人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。     

人胰岛素样生长因子-1真核表达载体的构建及在神经干细胞中的表达

目的:构建人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)真核表达载体,并在人脐血神经干细胞(NSCs)中表达。方法:采用RT-PCR法从人胎肝中克隆IGF-1基因,将其导入真核表达载体pcDNA3.1中,用脂质体转染法将重组质粒转染人脐血NSCs。分别采用RT-PCR和免疫荧光细胞化学法检测转基因NSCs中IGF-1mRNA和蛋白的表达。结果:琼脂糖电泳显示RT-PCR扩增出462bp的条带;重组载体pcDNA3.1-IGF-1经HindⅢ与BamHⅠ双酶切后,得到5428bp和462bp的两个条带;目的基因转染的NSCs经RT-PCR扩增出一条与目的基因一致的条带;免疫荧光细胞化学检测到IGF-1蛋白的表达。结论:成功构建了人IGF-1基因的真核表达载体,转染后IGF-1重组蛋白在人脐血NSCs中能成功表达。     

人胰岛素样生长因子-1稳定表达细胞株的构建及鉴定

目的 :建立稳定表达人胰岛素样生长因子 - 1 ( h IGF- 1 )的细胞株。方法 :用脂质体转染法将含有 h IGF- 1 c DNA的真核表达载体转染 BHK细胞 ,经 G41 8筛选 ,形成阳性细胞克隆。继续培养4周 ,进行原位杂交和免疫细胞化学检测。结果 :原位杂交检测在转染细胞的胞浆中有棕黄色颗粒样阳性杂交信号 ;免疫细胞化学检测在转染细胞的胞浆中有氯化镍蓝色阳性信号。结论 :G41 8筛选后所获得的阳性细胞克隆 ,继续培养 4周 ,原位杂交和免疫细胞化学检测表明 h IGF- 1基因得到稳定表达     

胰岛素样生长因子-1逆转录病毒表达载体的构建及其在大鼠胚胎神经干细胞中的表达

目的:构建胰岛素样生长因子-1(IGF-1)逆转录病毒表达载体,并观察转IGF-1基因的鼠胚胎神经干细胞(NSC)体内外基因表达情况.方法:通过酶切和连接的方法将IGF-1基因克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN中,感染包装细胞后收集病毒颗粒再感染从胎龄14 d的SD大鼠全脑组织中分离出的NSC,RT-PCR检测IGF-1的mRNA,免疫组织化学法检测IGF-1蛋白的表达,并用立体定向法将Brdu标记的转基因NSC移植到大鼠大脑中动脉梗死模型的纹状体缺血半暗区,免疫染色观察移植后1周转基因NSC在脑内的基因表达情况.结果:酶切及序列分析证实重组逆转录病毒载体pLXSN-IGF-1构建正确,RT-PCR能检测到转基因IGF-1的mRNA,免疫组织化学法能检测到IGF-1在转染了逆转录病毒的NSC及其子代细胞内表达,转基因NSC移植后1周在宿主脑内迁徙并表达IGF-1基因产物.结论:成功构建了携带IGF-1基因的逆转录病毒载体,转染了重组逆转录病毒载体的NSC可在体内外表达IGF-1.     

脂质体介导转化生长因子-β1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的 脂质体介导TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞(MSC)，研究对MSC成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法 以梯度离心结合换液法获得并纯化骨髓间充质干细胞(MSCs)，采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3-TGF-β1转染MSCs，Rr-PCR和Western blot鉴定后，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原(ColⅡ)、纤维连接蛋白(FIN)的表达行RT-PCR和Western blot检测。结果 获得纯度较高的成年中国小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)；脂质体为介导将全长人TGF-β1目的基因导入MSC，经RT-PCR和Western blot鉴定转染成功，转染后的MSC较未转染MSC成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、FNmRNA和蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

人骨形成蛋白7基因的克隆及其在兔骨髓基质干细胞中的瞬时表达

目的克隆人骨形成蛋白7(BMP-7基因,并构建其真核表达载体,观察其在兔骨髓基质干细胞(rBMSC)中的表达并探讨其应用于骨科局部基因治疗的可能性.方法用RT-PCR法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序.将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体pShuttle中构建表达载体pShuttle-BMP-7,经鉴定后利用LipofectAMINE2000瞬时转染rBMSC,用RT-PCR方法及免疫组化检测BMP-7基因的表达.结果用RT-PCR法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因.RT-PCR方法及免疫组化检测证实其能在rBMSC中表达.结论成功克隆人BMP-7基因并证实其在rBMSC的表达,为下一步腺病毒介导的局部基因治疗打下基础.     

人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达

目的 制备含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因的真核表达质粒，获得可稳定高效表达BMP-2的兔骨髓基质细胞，为进一步研究BMP-2在骨牵张区的成骨作用作准备。方法 制备携带有hBMP-2的全长真核表达质粒pcDNA3.1-BMP2。通过脂质体法将所得到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中，用G418进行梯度筛选，从而得到能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨髓基质细胞（MSCs）hBMP-2 mRNA的表达。结果 重组质粒通过EcoRI酶切后，电泳图示约1.5kb的hBMP-2的目的片段及5.5kb的载体片段，经测序显示核苷酸序列正确无误。经RT-PCR检测hBMP-2在转录水平mRNA的表达情况，提示转染组hBMP-2的mRNA量较空白对照组明显增加。结论 成功制备了含hBMP-2基因的真核表达质粒，转染后获得了高效表达hBMP-2的兔骨髓基质细胞。     

小鼠胰岛素样生长因子-1基因体外克隆及表达的研究

目的 探讨小鼠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因提取、鉴定及重组质粒转染COS-7细胞表达.方法 通过RT-PCR获取小鼠骨骼肌IGF-1的cDNA,将该基因亚克隆入重组质粒p1 (pcDNA3.1-Nestin-EGFP)中,构建重组质粒p2 (pcDNA3.1-Nestin-EGFP- IGF-1),脂质体转染COS-7细胞,ELISA检测细胞培养基中IGF-1蛋白量.结果 克隆IGF-1基因cDNA与GenBank中该基因序列一致,重组质粒转染COS-7细胞培养基中均含有IGF-1蛋白.结论 IGF-1基因成功构建到重组质粒p2中,且能在COS-7细胞中过表达.     

脂质体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的脂质体介导IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞（MSCS），并研究对MSCS成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法以密度梯度离心结合全骨髓培养法获得纯化骨髓间充质干细胞（MSCs），经流式细胞仪检测，细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，但是CD14和CD45表达阴性。采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3．1-IGF-1转染MSCs，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达行Western blot检测。结果获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞（MSCs）；脂质体为介导将全长兔IGF-1目的基因导入MSCs，Western blot鉴定转染成功，转染后的MSCs较未转染MSCs成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

转化生长因子β1基因对骨髓基质干细胞增殖分化的影响

目的 观察转化生长因子β1（TGF－β1）基因能否转入骨髓基质干细胞（MSCs)，并探讨经TGF－β1基因转染后的MSCs增殖和分化情况。方法 取新西兰雄性大耳白兔的骨髓，得骨髓源MSCs体外培养。将重组TGF－β1和空载pcD-NA3基因分别转染MSCs后，免疫组化（SABC）法检测TGF－β1转染是否成功，用透射电镜和流式细胞仪观察两组MSCs的增殖和分化情况。结果 SABC法证明TGF－β1瞬间转染成功；转染48h后，实验组MSCs增殖较对照组显著；实验组MSCs具有一定的分化趋势。结论 重组TGF－β1基因转入骨髓源MSCs的方法是可行的，瞬间TGF－β1转染对MSCs的增殖和分化有显著促进作用。     

胰岛素样生长因子受体-1在子宫内膜癌组织中的表达及意义

目的研究胰岛素样生长因子（insulin like growth factor,IGF）在子宫内膜癌组织中的表达情况,并探讨IGF系统与子宫内膜癌发生之间的关系。方法选择子宫内膜癌患者30例和因良性疾病切除子宫的患者20例作为对照,选用Western Blot方法检测子宫内膜癌组织中胰岛素样生长因子受体-1（insulin like growth factor receptor-1,IGF-1R）的水平。结果发现子宫内膜癌组织中IGF-1R的表达明显高于正常子宫内膜组织,且与分期密切相关。结论IGF-1R在子宫内膜癌的发生发展中起着重要作用,其受体阻断剂的应用可能是一个有前景的治疗方法。     

PAM14的细胞转染表达和定位

目的构建带GFP标签的PAM14表达载体,将其转染至HEK293T细胞检测其表达,转染至COS7细胞观察PAM14蛋白在细胞内的定位。方法以含人PAM14全长cDNA序列的质粒pACT2-PAM14为模板,用PCR方法扩增PAM14全长序列,然后插入带GFP标签的载体pCDGFP中构建表达载体pCDGFP-PAM14,将构建的质粒转染至HEK293T细胞,提取总蛋白,进行Western-blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位。结果成功构建了表达载体pCDGFP-PAM14,此表达载体在HEK 293T细胞中能够有效表达,转染表明PAM14在COS7细胞主要在核内表达,胞质内也有少量表达。结论实验结果为进一步了解PAM14的功能提供了一定的基础。     

RACK1及其缺失突变体与 CLIC1的共定位研究

目的：运用分子克隆技术构建活化蛋白激酶 C 受体1（RACK1）突变体的真核表达质粒,进行 RACK1突变体的表达、定位及其与胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1）蛋白的共定位研究,为其进一步的功能研究奠定基础。方法以RACK1全长 cDNA 序列为模板,构建真核表达质粒 pcD-NA3．1-RACK1-N （1-138）-FLAG、pcDNA3．1-RACK1-C （130-317）-FLAG;Western blot 法检测突变体在哺乳动物细胞中的表达;用免疫荧光技术了解突变体蛋白在哺乳动物细胞中的共定位情况。结果成功构建了 RACK1突变体的真核表达质粒;Western blot 法检测到蛋白主要在胞质中表达,核内有部分表达;免疫荧光实验表明,RACK1及突变体蛋白主要定位在胞质与核膜,细胞核中也有少量表达,与 CLIC1蛋白存在共定位。结论成功构建了 RACK1缺失突变体,并在真核细胞中成功表达;RACK1及突变体与 CLIC1蛋白在哺乳动物细胞中均存在不同程度的共定位,蛋白之间可能存在相互作用,为 RACK1蛋白的功能研究奠定了基础。     

IGF-2和IGF-1R在子宫内膜腺癌的表达及临床意义

目的检测子宫内膜癌中IGF-2及其相应受体IGF-1R蛋白的表达情况,探讨IGF-2及其相应受体在子宫内膜癌变中的表达及作用。方法采用免疫组化PV法检测20例正常增生期子宫内膜（对照组）、30例子宫内膜腺癌（腺癌组）组织中IGF-2I、GF-1R的表达情况。结果IGF-2的过阳性表达在子宫内膜腺癌要显著高于正常子宫内膜且随病理分级的增高而表达增强,随手术病理分期的增高逐级增强I。GF-1R的过阳性表达在子宫内膜腺癌显著高于正常子宫内膜,且随病理分级的增高而表达增强。结论IGF-2及IGF-1R的异常高表达在子宫内膜癌的发生发展过程中起重要作用。     

EphA2受体及其配体在浆液性卵巢癌中的表达及其临床意义

目的 探讨浆液性卵巢癌组织中EphA2及其配体EphrinA-1的蛋白表达、定位及其与临床病理学因素及生存的关系.方法 应用免疫组织化学方法 检测浆液性卵巢癌组织中EphA2及其配体EphrinA-1的蛋白表达、定位,并应用免疫组织化学方法 、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分析方法 联合...     

MCP-1在子宫内膜异位症在位内膜的表达

目的探讨MCP-1在子宫内膜异位症(EMT)患者的在位子宫内膜中的表达水平及其在内异症发病中的作用。方法 2008年5月～2009年5月在南通大学附属医院妇产科以正常子宫内膜为对照,采用免疫荧光方法与Western blot分析内异症患者在位内膜的表达水平,并比较其差异。结果 1)免疫荧光检测结果:MCP-1在内膜腺体和间质细胞中均有表达,主要定位于内膜腺体的腺泡浆。正常子宫内膜分泌期MCP-1的表达(16.1826±3.0363)与其增生期(14.7431±2.0946)相比,组间比较无显著性差异(P>0.05);内异症在位内膜分泌期MCP-1的表达(51.0695±5.3293)高于其增生期(30.0012±4.3439),组间比较存在显著性差异(P<0.01);内异症在位内膜MCP-1的表达高于正常子宫内膜(P<0.01)。2)Western blot结果显示:正常子宫内膜分泌期MCP-1的表达(0.36788±0.02522)与其增生期(0.35678±0.02984)相比,组间比较无显著性差异(P>0.05);内异症在位内膜分泌期MCP-1的表达(1.06894±0.10542)高于其增生期(0.53686±0.02303),组间比较存在显著性差异(P<0.01);内异症在位内膜MCP-1的表达高于正常子宫内膜(P<0.05)。结论 MCP-1可能在子宫内膜异位症的病变中起重要作用。     

GLUT1和VEGF在肾癌组织中的表达及其临床意义

 目的 观察葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1,GLUT1）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义。方法 应用免疫组织化学的方法检测60例肾透明细胞癌患者的肿瘤组织、瘤旁肾组织以及远离肿瘤的正常肾组织中GLUT 1和VEGF的表达,并结合肾癌患者的临床病理特征进行比较。用Western blot法来进一步验证肿瘤组织和正常组织中GLUT1表达的差异。结果 GLUT 1在肾癌组织中的表达高于瘤旁肾组织和正常肾组织（P＜0.001）;在直径≥5 cm的肿瘤中的表达强度高于直径＜5 cm的肿瘤（P=0.033）与局限期（TNMⅠ+Ⅱ）肾癌相比,进展期（TNMⅢ+Ⅳ期）肾癌有高表达GLUT1的趋势（P=0.085）但在不同分级的肾癌组织中,GLUT1表达没有差异。Western blot检测结果也表明肾癌组织中GLUT1的表达明显高于相对应的正常肾组织。VEGF在肾癌组织中的表达高于瘤旁肾组织和正常肾组织（P=0.001）;在直径≥5 cm的肿瘤中的表达强度要高于直径<5 cm的肿瘤（P =0.017）进展期肾癌VEGF的表达水平明显高于局限期肾癌（P=0.017）在不同分级的肾癌组织中,VEGF的表达也没有发现差异。GLUT1的表达与VEGF的表达呈正相关（r=0.307,P=0.017）。结论 GLUT1和VEGF的表达与肾透明细胞癌的临床病理特征存在一定联系,两者可能共同参与了肾透明细胞癌的发生、发展。     

MTA1在胃癌细胞系和胃癌组织中的表达定位以及临床意义

目的:探索肿瘤转移相关基因1(MTA1)在胃癌细胞系中的表达情况和定位,研究MTA1在胃癌组织中的表达和临床意义。方法:提取胃癌细胞系蛋白,使用Western blot技术探测内源性MTA1的表达;选取高表达MTA1的胃癌细胞株,利用共聚焦激光扫描显微镜观察MTA1的定位;收集临床胃癌组织标本,测定MTA1的表达情况。结果:在8种胃癌细胞株中有6种胃癌细胞表达MTA1,主要定位在细胞核中。在胃癌组织中,高表达MTA1的比例达到63.6%(11对样品)。结论:胃癌细胞系中表达MTA1主要定位在细胞核中。胃癌组织中高表达MTA1,对胃癌临床诊断提供理论依据。     

hSesn1基因真核表达载体构建及蛋白的表达和定位

目的 构建人源的Sesn1真核表达载体同时检测融合蛋白在COS-7细胞系内的表达和定位。方法 提取工具细胞系HeLa的mRNA,进而反转录成为cDNA。聚合酶链反应方法扩增人源Sesn1基因的cDNA全长片段,将其克隆于pEGFP-C1真核表达载体中。进一步将已构建好的重组表达载体进行双酶切以及测序鉴定,继而转染到工具细胞系COS-7中,进行Western blot方法检测。最后应用激光共聚焦扫描显微镜方法来观察pEGFP-hSesn1在COS-7细胞中的定位情况。结果 hSesn1基因cDNA全长片段克隆至pEGFP-C1真核表达载体中,酶切鉴定片段大小为1479bp,测序证实成功。Western blot方法检测出GFP-hSesn1融合蛋白的成功表达,分子质量（Mr）约为80kDa。pEGFP-hSesn1在COS-7于细胞中主要定位在细胞质及核周。结论 成功构建了pEGFP-hSesn1真核表达载体,进而检测到融合蛋白的表达,并且在COS-7细胞中主要定位于核周及细胞质。