电穿孔法高效转染COS-7成纤维细胞系

目的　以电穿孔法转染COS 7细胞系以得到较高的转染率。方法　以CMV/LacZ质粒转化COS 7细胞系 ,48小时后用X gal染色。观察不同的穿孔电压 (6 0 0V ,5 5 0V ,5 0 0V ,45 0V ,40 0V)、时间常数 (40us、10 0us)、操作温度 (室温 ,4℃ )、质粒浓度 (5us/ml,2 5us/ml)和细胞悬液体积 (2 0 0ul、40 0ul)对转染率的影响。结果　利用Eppendorf公司的Multiporator及低渗透压缓冲液转化COS 7细胞的最优条件是 :转化体积 40 0 μl,细胞密度 2× 10 6cells/ml,场强 2 0 0 0V/cm ,时间常数 10 0us,室温质粒浓度2 5 μg/ml。条件优化后COS 7转染率可达 85 %。 结论　优化的电穿孔法可得到较高的COS 7转染率。     

影响外源DNA导入哺乳动物细胞有关因素的研究

本文采用磷酸钙-DNA共沉淀转化法将多种重组质粒导入Hela细胞，并对影响其转化效率的有关因素进行了观察，建立了适合本实验室的标准化转染方法。结果表明：1)待转化的细胞应为单层约稀疏的对效生长期细胞；2)重组质粒DNA的浓度为8～10μg/100ml培养瓶；3)磷酸钙-DNA共沉物与持转化的细胞共孵育时间为10h；4)G418是在转染后24h加入，浓度为200μg/ml，为最佳转化条件。本研究采用该方法将质粒pcDNA3，pcDNA3-MSP119，pcDNA3-SjESG，pcDNA3-CSP，pcDNA3-MSP1，pcDNA3-MSP2和pcDNA3-Pfs48/45导入哺乳动物细胞HaLa细胞均获得满意结果。每微壳DNA的平均克隆数高达9．6。重组质粒DNA导入哺乳动物细胞方法的标准化为外源基因在哺乳动物细胞中的高效表达创造有利条件。     

用精子作为载体制做转基因小鼠

近几年发展起来的制做转基因小鼠的方法主要有:用微注射的方法直接将外源DNA注入受精卵的原核,用反转录病毒载体感染分裂球细胞以及将转染外源DNA的胚胎干细胞注入胚胎。最近,几位意大利科学家报道了一种新方法,即用精子作为为载体,通过受精过程将外源基因转入受精卵。在小鼠精子浓度为1～2×10~6/ml的精液中加入质粒     

密度梯度离心后精子悬液中弹性硬蛋白酶浓度和精子DNA完整性的测定

目的检测体外授精过程中精液和经密度梯度离心后精子悬液中弹性硬蛋白酶(PMN-Elastase)的浓度与精子DNA的完整性,探讨密度梯度离心对精浆中PMN-Elastase的作用和精子DNA的损伤情况。方法选择我中心64例进入体外受精周期患者,其中根据女方取卵手术当天男方精液检测PMN—Elastase不同浓度将患者分为A组(15例):含量1000ng/ml(显性感染);B组(20例):含量290-1000ng/ml(隐性感染);C组(20):含量290ng/ml(正常水平),分析和比较处理前后三组精子悬液中PMN-Elastase的浓度和DNA完整率。结果三组处理后的精子悬液中A组PMN-Elastase前后浓度没有明显区别(P0.05),B组和C组浓度明显下降(P0.05);三组处理后的DNA完整率均明显提高(P0.05),经过长时间孵育均明显降低(P0.05)。结论高浓度PMN-Elastase的精液经密度梯度离心后的精子悬液中PMN-Elastase浓度并不增加,精子活力和DNA完整率增加,可能不影响受精结局。     

胎儿胸腺细胞对OKT3反应性的研究

<正>OKT3对成熟T细胞有很强的促增殖作用,其对T细胞作用有赖于CD3分子的存在.据报道17周龄后胎儿胸腺细胞(FT)中CD3~+细胞已达60%以上,但关于FT对OKT3的反应性少有报道,本文对此进行了研究,旨在进一步了解FT的功能特性.1 材料和方法1.1 FT和胎儿脾单个核细胞(FSMC)制备 取18～28周龄胎儿胸腺,经200目铜同研磨,Hanks液洗涤后,用含10%小牛血清的1640培液制成FT悬液;胎脾制成单细胞悬液后,经淋巴细胞分离液分出FSMC,洗涤,制成FSMC悬液.1.2 细胞增殖测定 采用~3H-TdRn掺入法.FT和FSMC培养浓度为1×10~6/ml;OKT3(北医大提供小鼠腹水)和IL-2(中科院上海生化所产品)最终浓度分别为10~(-4)稀释和10U/ml;设立OKT3单独和OKT3+IL-2联合刺激两种培养条件,并设相应对照,每组为3个复孔.1.3 免疫荧光技术和流式细胞仪分析 采用间接免疫荧光染色法.抗CD25单抗和FITC标记的羊抗鼠IgG均为DAKO产品.用FACS420进行表型分析.2 结果     

山莨菪碱(654-2)等对肥大细胞中组胺释放的影响

肥大细胞是富含组胺的细胞,是开展组胺释放研究的理想细胞。我们选用体重为200-300克大白鼠,经腹腔注入Hank′s液,收集肥大细胞。并制成1～2×10~5个细胞/ml的细胞悬液备用。以荧光法测定组胺含量,以1ml细胞悬液中组胺释放总量/1ml细胞悬液中组胺总量×100％表示     

克拉霉素对中国仓鼠成纤维细胞(CHL)染色体畸变试验

中国仓鼠肺成纤维细胞(CHL)2×10~5/5ml,加入克拉霉素,终浓度为400、200、100、50、25、12.5和6.25ug/ml,混匀后37℃培养48小时,制成细胞悬液,用血球计数板计数,测得克拉霉素IC_(50)为91.3μg/ml。     

人腮腺细胞分离培养的初步观察

目的从人体腮腺组织分离培养获得具有体外增殖能力的涎腺细胞。方法取成人腮腺良性肿物切除的腮腺组织,将组织块在无菌条件下剪出小腺叶,剪成1 mm2大小碎块。用质量浓度10％的Ⅰ型胶原酶10 ml消化20 min,用质量浓度0．25％胰蛋白酶10 ml消化15 min。收集2次消化细胞悬液,离心获得细胞沉淀。以15 ml含用质量浓度10％胎牛血清、2 mmol／L L-谷胺酰胺、100μg／ml链霉素、100 U／ml青霉素、5μg／ml人胰岛素、5μg／ml氢化考的松、2μg／ml异丙肾上腺素的DMEM和F12培养基各占50％的培养液重悬细胞沉淀,计数细胞总量为2．5×105。在预先铺被鼠尾胶原的6孔板的3个孔中,每孔播种细胞悬液5 ml。培养板置37℃、体积分数5％CO2,饱和湿度条件培养箱中培养。     

质粒型HSV载体介导的GDNF及GFP基因在体外培养的脊髓神经元中的表达

胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)不仅特异地作用于中脑多巴胺能神经元,而且对脊髓运动神经元也具有较强的营养和支持作用。由于血脑屏障的存在,中枢神经系统损伤后,常规的给药途径很难使GDNF到达损伤部位,达到有效浓度,发挥治疗作用。为了进一步探索治疗中枢神经损伤的新途径,本实验以质粒型单纯疱疹病毒(HSV)为载体,分别构建了含有GDNF和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组载体HSV-GDNF和HSV-GFP,将病毒悬液分别以3×106ip/ml和6×105ip/ml感染体外培养的金黄地鼠肾细胞(BHK)及E14天Wistar大鼠原代脊髓神经元。病毒悬液吸附两小时…     

盐酸利多卡因体外对长时间禁欲的精子运动参数的影响

目的探讨盐酸利多卡因体外对人精子运动参数的影响。方法10例健康生育男性，禁欲1个月手淫获取精液，与不同浓度的盐酸利多卡因体外孵育10min，用HTF液洗涤后重悬。采用计算机辅助的精液分析系统（computer assisted semen analysis，CASA）分别检测孵育后和洗涤重悬后的精子运动参数。结果低浓度的盐酸利多卡因对精子运动参数没有明显地影响（P＞0．05），但浓度达到15mg／ml时精子的运动参数显著降低（P＜0．05）。结论高浓度盐酸利多卡因能明显地抑制人精子的运动。     

甲氧滴滴涕对大鼠精子顶体反应的影响

目的:探讨甲氧滴滴涕(methoxychlor,MXC)对雄性大鼠精子顶体反应的影响。方法:在体外培养的精子悬液中加入不同浓度的MXC和孕酮处理,通过精子考马斯亮蓝染色,镜检计数顶体反应型精子的百分率。结果:与空白组比较,单纯经MXC处理组的顶体反应型精子百分率明显增加,另加孕酮的各处理组顶体反应型精子的百分率增加尤为明显,MXC终浓度≤6.25μg/ml的处理组顶体反应型精子百分率不增加。结论:MXC可促进大鼠精子发生顶体反应且与其剂量有关,当MXC终浓度≤6.25μg/ml不诱发顶体反应。MXC能加强孕酮诱发精子顶体反应的作用。     

利用普通冰箱冻存肿瘤细胞的技术研究

<正> 利用普通冰箱-18℃冷冻保存组织、细胞,迄今少见报道.本实验以人肝癌细胞株Bel_(7402)为对象,探讨-18℃冷冻保存方法.1材料与方法1.1 细胞来源及培养方法人肝癌细胞株Bel_(7402)引自中山医科大学实验动物中心,置于含100mL/L新生牛血清的RPMI1640培养液中,在37℃,50mL/LCO_2,饱湿条件下传代培养,细胞贴壁生长.1.2 试剂DMSO(AR)由北京化工厂生产;新生牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所生产;RPMI 1640由Life Technologies Ins生产;胰蛋白酶(AR)由新疆化学研究所生产.1.3 冻存方法处于对数生长期的细胞经D-Hank’s液洗2次,后用0.25%胰蛋白酶消化,再用含100mL/L新生牛血清的1640液洗涤1次.后分别用含5%、10%、15%、20%DMSO的完全培养基(含100mL/L新生牛血清1640)重新制成细胞悬液.细胞浓度保持在1×10~6/mL左右.将细胞悬液置于2mL的硬塑料冻存管中,加盖密封,做好标记.直接迅速地放入-18℃冰箱中冻存.每份样品分装4支冻存管,每管装1mL悬液.于1周,1个月,2个月,3个月后分别进行融冻.     

大鼠白介素10真核表达质粒在大鼠体内外肝细胞中的表达及影响

目的 探讨体外重组的大鼠白介素10(rIL-10)真核表达质粒能否在大鼠体内外肝细胞中表达及表达产物对肝细胞的影响.方法 通过受体介导的脂介体转染法及尾静脉大容量注射法将rIL-10真核表达质粒分别转入大鼠BRL细胞及体内大鼠肝细胞中,采用RT-PCR法、ELISA法和免疫组织化学法检测体内外肝细胞rIL-10的表达情况,MTT法及流式细胞术检测rIL-10真核表达质粒转染对BRL细胞增殖与凋亡的影响.结果 转染rIL-10真核表达质粒的BRL细胞及大鼠肝组织高表达rIL-10基因,BRL细胞培养上清与大鼠血清中rIL-10浓度分别为(12.78±0.94)ng/ml,(61.68±3.60)ng/ml.MTT法及流式细胞术显示rIL-10的表达对肝细胞有一定的保护作用.结论 rIL-10真核表达质粒可在大鼠体内外肝细胞中表达并对肝细胞有一定的保护作用.     

不同浓度不同粒径的纳米钴对小鼠成纤维细胞的遗传毒性的研究

目的探讨不同粒径、不同浓度的纳米钴对鼠成纤维细胞的遗传毒性效应。方法分别用含有1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml浓度的30nm、50nm和100nm的钴悬液处理培养的鼠成纤维细Balb/c3T3,24h后,采用单细胞凝胶电泳实验方法检测DNA损伤,评价遗传毒性效应。结果与对照组比较,30nm、50nm和100nm的钴颗粒,当浓度大于1μg/ml时均可对细胞产生遗传毒性效应,差异及显著(P0.01),且随着浓度的增加毒性作用增强。结论纳米钴对小鼠成纤维细胞具有遗传毒性作用,且遗传毒性与纳米钴浓度呈剂量依赖效应。     

心肌缺血再灌注β-受体改变实验研究

本研究采用~3H-DHA放射配体结合分析法观察了8只实验猫,结扎左冠状动脉前降支25分钟后再灌注缺血区和非缺血区心肌β-受体改变。β-受体测定方法:心肌组织剪碎后在20mMTris-HCl缓冲液(含0.9%NaCl、pH7.5)中匀浆,低速离心,上清高速冷冻离心2次(20,000g,10min,4℃以下),制备粗制心肌细胞膜,Lowry氏法蛋白定量,将蛋白浓度调制为3mg/ml。取膜悬液100μl,分别加至~3H-DHA(美国Dupont     

培养板法体外诱生抗体

<正> 现有多种体内外诱生抗体的方法,本文对国外晚近采用的培养板法诱生抗体作一简要介绍。 材料和方法 一、常规法制备SRBC悬液,并用Earle's液配成1×10~8细胞/ml。二、用无糖Hanks液常规     

人睾丸组织中成熟精子的分离方法初探

探索简单、适用的体外分离睾丸组织中成熟精子的方法,以用于男性无精子症病人行卵母细胞内单精子注射受精-胚胎移植为目的。用含不同浓度透明质酸酶的10 %人血白蛋白人类输卵管液培养人睾丸曲细精管组织匀浆2 4 h,再用Percoll梯度离心法洗涤后计算所获各级精子的总数,并设置前后对照和空白对照进行比较。用不同浓度透明质酸酶处理后的4个实验组分别与2个对照组比较,实验组所获得的各级精子的总数高于对照组,有显著差异(P<0 .0 1)。实验组中透明质酸酶浓度分别为5 0、10 0、15 0 u/ ml的10 %人血白蛋白人类输卵管液处理组获得的各级精子总数组间比较,处理前对照和处理后空白对照之间比较,无显著差异(P>0 .0 5 )。而用浓度为2 0 0 u/ ml的10 %人血白蛋白人类输卵管液处理组获得的各级精子的总数与其它浓度处理组之间比较存在统计学差异(P<0 .0 1) ,其所获得的各级精子总数相似,但活动能力较其它浓度处理组低。透明质酸酶结合Percoll梯度离心可从人睾丸曲细精管组织匀浆中分离出较多更纯的成熟精子,但过高浓度的透明质酸酶可能会影响分离出的精子的活动能力。     

孕酮对正常生育男性精子头部胞浆内游离钙离子浓度（[Ca^2＋]i）的影响

目的：定量分析生育男性获能后单个精子的[Ca^2 ]i基础水平以及10μM孕酮刺激后的[Ca^2 ]i动态改变。方法：生育健康男子10例，手淫法留取精液。精液液化后，应用上游技术分离活动良好的精子，之后将精子悬液置于3‘70C培养2h使之获能。获能后精子移人Petri培养皿，每皿加入终浓度为8．85μmoL／L的钙荧光探针Fluo-3／AM，370C避光孵育40min。     

机械法与机械-酶消化法制备大鼠膈肌组织单细胞悬液的比较

文题释义： 流式细胞分析技术：简称流式细胞术,是20世纪70年代初发展起来的一种在功能水平上可以对单个细胞或其他生物离子进行快速定量的一项新型分析技术和分选技术。它能够在短时间内高速分析上万个细胞,可以同时测量如细胞或粒子的体积、内部结构以及膜电位变化等生物或化学性质,进行多信息分析,具有快速、高灵敏、准确、多参数等特点。 单细胞悬液：是进行细胞体外培养和流式细胞分析的基础,即将组织分散成单个游离细胞,使其悬浮在液体培养基中,当然如外周血及骨髓标本等本身即为天然的单细胞悬液,这些细胞经过简单处理,就可以应用于流式分析、细胞分选、细胞培养等实验。如果2个或多个细胞粘连在一起或细胞碎片过多都将影响流式分析结果,进而导致实验失败。 背景：流式细胞术作为目前先进的细胞分析技术,其研究基础是单细胞悬液,但目前尚无有关膈肌组织单细胞悬液制备方法的相关报道。 目的：探索应用机械法与机械-酶消化法分别制备大鼠膈肌单细胞悬液的可行性并比较2种方法获得单细胞的数量和活性。 方法：以SD大鼠的新鲜膈肌组织为标本,在机械法的基础上,选用胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ及其不同组合进行消化制备膈肌单细胞悬液,观察细胞形态并经锥虫蓝染色后测定细胞活性,对活细胞、失活细胞和细胞团块进行计数并计算出细胞存活率和单细胞悬液浓度,结果进行统计学比较分析。 结果与结论：①机械-酶消化法所制得的单细胞悬液较机械研磨法细胞分散度好、形态完整、边界清楚、杂质及细胞碎片较少、背景较干净;②单纯机械研磨法制备的单细胞悬液活细胞数较低,失活细胞数较高,细胞存活率最低,团块较多;③在机械法的基础上,加入胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ3种等体积混合酶所得单细胞悬液的活细胞数及悬液浓度最高,每0.1 g膈肌组织可获得(1.0-2.0)×10⁶个细胞,细胞存活率较高,与单纯机械法获得单细胞悬液比较,在活细胞、失活细胞、细胞团块、细胞存活率及悬液浓度方面差异均有显著性意义(P < 0.05);其次是加入胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ这2种等体积混合酶消化法,所得单细胞悬液浓度、细胞成活率及细胞团块方面也均较为理想;④结果表明,机械法和机械-酶消化法均能成功制备出大鼠膈肌单细胞悬液,机械-酶消化法优于单纯机械法,其中加入胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ3种等体积混合酶的机械-酶消化法所得单细胞悬液效果最佳,是较优选的膈肌单细胞悬液制作方法。 ORCID: 0000-0002-4486-5917(张远圆) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

文摘

012 应用电穿孔法将考斯质粒DNA导人细菌细胞[英]/Kubicka P…//TIG.-1994,10(1).-5 本文报道一种应用电穿孔法将考斯质粒DNA导入细菌中的新技术。目前,应用电穿孔法替代已商品化的噬菌体包装DNA使转化过程更加迅速并可降低实验费用。特别对单一考斯克隆重复进行研究时非常实用。如对一些大基因进行表达构建时,这些优点就十分明显。然而,对比电穿孔与噬菌体包装DNA转化方法,它的一个主要限制因素是难以应用于全长构建基因。可见,尽管在考斯质粒大小可选择的情况下此