人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的探讨人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性.方法制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性.结果VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性.结论VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF.     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子(VECF)基因修饰的免骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法 制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VFGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VECF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性。结论 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及与活性测定

目的：探讨人血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法：制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞，收获转染后24h至6d的转染上清和细胞，采用RT－PCR技术，免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达，用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果：VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165，其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖，具有很强的生物活性。结论：VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

骨保护素基因修饰的大鼠骨髓基质细胞系的培养与鉴定

目的培养经骨保护素OPG修饰的大鼠骨髓基质细胞系并检测其表达能力,鉴定表达产物,为基因工程技术治疗牙周病提供物质基础。方法利用已构建的pSecTagOPG真核分泌表达穿梭载体,用脂质体法将目的基因转染至大鼠骨髓基质细胞,应用免疫组织化学和Westernblot方法证实转染的细胞表达骨保护素。结果经免疫组织化学和Westernblot方法检测,在转染OPG的大鼠骨髓基质细胞中有OPG表达。结论本实验成功培养出分泌表达OPG的大鼠骨髓基质细胞系。     

bFGF真核表达质粒的构建及骨髓基质细胞转染

目的 探讨bFGF基因转染骨髓基质干细胞的方法 及可行性.方法 构建bFGF基因真核表达质粒,用脂质体法介导转染骨髓基质细胞,通过形态学观察、免疫组化、ELISA法、及RT-PCR方法 检测bFGF基因转染骨髓基质干细胞的成功性,以及转染后骨髓基质干细胞的生物学特性.结果 bFGF基因成功转染骨髓基质干细胞,并能持续稳定的分泌bFGF蛋白,可诱导骨髓基质干细胞向成软骨方向分化.结论 bFGF基因可以转染骨髓基质干细胞,并能诱导骨髓基质干细胞向成软骨方向分化.     

脂质体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的脂质体介导IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞（MSCS），并研究对MSCS成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法以密度梯度离心结合全骨髓培养法获得纯化骨髓间充质干细胞（MSCs），经流式细胞仪检测，细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，但是CD14和CD45表达阴性。采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3．1-IGF-1转染MSCs，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达行Western blot检测。结果获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞（MSCs）；脂质体为介导将全长兔IGF-1目的基因导入MSCs，Western blot鉴定转染成功，转染后的MSCs较未转染MSCs成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

PINCH-1基因RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建人PINCH-1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并转染人骨髓基质细胞初鉴定转染效果.方法 利用RNAi设计软件,设计合成针对人PINCH-1基因的特异性siRNA序列,利用酶切反应合成包含特异性shRNA序列的pGCSIL-GFP慢病毒载体GC-shBC047440,通过GC-shBC047440与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装293FT细胞产毒,并利用GFP蛋白表达水平进行滴度测定.获取的病毒上清筛选最适感染复数(MOI值),并感染骨髓基质细胞,RT-PCR和Western blot检测重组慢病毒对骨髓基质细胞PINCH-1蛋白和RNA表达的影响.结果 酶切鉴定证实成功构建针对人PINCH-1基因的RNAi慢病毒干扰载体GC-shBC047440,载体感染人骨髓基质细胞后PINCH-1 RNA表达较未感染组和空载体对照组显著下降.结论 成功构建针对人PINCH-1基因的RNAi慢病毒载体,该载体能有效沉默PINCH-1基因的表达.     

人碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的: 构建研究人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体,并在体外进行表达和检测.方法: 从骨髓基质干细胞中分离总RNA,进行RT-PCR 获得人bFGF cDNA.测序证实其结果正确后,构建真核表达载体.并经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定.利用Blast程序,搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1-bFGF)中编码bFGF基因同源的序列.通过脂质体将重组质粒转染入骨髓基质干细胞,使用间接免疫荧光法进行表达产物检测.结果: 经EcoRⅠ/Pst BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证实,人bFGF基因成功地克隆到真核表达载体pVAX1中;pVAX1- bFGF中编码bFGF的序列与GenBank中所报道的bFGF编码序列完全一致;间接免疫荧光结果显示转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光.结论: 成功地构建了人bFGF真核表达载体,其可以在体外进行表达.     

人骨形态发生蛋白-2腺病毒表达载体转染人骨髓基质干细胞及对其增殖的影响

目的 :用人骨形态发生蛋白 - 2腺病毒表达载体 ( Ad- BMP- 2 )转染人骨髓基质干细胞( h BMSC) ,以探讨基因转染对 h BMSC增殖的影响。方法 :将 Ad- BMP- 2转染体外培养的成人骨髓基质干细胞 ,利用免疫组化、原位杂交染色方法检测细胞内骨形态发生蛋白 - 2 ( BMP- 2 )的表达 ,蛋白印迹法检测转染后细胞培养液中 BMP- 2分泌蛋白表达。然后通过流式细胞仪分析其对细胞增殖的影响。结果 :转染后 ,h BMP- 2基因在 m RNA水平和蛋白水平均有表达。蛋白印迹法检测到培养液中有 BMP- 2蛋白阳性表达。转染 h BMP- 2基因后 ,细胞经流式细胞仪分析 ,S期细胞比例增多 ,说明细胞 DNA的合成增加。结论 :Ad- BMP- 2可高效转染 h BMSC,且促进细胞增殖     

绿色荧光蛋白与鼠盘状结构域受体2融合基因的构建与表达

目的: 构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒DDR2/pEGFP-N3 并分析该融合基因在活细胞中的表达.方法: 利用反转录PCR扩增鼠盘状结构域受体2(DDR2)cDNA,并重组于pEGFP-N3载体.脂质体体外瞬时转染培养的COS-7细胞,RT-PCR和Western Blot分析该融合基因的表达.结果: 从NIH3T3细胞中克隆到DDR2基因的cDNA,并成功构建DDR2-EGFP融合表达载体.以该质粒转染细胞48 h后,RT-PCR和Western Blot分析表明该融合基因能够在COS-7细胞中正确表达.结论: DDR2/pEGFP-N3融合基因真核表达载体构建成功.该融合蛋白具有DDR2和EGFP双重特性,为进一步研究DDR2的功能提供了工具.     

腺病毒载体介导PDX1在人脐带间充质干细胞中的表达

目的构建含胰十二指肠同源框-1基因（pancreatic and duodenal homeobox factor 1,PDX1）的重组腺病毒载体,并检测其在人脐带间充质干细胞（human umblic cord msenchymal stem cells,HUCM—SCs）的表达情况。方法用BglII／XhoI酶从pUC57-PDX1酶切PDX1,连接到pShuttle—GFP—CMV重组穿梭载体,得到pShutde—GFP—CMV—PDX1重组穿梭质粒,再将pShuttle—GFP—CMV—PDX1转移到pAdxsi载体上,得到pAdxsi—GFP—PDX1病毒质粒,利用脂质体介导重组腺病毒载体转染293细胞,包装出完整的腺病毒。用重组腺病毒感染HUCMSCs 24h后,经荧光显微镜、RT-PCR、免疫荧光、免疫细胞化学、Western Blot等检测PDX1基因及蛋白的表达。结果通过测序、酶切等鉴定PDX1基因正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒重组,重组腺病毒可高效转染HUCMSCs,RT—PCR检测到PDX1 mRNA在HUCMSCs中表达,经免疫荧光、免疫细胞化学、Western Blot等证实转染PDX1在HUCMSCs胞核中表达。结论成功构建了PDX1腺病毒载体,并在HUCMSCs中有效表达。     

表达人血管内皮生长因子和血管生成素1的CHO细胞株的建立

目的：克隆人血管内皮生长因子(VEGFm)和血管生成素1(Ang1)基因，建立可分别表达VEGFm和Ang1的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)株。方法：用PCR技术，分别从人心脏cDNA库中扩增VEGF165和Ang1 cDNA，并定向克隆人真核表达载体pSecTag2B中。用Lipofectamine2000将重组质粒转化入CHO细胞中，用Zeocin筛选并维持已转化重组质粒的CHO细胞株。在大肠杆菌DH10B中扩增转化入CHO细胞中的重组质粒，行DNA测序鉴定。用Westem-blot鉴定CHO细胞中重组VEGFm和Ang1的表达。结果：从人心脏cDNA库中扩增出VEGFⅢ和Ang1 cDNA片段，酶切和测序结果显示，已正确构建重组质粒pSecTag-VEGF165和pSecTag-Ang1。用Zeocin筛选到候选的CHO细胞株，DNA测序结果表明，pSecTag-VEGF165和pSecTag-Ang1已分别成功转化入CHO细胞中。Western-blot结果显示，在CHO细胞中表达出可被VEGF和Ang1单抗识别的特异蛋白。结论：克隆了VEGFm和Ang1基因，并建立了表达VEGF165和Ang1的CHO细胞株。     

Gene Cloning of Murine α-Fetoprotein Gene and Construction of Its Eukaryotic Expression Vector and Expression in CHO Cells

Hepatocellularcarcinoma (HCC)isamajorcauseofcancerdeathwithmorethan 1.2millionglobalan nualincidences[1] .Surgeryandlivertransplantationaretheonlyeffectivetreatments ,butmostHCCpa tientsarenoteligiblebecauseofdiagnosisatalaterstageorunderliverinsufficiencyinthesettingofcir rhosis[2 5] .Thedevelopmentofnoveltreatmentstrategiesisneeded .TheAFPisanHCC associatedoncofetalantigen .ThemajorityofhumanHCCsoverexpresstheoncofetalantigenAFP .ThisMr 700 0 0 glycoprotein ,producedathighlevelsbyth…     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆、表达及生物活性分析

采用RT PCR方法 ,从人扁桃体组织中扩增得到人胰岛素样生长因子 1 (IGF 1 )cDNA ,利用基因重组技术将该基因片段重组于pcDNA3 .1 ( +)真核表达载体上 ,成功构建了 pcDNA/I重组表达载体。应用脂质体介导的基因转移技术将重组质粒体外转染至人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。MTT法检测结果表明 :重组质粒转染能明显促进内皮细胞的分裂增生。将重组质粒通过脂质体介导 ,体外转染至人肾细胞 2 93细胞系进行表达 ,经G41 8筛选获得稳定表达的重组质粒细胞克隆 ,表达产物经鸡胚绒毛尿囊膜试验表明有促血管生成活性。此结果为研究IGF 1对血管内皮细胞作用的分子机制 ,以及利用IGF 1基因治疗肢体及冠状动脉缺血性疾病等的研究奠定了实验基础。     

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因融合表达蛋白对肝癌细胞胰岛素样生长因子1受体表达的影响

目的 建立HBV X-HCV C融合蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞胰岛素样生长因子-1的影响.方法 双酶切质粒pXT1 -X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达.流式细胞仪、蛋白印迹检测IGF-1受体蛋白表达.结果 质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达.表达融合蛋白的细胞的胰岛素样生长因子-1受体活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X、HCV C蛋白的细胞明显升高.结论 HBV X-HCV C融合蛋白能显著上调胰岛素样生长因子-1受体活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用.     

人肿瘤MUC1/Y基因真核表达载体的构建及在BIU-87细胞中的表达

目的:克隆人肿瘤MUC1/Y全长基因及构建真核表达载体 pEGFP MUC1/Y并观察 pEGFP MUC1/Y在 BIU 87细胞中表达以用于进一步生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究。方法: 取新鲜膀胱肿瘤组织提取总RNA,采用随机引物进行反转录,将特异引物扩增的MUC1/Y全长 PCR产物克隆至真核表达载体 pEGFP C1,测序鉴定后命名为 pEGFP MUC1/Y,用脂质体转染膀胱肿瘤细胞BIU 87,以 Western Blot检测其表达情况。结果:酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含人MUC1/Y全长cDNA编码序列, Western Blot检测和转染实验,表明构建的 pEGFP MUC1/Y基因在BIU 87真核细胞中表达,其绿色荧光蛋白瞬时表达率为 20%。结论:人肿瘤 MUC1/Y全长cDNA基因克隆及其真核表达载体 pEGFP MUC1/Y 构建成功,可用于肿瘤生物学治疗的研究。     

Gene cloning of murine α-fetoprotein gene and construction of its eukaryotic expression vector and expression in CHO cells

Summary To clone the murine α-fetoprotein (AFP) gene, construct the eukaryotic expression vector of AFP and express in CHO cells, total RNA were extracted from Hepa 1–6 cells, and then the murine α-fetoprotein gene was amplified by RT-PCR and cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3. 1. The recombinant of vector was identified by restriction enzyme analysis and sequencing. After transient transfection of CHO cells with the vector, Western blotting was used to detect the expression of AFP. It is concluded that the 1.8 kb murine α-fetoprotein gene was successfully cloned and its eukaryotic expression vector was successfully constructed. YI Jilin, male, born in 1953, Professor     

IGF-1对精原细胞MAPK途径信号转导的影响

目的：研究胰岛素样生长因子1（IGF-1）对大鼠精原细胞MAPK途径分子Erk1和2磷酸化的影响作用．方法：分离并培养大鼠精原细胞,采用不同浓度的IGF-1刺激培养的精原细胞．采用Western Blot方法检测Erk1／2分子的磷酸化．结果：成功获得体外培养的精原细胞,IGF-1刺激后精原细胞Erk1／2分子的磷酸化水平显著增强．IGF-1浓度与Erk1／2磷酸化水平呈正相关关系．结论：IGF-1增强Erk1／2分子的磷酸化水平可能是IGF-1促进精原细胞增殖和提高大鼠生精能力的重要分子机制．