因表达的影响

本研究旨在探讨SHP-1及C-kit基因在急性白血病细胞中的表达水平及三氧化二砷（As2O3）去甲基化作用对SHP-1及C-kit表达的影响。用RT-PCR方法检测药物处理的HL-60细胞组与对照组SHP-1、C-kit基因的mRNA的表达水平。用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测HL-60细胞中SHP-1基因的甲基化状态的变化。结果表明,在原本不表达SHP-1 mRNA的HL-60细胞中,经过As2O3的去甲基化作用后,SHP-1得到表达,而使原来高表达的C-kit mRNA的表达水平随之下降。当1.0μmol/L、2.5μmol/L、5.0μmol/L As2O3分别作用于白血病细胞株时,去甲基化作用增强,SHP-1 mRNA的表达水平呈上升趋势,C-kit mRNA的表达水平呈下降趋势,经两两比较,二者间有统计学意义（P〈0.05）。结论：HL-60细胞株中SHP-1 mRNA表达缺如,经去甲基化作用后表达恢复,说明SHP-1基因高度甲基化与白血病发生有关;在白血病形成中可能存在C-kit mRNA表达的异常增高。As2O3对SHP-1与C-kit的表达水平的影响呈剂量依赖性,浓度越高,SHP-1平均表达水平越高,C-kit mRNA表达水平越低,在特定的浓度下,呈现时间依赖性;SHP-1 mRNA与C-kit mRNA表达呈负相关,提示白血病细胞中SHP-1表达降低或缺如削弱了对C-kit信号通路的负调控而在白血病形成中发挥作用。     

同源盒HOXA1基因在髓系白血病细胞内的表达

目的研究HOXA1基因在髓系白血病细胞内的表达及药物对其表达的影响. 方法采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,研究全反式维甲酸(ATRA)对HL-60细胞内同源盒HOXA1基因表达的影响.同时对9例髓系白血病患者的HOXA1基因表达进行了检测. 结果①ATRA可上调HL-60细胞内HOXA1基因的表达.②所有受检白血病患者的HOXA1基因表达水平均比正常对照组高(P＜0.01). 结论 ATRA可能通过增强HOXA1基因表达使癌细胞朝良性细胞分化.     

多种化疗药对凋亡抑制蛋白Survivin在HL-60细胞中表达的影响

Survivin基因是细胞凋亡抑制蛋白家族的新成员，由于其具有在人类正常组织不表达而在各种肿瘤组织高表达的特性，因此有望成为肿瘤治疗的选择性靶点；有研究还表明survivin的表达与耐药性的发生有关。本研究旨在通过查明HL-60细胞在多种化疗药物作用后mRNA和蛋白的改变，初步探讨survivin和耐药性之间的关系。用合适浓度的柔红霉素（DNR）、米托蒽醌（MIT）和三氧化二砷（As2O3）作用于HL-60细胞，随后用RT-PCR检测给药的第1天和第3天HL-60细胞中survivin mRNA的表达情况，用Western blot检测survivin蛋白的表达情况。结果表明：在给予化疗药的第1天3组HL-60细胞中survivin mRNA表达水平全部降低，其中DNR组下降了10％，MIT组下降40％（P〈0．01），As2O3组下降了25％（P〈0．01）。在给予化疗药的第3天，DNR和MTT组的HL-60细胞中survivin mRNA表达较第1天有明显的升高，分别上升20％（P〈0．05）和65％（P〈0．01）；但给予As2O3组中的survivin mRNA表达仍持续降低，仅为第1天的68％（P〈0．01）。Western blot检测发现，给予DNR和MIT3天后的HL-60细胞中survivin蛋白含量分别升高了14％和11％，而给予As2O3组则下降了82％。结论：在给予化疗药后白血病细胞survivin表达先降低后升高的现象可能与化疗中耐药性的发生有关，而三氧化二砷有着不同的作用机制，这在逆转耐药性上可能发挥重要的作用。     

三氧化二砷对HL-60细胞增殖、分化和凋亡的影响及其作用机制探讨

目的:观察三氧化二砷(As2O3)对HL-60细胞增殖、分化和凋亡的影响,并探讨其相关作用机制。方法:不同浓度As2O3处理HL-60细胞,应用MTS/PES方法检测细胞增殖,NBT实验测定细胞分化,流式细胞术检测细胞凋亡和分化相关抗原CD11b的表达,SYBR Green real-time RT-PCR方法检测C-FES、BCL-2、BAX、Survivin、P21和P27 mRNA水平变化。结果:As2O3能明显抑制HL-60细胞增殖,其效应呈剂量依赖和时间依赖性(r=-0.967;r=-0.954);低浓度(0.1、0.5和1.0μmol/L)As2O3能明显促进细胞分化,NBT阳性率和CD11b表达水平均有不同程度的增高;较高浓度As2O3(2.5和5.0μmol/L)能明显诱导细胞凋亡,抑制细胞分化。HL-60细胞经1.0和5.0μmol/L浓度As2O3处理后,C-FES mRNA表达均明显上调,但以1.0μmol/L组更为明显,证实C-FES mRNA表达水平与细胞分化程度成正比。此外,5.0μmol/L浓度As2O3显著下调了HL-60细胞BCL-2和Survivin的表达,相反明显上调了BAX、P21和P27的表达。结论:As2O3能明显抑制HL-60细胞增殖、促使细胞分化成熟及诱导细胞凋亡,其机制可能涉及C-FES以及细胞周期和凋亡相关基因的调控。     

TGF-β1和(或)三氧化二砷作用于HL-60细胞后P27~(Kip1)表达及凋亡情况的研究

本研究观察三氧化二砷(As2O3)和/或TGF-β1对HL-60细胞凋亡及细胞周期的影响,以及作用前后P27Kip1、内源性TGF-β1、cyclinE和BCL-2的变化情况。As2O3和/或TGF-β1作用于HL-60细胞,用细胞形态学观察及流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期改变情况,应用免疫组织化学检测药物处理前后P27Kip1、内源性TGF-β1、cyclinE以及BCL-2表达的变化情况。结果表明:As2O3和TGF-β1单用均可以诱导HL-60细胞发生凋亡,联合处理对HL-60细胞生长抑制作用强于单药处理,其中5μmol/LAs2O3作用最强,5ng/mlTGF-β1处理可引起HL-60细胞的细胞周期阻滞于G1期(p0.05)。5ng/mlTGF-β1和联合处理组P27Kip1的表达较对照组增强(p0.05);5μmol/LAs2O3处理组P27Kip1的表达与对照组比较无明显差异(p0.05)。5ng/mlTGF-β1和联合处理组均可见cyclinE蛋白表达下调(p0.05)。5μmol/LAs2O3和联合处理组可见内源性TGF-β1表达上调(p0.05)。结论:As2O3、外源性TGF-β1均可诱导HL-60细胞凋亡,联合处理组诱导凋亡作用强于对照组和单药处理组,TGF-β1处理可引起HL-60细胞周期阻滞于G1期。TGF-β1诱导HL-60细胞凋亡过程中P27Kip1表达增强,拮抗cyclinE和BCL-2的作用,细胞周期阻滞,诱导细胞发生凋亡,这表明P27Kip1是TGF-β引起细胞周期阻滞的关键效应物,外源性TGF-β1又通过上调内源性TGF-β1的表达增强As2O3诱导原代APL细胞凋亡的作用。     

砷剂和维甲酸对 NB4细胞组织因子和凝血酶调节蛋白mRNA及促凝活性的影响

为了研究三氧化二砷(As203)和全反式维甲酸(ATRA)对NB4细胞组织因子(TF)和凝血酶调节蛋白(TM)mRNA及其表达的影响,本研究采用体外细胞培养方法,以As2O3、ATRA处理NB4细胞,用ELISA动态测定其TF、TM抗原表达及促凝活性(PCA)变化,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定TF和TM的mRNA转录.结果表明1 μmol/L的As2O3和1 μmol/L ATRA均可使NB4细胞TF抗原及mRNA表达呈时间依赖性渐进性下调;在24、48、72、96和120小时时间点,As2O3组TF抗原的表达水平分别为13.3±1.8,8.6±1.9,10.8±1.5,2.0±0.6和2.6±0.9 ng/107;ATRA组TF抗原的表达水平分别为12.4±1.1,11.3±1.8,5.7±1.7,2.8±0.8和2.0±0.6 ng/107,与对照组比较具有显著性(P＜0.05);在不同的时间点As2O3和ATRA,均可使其PCA下降,As2O3组血凝时间分别为123.5±10.5,156.3±11.6,179.3±15.3,248.9±20.1,312.0±29.8(秒);ATRA组血凝时间分别为76.4±5.6,146.8±10.9,198.2±15.6,265.8±20.6和363.8±31.9(秒);ATRA使NB4细胞TM抗原表达及其mRNA转录上调.结论As2O3、ATRA可降低TF mRNA转录,下调TF蛋白表达,降低NB4细胞PCA;ATRA增高TM转录及表达,缓解APL患者凝血功能异常.     

白藜芦醇逆转急性髓系白血病细胞HL-60/ADR耐药的凋亡机制

目的:探讨白藜芦醇(Resveratrol,Res)逆转急性髄系白血病细胞HL-60/ADR耐药的凋亡机制。方法:将HL-60/ADR细胞分为对照组(Control)、阿霉素(ADR)处理组、Res处理组和ADR+Res联合处理组4组。应用CCK-8法测定细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞内阿霉素(ADR)自发荧光强度和细胞凋亡率;RT-PCR法检测耐药基因MRP1、抗凋亡基因BCL-2和促凋亡基因BAX mRNA表达水平,Western blot法测定MRP1、BCL-2和BAX蛋白表达水平。结果:25、50、100和200μmol/L Res作用于HL-60/ADR细胞48 h后,细胞的最大抑制率分别为44%、61%、76%和81%,呈浓度依赖性(r=0.876,P0.05);与ADR组的半数抑制浓度(IC50)(8.534±1.111μmol/L)相比,ADR+Res组HL-60/ADR细胞的IC50(1.591±0.373μmol/L)明显减少(P0.05)。ADR联合Res后HL-60/ADR耐药细胞内ADR自发荧光强度明显增加(P0.05);Res组和ADR+Res组细胞凋亡率均显著增加(P0.05)。Res组和ADR+Res组的MRP1 mRNA、BCL-2 mRNA表达水平显著下降(P0.05),BAX mRNA表达水平明显上升(P0.05)。Res组和ADR+Res组M RP1、BCL-2蛋白表达水平显著下降(P0.05),BAX蛋白明显上升(P0.05)。结论:白藜芦醇具有逆转HL-60/ADR细胞耐药的作用,可能是通过促进HL-60/ADR细胞凋亡、抑制耐药蛋白M RP1而发挥作用,其促凋亡机制与抑制BCL-2和增强BAX表达有关。     

ATRA诱导小鼠间充质干细胞棕色成脂分化的分子机制

目的研究全反式维甲酸(ATRA)或骨形态发生蛋白7(BMP7)诱导小鼠间充质干细胞定向分化为成熟棕色脂肪细胞的作用及机制。方法采用ATRA或BMP7对小鼠间充质干细胞C3H10T1/2进行体外诱导,使其向棕色脂肪细胞定向分化,比较二者诱导分化棕色成脂效果;采用油红O染色鉴定棕色脂肪细胞成脂能力,线粒体染色检测棕色脂肪细胞富集的线粒体,免疫印迹法检测脂肪分化相关基因、棕色脂肪标志基因表达,采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测BMP7、线粒体相关基因及棕色脂肪细胞分化抑制因子Necdin、Wnt10a及Pref1的表达情况。结果 ATRA诱导C3H10T1/2细胞向棕色脂肪细胞分化的最适浓度为1～2μmol/L。采用1μmol/L ATRA预处理3 d(ATAR组)后,与对照组[采用二甲基亚砜(DMSO)处理]比较,ATRA组线粒体相关基因CyctoC、Tfam及Nrf1的mRNA相对表达量明显升高(P0.05),棕色脂肪细胞分化抑制因子Necdin和其下游靶基因Pref1、Wnt10a的mRNA相对表达量明显降低(P0.05),BMP7 mRNA相对表达量明显升高(P0.05)。不同浓度的ATRA均可使BMP7蛋白表达量升高,且呈剂量效应。采用1μmol/L ATRA预处理0、24和48 h,BMP7蛋白表达量逐渐升高,Necdin蛋白表达量逐渐降低。ATRA与BMP7的诱导效果一致。结论 ATRA具有诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2分化为棕色脂肪细胞的能力,其机制可能是通过调控BMP7,诱导棕色前体脂肪细胞定向分化。     

白血病细胞HOX A基因亚群启动子区域异常甲基化的研究

目的 研究HOX A基因启动子区域CpG岛在多种白血病细胞系和白血病患者骨髓细胞中的甲基化特点和全反式维甲酸(ATRA)对其甲基化的影响.方法 选取11种白血病细胞系、3种白血病45例患者治疗前后骨髓细胞以及2名正常成人外周血白细胞,常规提取DNA并用重亚硫酸盐法处理.然后用PCR法扩增目标序列,采用焦磷酸测序法测定其中CpG位点的甲基化,以5-杂氮-2'-脱氧胞苷(DAC)或ATRA处理HL-60和K562细胞后测定以上片段的甲基化.结果 所检测的HOX A基因亚群在正常白细胞均无甲基化,HOX A1在所有标本均无甲基化,HOX A4、A6、A7、A9、A10和A11均存在多个CpG位点的甲基化甚至高甲基化,其中T细胞白血病细胞系和B细胞白血病细胞系CpG位点甲基化比例(分别为71.4%和85.7%)明显高于其他组细胞;HOX A4在所有细胞系中均存在甲基化,HOX A6和HOX A7在绝大多数细胞系中存在甲基化,HOX A10和HOX A11在K562和HL-60细胞中存在甲基化(38%～86%),HOX A9在髓系白血病细胞系中多表现为低甲基化,HOX A11在B细胞白血病细胞系中为高甲基化(均>50%).治疗缓解后的急性髓系白血病及急性淋巴细胞白血病患者比治疗前HOX A4、A6甲基化水平明显减低,而慢性粒细胞白血病患者HOX A6和A9甲基化水平明显减低.用ATRA处理后HL-60细胞HOX A4、A6和A10甲基化水平明显减低,而K562细胞仅HOX A6甲基化减低.结论 白血病细胞在HOX A基因亚群启动子区域多呈现异常甲基化,且部分基因亚群表现为不同种类白血病特异性高甲基化;ATRA可以通过多种途径降低白血病细胞系,尤其是HL-60细胞部分HOX A基因亚群CpG甲基化水平.     

人脐带间充质干细胞增强全反式维甲酸对HL-60细胞的诱导分化作用

本研究探讨人脐带间充质干细胞(hucMSC)对全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60细胞分化以及对HL-60增殖的影响。HL-60细胞分为4组:未经ATRA处理的对照组、与hucMSC细胞共培养的hucMSC组,经ATRA处理的ATRA组以及经ATRA处理并与hucMSC细胞共培养的ATRA+hucMSC组。在规定时间采用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测对照组和hucMSC组HL-60细胞增殖情况;在光学显微镜下观察各组细胞形态、NBT阳性细胞;应用real-timePCR方法检测c-myc基因表达水平以及流式细胞术检测CD11b表面标志以比较各组中HL-60细胞的分化情况。结果表明:共培养体系中hucMSC细胞能抑制HL-60的增殖,hucMSC∶HL-60为1∶1时,48小时时p0.05,72小时时p0.01;hucMSC∶HL-60为1∶5时,72小时时p0.05。在2μmol/LATRA的刺激下,ATRA+huc-MSC组与ATRA组相比,出现更多具有中性粒细胞形态的HL-60细胞和更高的NBT阳性率(p0.05);ATRA+hucMSC组中HL-60细胞c-myc基因表达更低(p0.05);ATRA+hucMSC组中HL-60细胞CD11b的表达更高(48小时p0.05,72小时p0.01)。结论:脐带间充质干细胞能抑制HL-60增殖并且增强ATRA对HL-60细胞的诱导分化作用。     

槲皮素对白血病细胞中PML基因及蛋白表达的影响和定位的研究

目的 探讨PML基因及蛋白在白血病细胞中的表达和细胞内分布定位。方法 经全反式维甲酸（ATRA）、槲皮素处理后的NB4、HL-60、K562细胞为研究对象，细胞形态学观察采用Wright染色法及荧光染色法；PML蛋白细胞分内分布定位采用免疫荧光技术；PML mRNA表达的检测采用RT-PCR法。结果 （1）ATRA处理后，NB4和HL-60细胞形态学上出现分化表现，K562细胞无变化；经槲皮素处理后，各组细胞形态学上均出现凋亡特征性改变。（2）ATRA处理后，NB4细胞内融合蛋白降解，PML蛋白恢复定位，HL-60、K562细胞内PML蛋白定位分布无变化；槲皮素处理后NB4细胞内融合蛋白降解，PML蛋白聚积于POD结构，随后降解，在HL-60及K562细胞，PML蛋白发生相似改变。（3）ATRA、槲皮素对各组细胞PMLmRNA表达均无显著影响。结论 在不同诱导剂刺激下，PML在蛋白水平参与细胞终末分化及诱导白血病细胞凋亡机制；PML蛋白在POD中发挥诱导凋亡、控制细胞生长的作用。     

汉防己甲素诱导HL-60细胞分化

目的:探讨汉防己甲素(Tetrandrine)靶向黏蛋白1(MUC1)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化。方法:以HL-60细胞株作为研究对象,选取对数生长期细胞,分为空白对照、ATRA、汉防己甲素和ATRA+汉防己甲素,共4组。显微镜下观察各组细胞形态的变化;用NBT还原实验分析细胞分化能力的变化;采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达的变化;采用Western blot检测MUC1表达的变化。结果:汉防己甲素可以诱导HL-60细胞分化;ATRA+汉防己甲素组NBT还原阳性率明显高于ATRA和汉防己甲素组(P<0.05);ATRA+汉防己甲素组CD11b+细胞百分率(43.62%±1.38%)明显高于汉防己甲素(15.25%±2.11%)、ATRA(21.84%±7.53%)和空白对照组(8.16%±1.01%)(P<0.05);汉防己甲素组MUC1蛋白量明显低于空白对照组和ATRA组(P<0.05)。结论:汉防己甲素体外能协同ATRA使HL-60细胞分化成熟,其作用机制可能与调控MUC1的表达有关。     

全反式维甲酸和亚硒酸钠对HL-60细胞VEGF及其受体表达的影响

为了探讨非骨髓毒性药物全反式维甲酸(ATRA)及具有防癌作用的微量元素硒的化合物——亚硒酸钠(Na2SeO3)对HL-60细胞系血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体表达的影响，应用ELISA法检测药物作用前后细胞培养上清液中VEGF含量，流式细胞术测定细胞表面VEGF受体表达。结果发现，5μmol／L和10μmol／L的ATRA作用48小时和72小时后细胞上清液中VEGF含量显著减低，ATRA在48小时对HL-60细胞表面的VEGF受体表达无抑制作用，在72小时可抑制细胞表面的受体表达。Na2SeO3在5μmol／L和10μmol／L浓度条件下作用48小时、72小时，对HL-60细胞培养上清液中VEGF的含量无明显抑制效应，对HL-60细胞表面VEGF-R的表达有显著的抑制作用。结论：ATRA具有抑制白血病细胞HL-60 VEGF及其受体表达的作用，Na2SeO3对HL-60细胞分泌VEGF无抑制作用，但可抑制HL-60细胞表面表达VEGF受体，其机制尚需进一步明确。由于ATRA和Na2SeO3无明显的骨髓抑制作用，但具有抗血管新生的活性，故推测它们与常规放化疗相结合，将会增强放化疗的疗效，减少后者的用量，降低毒性，有助于白血病的治疗。     

硼替佐米单独或联合三尖杉酯碱、三氧化二砷对耐药白血病细胞增殖、凋亡的影响

目的 探讨硼替佐米单独或联合三尖杉酯碱(HT)、三氧化二砷(As2O3)对HL-60/ADM多药耐药细胞株和难治、复发急性白血病原代细胞增殖、凋亡的影响.方法 以HL-60/ADM白血病细胞株及难治、复发急性白血病患者原代细胞为研究对象,采用硼替佐米单独或联合HT、As2O3,处理细胞,MTT法观察细胞增殖活力,Hoechst33342染色、流式细胞术检测细胞凋亡率及检测胞内阿霉素荧光阳性率,进一步分析硼替佐米逆转耐药能力.结果 10～50 nmol/L硼替佐米能够抑制HL-60/ADM细胞增殖并引起凋亡,其中40 nmol/L处理48 h达最大抑制效果;应用15 μmol/L As2O3和752nmoL/L HT分别与不同浓度硼替佐米联合处理HL-60/ADM细胞,其对HL-60/ADM细胞的增殖抑制率和凋亡率均高于硼替佐米单药处理组(P值均<0.05).10 nmol/L硼替佐米能使HL-60/ADM细胞对阿霉素的蓄积作用大大提高.硼替佐米对难治、复发急性白血病患者原代细胞的增殖抑制作用与HL-60/ADM细胞一致.结论 硼替佐米能够抑制HL-60/ADM细胞及难治、复发急性白血病原代细胞增殖并诱导其凋亡,与HT或As2O3联合具有相加作用.     

JWA基因在HL-60细胞定向分化中的表达及意义

为了研究JWA基因在HL-60细胞定向分化中的表达规律,探讨其在白血病细胞分化和凋亡中的意义及可能的作用机制,应用FCM检测HL-60细胞经ATRA（10^-6 mol/L）、Ara-C（10 ng/ml）、TPA（10^-8 mol/L）作用后2、4、6、8天CD13、CD14、CD15、CD11b改变及细胞周期变化;应用半定量RT-PCR及蛋白印迹技术检测JWA基因在HL-60细胞定向分化中的表达趋势以及相关凋亡因子Bcl-2、HSP27和HSP70的表达.结果表明：经上述药物分别处理HL-60细胞后,不同时段FCM相关指标检测结果证明其分别向粒、单核、巨噬细胞样分化.JWA基因表达呈时间依赖性升高;Bcl-2则呈时间依赖性下降;HSP70在ATRA及TPA组与JWA表达呈正相关,与Bcl-2呈负相关,而各组HSP27并无表达.ATRA处理HL-60细胞后JWA基因表达趋势与原代细胞相反,且不需要ATRA诱导分化作为前提.分别以Ara-C 10 ng/ml和Ara-C 20 ng/ml处理HL-60细胞后,JWA基因的表达呈反向变化,即前者呈时间依赖性增加,而后者则下降.结论：JWA基因在实现ATRA及TPA诱导白血病细胞分化和凋亡中可能具有双重调节作用;JWA基因表达的高低与Ara-C诱导分化作用及细胞毒作用有关;HL-60细胞与原代白血病细胞在诱导分化机制方面可能不尽相同.     

米哚妥林对急性白血病细胞株HL-60细胞抑制效应的研究

目的:探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂米哚妥林(PKC412)对HL-60细胞株增殖和凋亡的影响及作用机制.方法:采用CCK-8法检测不同浓度PKC412对HL-60细胞增殖的影响;瑞士吉姆萨染色法鉴定PKC412对HL-60细胞凋亡的影响;qRT-PCR检测BCL-2、P53基因的mRNA表达,Western blot...