凝血酶对狼疮肾炎末梢血单个核细胞分泌Th1/Th2细胞因子的影响

目的探讨狼疮肾炎(LN)患者凝血活性对其Th1/Th2平衡的影响。方法LN患者20例,按红斑狼疮病情活动指数(SLEDAI)分为稳定组11例(SLEDAI<9分),活动组9例(SLEDAI≥9分)。健康对照组8例。采集末梢血单个核细胞(PBMC),进行高、低浓度凝血酶刺激下体外培养。ELISA法检测培养液上清IL-10、IFN-γ水平。RT-PCR检测IL-10和IFN-γmRNA表达。结果凝血酶呈浓度依赖性上调LN患者PBMCIL-10表达,但不影响IFN-γ表达,故增加IL-10/IFN-γ比值。结论凝血酶加重狼疮肾炎患者PBMC分泌Th1/Th2细胞因子的平衡紊乱。     

肝癌合并肝硬化患者脾脏Th1/Th2细胞因子免疫状态的研究

目的：探讨肝癌合并肝硬化患者脾脏Th1/Th2细胞因子分泌状态的变化。方法：以肝硬化患者为对照组，用酶联免疫吸附（ELISA）方法分析了31例肝癌合并肝硬化患者外周血有脾静脉血γ－干扰素（IFN－γ），白细胞介素（IL）－2，IL－10蛋白水平的表达。结果：6例Ⅰ期肝癌患者外周血IL－2，脾静脉血ITNF－γ高于肝硬化组（P＜0．01或P＜0．05），外周及脾静脉IL－10低于肝硬化组（P＜0．05）。12例Ⅱ期13例Ⅲ期肝癌患者外周血及脾静脉血IFN－γ，IL－2明显低于肝硬化组（P＜0．01或P＜0．05），而IL－10明显高于肝硬化组（P＜0．05），且脾静脉血IFN－γ，IL－2低于外周血，IL－10高于外周血水平（P＜0．05）。结论：Ⅰ期肝癌合并肝硬化患者机体免疫系统通过强势分泌Th1细胞因子发挥抗肿瘤免疫作用，而脾脏在维持Th1/Th2细胞因子平衡中起重要作用。随着肿瘤进展，机体细胞免疫功能受损，中晚期肝癌患者Th1细胞因子水平降低，Th2细胞因子水平增高，机体处于免疫抑制状态，而脾脏Th1/Th2细胞因子紊乱更为明显，呈现负性抗肿瘤免疫作用，加重了机体免疫抑制。     

Th1/Th2与重症胰腺炎

Th1/Th2型淋巴细胞是近年来研究的热点。目前已知它与多种疾病有关,但在重症胰腺炎中的研究较少。已有研究提示,在重症胰腺炎时Th1/Th2的平衡向Th2漂移,呈现Th2细胞因子的过度激活和对有害物质的免疫耐受状态,而纠正Th1/Th2的极化可能在重症胰腺炎的治疗上有重要意义。     

自身免疫性甲状腺病Th1／Th2细胞因子平衡的偏离

目的探讨自身免疫性甲状腺病中Graves病和桥本甲状腺炎患者外周血Th1／Th2细胞因子平衡偏离的方向。方法应用酶联免疫吸附法分别检测50例Graves病患者，20例桥本甲状腺炎患者和20例健康献血者外周血γ干扰素（IFN-γ）和白介素-4（IL-4）。以IFN—γ/IL-4作为反映Th1/Th2细胞因子的指标。结果与正常对照组对比，Graves病和桥本甲状腺炎患者外周血IFN-γ无明显变化（P〉0．05），IL-4明显下降（P〈0．01），而IFN—γ/IL-4比值升高（P〈0．05）。结论自身免疫性甲状腺病中Graves病和桥本甲状腺炎外周血Th1/Th2细胞因子平衡显现Th2细胞因子低下型，而Th1／Th2相对升高。     

苏木水提取物的抗急性排斥与Th1/Th2免疫偏移作用

目的探讨苏木水提取物在心脏移植中的免疫抑制作用及其机制。方法以W istar大鼠为供者、SD大鼠为受者,建立异位(腹腔)心脏移植模型。96只SD大鼠随机分为4组,每组24只。对照组:术前给橄榄油(8m l/kg.d);A组:给环孢菌素A(5m g/kg.d);B组:给苏木水提取物(37.5g/kg.d);C组:给苏木水提取物(25g/kg.d)+半量环孢菌素A(2.5m g/kg.d)。术后观察移植心的存活时间,心肌组织学和超微结构改变,术后3d和7d用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测移植心脏白细胞介素-2(IL-2)信使核糖核酸(mRNA)、白细胞介素-10(IL-10)mRNA的表达,用酶联免疫吸附测定法(EL ISA)检测血清IL-2和IL-10的含量。结果与对照组比较,A组、B组、C组移植心存活时间延长(P<0.01),淋巴细胞浸润和心肌坏死程度较对照组轻,心肌IL-2mRNA表达较对照组减弱(P<0.01),IL-10mRNA表达较对照组增强(P<0.01)。A组术后3d和7d,B组、C组术后3d血清IL-2水平较对照组明显降低(P<0.01),A组术后7d,B组术后3d血清IL-10较对照组增高(P<0.05)。结论苏木水提取物在心脏移植后具有免疫抑制作用,可引起T h1向T h2免疫偏移。     

联合免疫治疗对肝移植大鼠移植肝组织学和外周血Th1/Th2细胞因子的影响

目的用抗CD-40L单抗加小剂量CsA联合免疫治疗肝移植大鼠受体,观察其生存时间?移植肝组织学和Th1/Th2细胞因子谱的变化。方法建立大鼠肝移植模型后,将动物随机分为4组。A组为同基因移植组,SD→SD;B组为同种异体移植组,SD→Wistar,不用任何免疫抑制治疗措施;C组,SD→Wistar,采用CsA处理;D组,SD→Wistar,采用CsA加抗CD-40L(CD-154)单抗处理。观察各组肝移植受体生存期和移植肝病理变化;用ELISA法检测外周血细胞因子水平。结果A,D组均可长期存活,B,C组生存时间分别为(13.8±2.4)d,(29.8±4.1)d;B,C组病理组织切片见中/重度急性排斥反应,D组移植肝组织损伤程度显著减轻,A组基本无排斥反应。B组血清IL-2和IFN-γ高于其余各组(P<0.05),C,D组IL-4,IL-10水平较B组有所升高(但P>0.05),尤其D组IL-10表达水平显著高于B组(P<0.05)。结论联合免疫治疗可有效抑制其急性排斥反应,延长大鼠肝移植受体的生存时间。Th2类细胞因子IL-4和IL-10的高水平表达与诱导移植耐受、抑制排斥反应有重要关系,它有助于大鼠肝移植受体和移植肝的长期存活。     

慢性乙型肝炎肝纤维化患者Th1／Th2细胞及其细胞因子的变化

目的探讨Th1／Th2细胞及其分泌的细胞因子在慢性乙型肝炎（CHB）肝纤维化患者发生发展中的作用。方法选取2011年3—10月在河北医科大学第三医院感染科接受肝组织病理活检的CHB肝纤维化患者46例,根据纤维化分期分为S0～1期15例,S2～3期20例,S4期11例三组,另取同期健康志愿者10名作为健康对照组。用流式细胞术和实时荧光定量PCR检测外周血Th1、Th2细胞频率和单个核细胞（PBMCs）中干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素4（IL-4）基因表达;用ELISA法检测血清IFN-γ和IL-4水平;用免疫组织化学染色检测肝组织IFN-γ和IL4表达。应用Spearman相关分析、Kruskal—WallisH检验、Logistic逐步回归方法分析Th1／Th2细胞及其细胞因子在CHB肝纤维化患者外周血和肝组织中的变化。结果不同肝纤维化分期的CHB患者外周血Th1／Th2细胞频率的比值、PBMCs中IFN-γ／IL-4mRNA、血清中IFN-γ／IL-4及肝内IFN-γ／IL-4差异均有统计学意义,并随肝纤维化程度加重逐渐下降（χ2=36．259、40．822、26．321和31．852,P〈0．05）。血清及肝组织中IFN-γ,／IL-4比值与肝纤维分期均呈负相关（r=-0．616和-0．531,P〈0．01）。Logistic回归分析显示：AST、凝血酶原时间（PT）和血清IFN-γ／IL4比值是发生显著肝纤维化（S2-4）的三个独立危险因素（OR=5．933,95％CI：1．324～26．586,P=0．02;OR=12．866,95％CI：1．746～94．788,P=0．01;OR=4．755,95％CI：1．034～21．862,P：0．04）。结论CHB患者体内存在Th1／Th2失衡,随着肝纤维化进展,外周血及肝脏内均呈现Th2应答的极化现象,这可能是CHB肝纤维化发生发展的一种机制。     

原发性肝癌病人Th1/Th2的漂移研究

目的研究原发性肝癌(PHC)病人Th1／Th2的漂移。方法以IFN-γ和IL-2代表Th1类细胞因子，IL-4和IL-10代表Th2类细胞因子，以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测39例原发性肝癌病人外周血单个核细胞(PBMC)及11例癌组织和癌旁组织中Th1／Th2类细胞因子mRNA的表达，以6例健康人作为对照。结果39例PHC病人PBMC中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肝癌Th1型细胞因子表达率分别为5／7、20／26、0／6，Th2型细胞因子表达率分别为0／7、2／26、5／6。11例癌组织和癌旁组织的Th1／Th2状态与其PBMC呈正相关(癌组织和PBMC，rs=0．8101，P=0．0025；癌旁组织和PBMC，rs=0．7698，P=0．0056)。结论Ⅰ期和Ⅱ期PHC病人PBMC中Th1类细胞因子强势表达，Ⅲ期PHC病人PBMC以Th2类细胞因子表达为主。癌组织和癌旁组织的Th1／Th2状态与其PBMC是一致的。     

Th1/Th2细胞因子在深静脉血栓形成中的变化规律

目的：研究深静脉血栓形成（DVT）中Th1/Th2细胞因子的变化规律。方法：选取DVT患者66例,按病程分为1~3 d组、4~7 d组、8~15 d组和16~30 d组,观察Th1/Th2相关因子TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10水平。结果：DVT患者TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10均较对照组明显升高,1~3 d组、4~7 d组的IFN-γ/IL-4比值较对照组升高,8~15 d组和16~30 d组IFN-γ/IL-4比值较对照组降低。结论：DVT中存在Th1/Th2的分化失衡,Th1/Th2细胞因子可以作为临床病情评估和疗效评价的指标。     

体外调节Th1/Th2平衡治疗脑胶质瘤

目的 观察外源性细胞因子白细胞介素( IL)-2、干扰素(IFN)-γ和IL-4单克隆抗体(McAb)、IL-10 McAb在体外能否促使Th2型细胞因子分泌优势向Th1型逆转,抑制胶质瘤细胞生长。方法 体外培养大鼠C6胶质瘤细胞,加入外源性细胞因子共同孵育,光学显微镜观察细胞形态学变化,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Th1/Th2类细胞因子表达变化。结果 实验组较对照组细胞体积变小,生长密度低,细胞数目少;实验组与对照组比较细胞增殖抑制率分别为(26.41 ±3.60)％,其A值与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。对照组细胞只表达Th2类细胞因子,Th1类细胞因子表达缺如,实验组IFN-γ表达增加,IL-4和IL-10表达减弱,但是未见IL-2表达。结论 外源性细胞因子能够抑制脑胶质瘤细胞的生长,促进Th2型细胞因子分泌优势向Th1型逆转。     

B7-CD28/CTLA4共刺激通路与胰岛移植

目的：探讨B7-CD28/细胞毒T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)共刺激通路在胰岛移植中的重要作用。方法：采用文献回顾的方法对该共刺激通路的分子结构、功能以及有关动物实验的资料进行综述。结果：B7-CD28/CT-LA4共刺激通路是T淋巴细胞活化、增殖的信号传导通路之一，若缺乏共刺激信号，则会导致T淋巴细胞呈克隆无反应状态。CTLA4-Ig通过阻断CD28介导的共刺激通路，使胰岛移植物在受者体内长期存活。结论：通过对B7-CD28/CT-LA4共刺激通路的研究，有助于了解移植胰岛存活的免疫机理。     

Blockade of the PD-1/PD-1L pathway reverses the protective effect of anti-CD40L therapy in a rat to mouse concordant islet xenotransplantation model

BACKGROUND: We have previously demonstrated that costimulatory blockade with anti-CD40L monoclonal antibody (mAb) prolongs the survival of non-vascularized concordant rat to mouse islet xenografts. Here, we examine whether signaling through the PD-1/PD-1L pathway is required for the anti-CD40L therapy to prolong concordant islet graft survival using a novel anti-murine PD-1 mAb (clone 4F10). METHODS: C57BL/6 mice received a cellular concordant islet xenograft under the left kidney capsule and four experimental groups were prepared. Group I: untreated control; group II: recipient mice were treated with three doses of 0.5 mg of anti-CD40L mAb (clone MR1) on days 0, 2 and 4; group III: mice were treated with 0.5 mg of anti-PD-1 (CD279) mAb (clone 4F10) every other day for 8 days; and finally group IV: mice received the combined treatment that consisted of anti-CD40L plus anti-PD-1 mAb. RESULTS: Concordant islet xenografts transplanted in control untreated mice showed a median survival time (MST) of 17 +/- 7.43 days, whereas anti-CD40L treatment led to a significant prolongation of graft survival (MST: 154 +/- 65.56, P < 0.0001). The administration of anti-PD-1 alone significantly accelerated graft rejection compared to non-treated controls (MST: 10 +/- 2.24 vs. MST: 17 +/- 7.43, P < 0.0004). Remarkably, the combined administration of anti-CD40L and anti-PD-1 reversed the protective effect obtained with anti-CD40L alone (anti-CD40L, MST: 154 +/- 65.56 vs. anti-CD40L plus anti-PD-1, MST: 10 +/- 7.72, P < 0.0002). CONCLUSION: Overall, our data indicate that the PD-1/PD-1L pathway is required for the achievement of prolonged graft survival in anti-CD40L-treated mice in a setting of rat to mouse concordant islet xenotransplantation.     

Preclinical Efficacy and Immunological Safety of FR104, an Antagonist Anti‐CD28 Monovalent Fab′ Antibody

Antagonist anti‐CD28 antibodies prevent T cell costimulation and differentiate from CTLA4Ig since they cannot block CTLA‐4 and PDL‐1 coinhibitory signals. They demonstrated efficacy in suppressing effector T cells while enhancing regulatory T cells function and immune tolerance. However, anti‐CD28 antibodies devoid of immunotoxicity and with a good pharmacokinetic profile have not yet been developed. Here, we describe FR104, a novel humanized pegylated anti‐CD28 Fab′ antibody fragment presenting a long elimination half‐life in monkeys. In vitro, FR104 failed to induce human T cell proliferation and cytokines secretion, even in the presence of anti‐CD3 antibodies or when cross‐linked with secondary antibodies. Furthermore, in humanized NOD/SCID mice adoptively transferred with human PBMC, whereas superagonist and divalent antibodies elicited rapid cytokines secretion and human T cell activation, FR104 did not. These humanized mice developed a florid graft‐versus‐host disease, which was prevented by administration of FR104 in a CTLA4‐dependent manner. Interestingly, administration of high doses of CTLA4‐Ig was ineffective to prevent GVHD, whereas administration of low doses was partially effective. In conclusion, we demonstrated that FR104 is devoid of agonist activity on human T cells and thus compatible with a clinical development that might lead to higher therapeutic indexes, by sparing CTLA‐4, as compared to CD80/CD86 antagonists.     

2型糖尿病肾病患者外周血CD28/CTLA4共刺激分子的表达及其意义

目的:探讨2型糖尿病(T2DM)肾病患者外周血T细胞亚群、共刺激分子CD 28及细胞毒T淋巴细胞抗原(CTLA)4的表达及其临床意义。方法:选取2015年07月~2018年06月至我科室和内分泌科治疗的患者,根据尿微量清蛋白排泄率(UAER)将其分为DM组(T2DM无肾病,n=42)和DN组(T2DM合并肾病,n=40),同时选取健康人群40例作为对照(NC组)。采用流式细胞技术测定两组患者外周血T淋巴细胞上CD4、CD8的表达,并用流式细胞技术测定CD4^+、CD8^+T淋巴细胞表面CD28、CTLA4分子的表达。结果:三组外周血CD4^+和CD4^+/CD8^+按NC组-DM组-DN组顺序均呈显著递增趋势(P<0.01),CD3^+、CD8^+按照顺序呈显著递减趋势(P<0.01),且各组间差异明显(P<0.01);三组外周血CD4^+CD28^+、CD8^+CD28^+ T细胞按NC组-DM组-DN组顺序均呈显著递增趋势(P<0.01),CD4^+CTLA4+及CD8^+CTLA4+T细胞按照顺序呈显著递减趋势(P<0.01),且各组间差异明显(P<0.01)。结论:T2DM患者T细胞亚群失衡,其中合并肾病患者表达失衡更为严重,提示糖尿病肾病患者存在自身免疫调节异常。同时T2DM合并肾病患者外周血CD28和CTLA4表达也显著异于正常对照,提示共刺激分子可能参与了T2DM合并肾病的免疫功能紊乱。     

Rational Development of LEA29Y (belatacept), a High-Affinity Variant of CTLA4-Ig with Potent Immunosuppressive Properties

Current success in organ transplantation is dependent upon the use of calcineurin-inhibitor-based immunosuppressive regimens. Unfortunately, current immunotherapy targets molecules with ubiquitous expression resulting in devastating non-immune side effects. T-cell costimulation has been identified as a new potential immunosuppressive target. The best characterized pathway includes CD28, its homologue CTLA4 and their ligands CD80 and CD86. While an immunoglobulin fusion protein construct of CTLA4 suppressed rejection in rodents, it lacked efficacy in primate transplant models. In an attempt to increase the biologic potency of the parent molecule a novel, modified version of CTLA4-Ig, LEA29Y (belatacept), was constructed. Two amino acid substitutions (L104E and A29Y) gave rise to slower dissociation rates for both CD86 and CD80. The increased avidity resulted in a 10-fold increase in potency in vitro and significant prolongation of renal allograft survival in a pre-clinical primate model. The use of immunoselective biologics may provide effective maintenance immunosuppression while avoiding the collateral toxicities associated with conventional immunsuppressants.     

CD40/CD40L和B7-1/CD28在小鼠叶酸性肾病中的作用

目的研究CD40／CD40L、B7—1／CD28在肾小管间质浸润的免疫活性细胞、损伤的肾组织固有细胞上的表达以及其可能的作用。方法一次性腹腔注射叶酸制作CD1小时鼠叶酸性肾病模型。在第1、2、3、7、14、21天分别处死动物，取其右肾进行免疫组织化学染色；取左肾提取蛋白进行蛋白印迹分析；采血检测BUN、Scr。以抗B7—1功能性单克隆抗体（B7-1mAb）联合叶酸应用，观察21d后，采血行BUN、Scr检测，病理图像分析肾病变区域及保护率。结果小鼠在给予叶酸后第1天，CD40、B7-1在肾小管上皮表达上调，并持续至第21天。通过蛋白印迹半定量检测，CD40在各时间点实验组肾组织表达量均增加5倍以上（P均〈0．01），在间质区域浸润的免疫活性细胞上可见CD28和CD40L的表达。经B7-lmAb干预性治疗，小鼠死亡率从47．83％下降到11．01％。P〈0．01；BUN、Scr水平明显降低；肾组织保护率从7．45％上升至66．51％。结论在小鼠叶酸性肾病中．肾组织CD40／CD40L和B7-1／CD28的表达上调并参与了肾小管上皮细胞损伤、免疫活性细胞浸润和肾小管间质纤维化的过程。B7-1mAb干预治疗能减轻上述的肾损害，为肾间质纤维化的特异性免疫治疗提供新的途径。     

重症急性胰腺炎大鼠早期肠源性内毒素血症对Th1/Th2平衡的影响

目的：探讨肠源性内毒素血症对重症急性胰腺炎大鼠机体免疫功能的影响.方法：将Wistar大鼠（260±20）g40只,随机分为假手术组（n=8）和重症急性胰腺炎模型组（n=32）,后者又分为3 h、12 h、24 h和36 h组,每组8只,观察血浆内毒素和血清淀粉酶及Th1/Th2比值的变化.结果：血浆内毒素水平的升高,使促炎细胞因子过度释放,Th1/Th2比值持续升高（P＜0.01）.血浆内毒素和Th1/Th2比值呈显著正相关（P＜0.01）.结论：在重症急性胰腺炎的早期,血浆内毒素的升高使机体的细胞免疫功能过强,导致组织细胞损伤加重.