新生大鼠耳蜗Corti器体外培养及其转基因表达

目的建立新生大鼠耳蜗Corti器体外培养模型及观察外源基因表达。方法采用出生后1~3天龄大鼠,分离出的耳蜗Corti器组织置入表面覆盖有胶原凝胶的培养皿中,在含有10%DMEM液体培养基中培养;加入携带报告基因的腺病毒悬液,观察外源基因的表达。结果耳蜗Corti器体外培养8小时后,培养组织生长良好,形态结构清晰可辨,在该实验条件下,Corti器形态结构可以维持5天以上,最长达7天,随着培养时间的延长,由于周围组织生长的蔓延,Corti器的结构分界不清楚。腺病毒加入Corti器后12小时即有基因表达,24小时达到高峰,表达时间可持续1周。结论新生大鼠离体内耳组织转基因培养法是内耳Corti器体外培养实验研究的一种可行方法。     

重组杆状病毒载体介导大鼠螺旋神经节细胞基因转染的研究

目的探讨重组杆状病毒（baculovirus，Bac）作为内耳螺旋神经节细胞基因转染载体的可行性及其转染特点。方法应用Bac—to—Bac杆状病毒表达系统制备携带绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）的杆状病毒载体（Bac—GFP），以不同感染复数（multiplicities of infection，MOI）的病毒和不同浓度的丁酸钠转染大鼠螺旋神经节细胞，通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞转染率和绿色荧光蛋白表达强度，并观察杆状病毒和丁酸钠对螺旋神经节细胞的毒性。结果杆状病毒可以高效转染螺旋神经节细胞，转染效率达77．69％。Bac—GFP转染率和表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而提高。GFP在转染后6h开始表达，第2天达到最高。重组杆状病毒MOI小于800以及丁酸钠终浓度小于或等于10mmol／L时，对螺旋神经节细胞没有明显细胞毒性。结论重组杆状病毒可以在体外高效安全转染内耳螺旋神经节细胞。     

体外培养小鼠耳蜗Corti器对庆大霉素的吸收

目的 观察庆大霉素-德州红耦联物在体外培养小鼠耳蜗Corti器的分布情况,比较不同时间庆大霉素吸收的差异.方法 分离小鼠耳蜗Corti器,体外培养,培养液中加有庆大霉素-德州红耦联物,分别于培养后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、3 d.4 d和7 d收集标本,荧光染色后行激光扫描共聚焦显微镜观察基底膜庆大霉素的分布情况.结果 小鼠耳蜗Corti器在培养3 h后即可见外毛细胞的纤毛和胞体两侧的胞膜有庆大霉素分布;随着培养时间的延长,庆大霉素在Corti器中的所有细胞均见分布,尤以外毛细胞明显,主要聚集在毛细胞顶端纤毛的下方;培养24 h后庆大霉素在外毛细胞的聚集达到最高峰,而在支持细胞未见明显的聚集;体外培养7 d后在毛细胞胞质中仍可见庆大霉素分布.结论 小鼠Corti器体外培养可用来动态检测庆大霉素在耳蜗细胞的吸收和聚集情况.     

重组腺病毒构建及转染培养耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞的实验研究

目的构建携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒,观察GFP基因在体外培养的新生大鼠耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞的表达。方法通过细菌内同源重组方法构建携带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒（Ad-GFP）,观察重组腺病毒转染培养的新生大鼠耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞后,不同时间内绿色荧光蛋白基因的表达情况、表达部位及病毒对培养耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞的影响。结果构建的重组腺病毒经酶切电泳鉴定正确;荧光显微镜下观察腺病毒转染体外培养的新生大鼠耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞后,12 h即开始表达绿色荧光蛋白基因,24 h达到高峰,表达时间可持续1周;倒置显微镜观察转染后的Corti器和螺旋神经节细胞形态结构及生长无明显改变。结论本实验成功构建了携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒,通过该方法构建的腺病毒可以介导绿色荧光蛋白（GFP）基因在体外培养的新生大鼠耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞中表达,但腺病毒本身对体外培养的耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞生长无明显影响,为通过腺病毒进行内耳基因治疗提供了理论依据。     

模拟失重和噪声对大鼠听功能及耳蜗Corti 器损伤的协同作用

目的：探讨模拟失重和噪声对大鼠听功能及耳蜗Corti器损伤的协同作用。方法48只大鼠随机分为空白组、失重组、噪声组和失重＋噪声组,每组12只。失重组以Morey －Holton法模拟失重环境,噪声组暴露的噪声环境为模拟航天载人飞船内复合噪声,包括72±2 dB SPL的持续稳态噪声和160 dB SPL的脉冲噪声,失重＋噪声组则同时暴露于上述失重及噪声环境中,空白组常规饲养,不做任何处理。分别于暴露1周和2周后,每组随机选出6只大鼠行ABR阈值检测后取材行 HE染色、免疫荧光（DAPI）染色及扫描电镜观察耳蜗的形态学变化。结果暴露2周后大鼠ABR阈值较暴露1周时升高,失重＋噪声组ABR阈值最高（ P＜0．01）,其次为噪声组。HE染色示暴露1周和2周后除空白组外各组大鼠耳蜗Corti器均有不同程度的损伤,失重＋噪声组最严重。免疫荧光染色示暴露1周后大鼠耳蜗毛细胞死亡方式以肿胀坏死为主,失重＋噪声组最严重（肿胀率10％）,其次为噪声组（肿胀率3．33％）;暴露2周后大鼠耳蜗外毛细胞以核缺失为主,失重＋噪声组缺失率最高（缺失率13．6％）,其次为噪声组（缺失率12．7％）,失重组毛细胞缺失以内毛细胞为主。扫描电镜示,失重＋噪声组毛细胞静纤毛损伤最严重,其次为噪声组,再次为失重组。结论模拟失重和噪声环境对大鼠听功能的影响有协同作用,且这种协同作用对耳蜗Corti器有显著的损伤作用。     

顺铂作用下沙鼠耳蜗螺旋神经节神经元和Corti器细胞的凋亡

目的　探讨顺铂是否可引起沙鼠耳蜗螺旋神经节 (spiralganglion ,SG)神经元和Corti器细胞的凋亡。方法　对沙鼠进行顺铂连续腹腔注射 ,每日 4mg kg体重 ,分别于健康对照组及给药 4、5、6、7d各处死沙鼠 12只 ,取左侧耳蜗 ,每组动物取 10只耳蜗做平行蜗轴的石蜡切片 ,另 2只耳蜗做底回蜗轴及基底膜超薄切片。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术 (terminaldeoxynucleotidyltransferase mediateddUTPnickendlabelingmethod ,TUNEL)及透射电镜检测连续用药不同时间后底回SG及Corti器的细胞凋亡情况。结果　连续应用顺铂 5～ 7d ,在透射电镜下可以观察到底回SG神经元及外毛细胞中出现凋亡特征性病理改变 ,TUNEL标记的石蜡切片中可见给药 5d后SG和Corti器出现的阳性细胞明显高于健康对照组 ,给药 6～ 7d阳性细胞进一步增加。结论　细胞凋亡是顺铂损伤沙鼠SG神经元和Corti器细胞的重要方式     

新生大鼠耳蜗柯替器体外培养的初步报告

目的 建立稳定的新生大鼠耳蜗柯替器的培养方法，为内耳的研究提供新的条件和模型。方法采用显微解剖技术完整地分离出新生大鼠整个耳蜗基底膜组织，分别采用组织贴壁法及立体定向法进行培养。结果耳蜗柯替器组织块培养24小时后，组织外周即可见明显新生上皮及成纤维细胞，内、外毛细胞及支持细胞等结构清晰可见；经丫啶橙和碘化丙啶双重荧光染色进行细胞活性鉴定，毛细胞及组织活性良好。结论用组织贴壁法及立体定向法进行耳蜗柯替器体外培养是一种理想的耳科实验造模方法。     

豚鼠耳蜗Corti器外隧道的结构

目的 观察豚鼠耳蜗Corti器外隧道的解剖特征.方法 健康杂色豚鼠11只,共22耳,借助火棉胶切片(5只10耳)和扫描电镜(6只12耳)观察和分析豚鼠耳蜗Corti器外隧道的解剖.结果 豚鼠耳蜗Corti器外隧道的内侧壁在耳蜗基底回和第一回由第三排外毛细胞和Deiter细胞的指状突起构成,外侧壁和顶壁由Hensen细胞构成.自耳蜗基底回逐渐向顶回,Deiter细胞的指状突起逐渐移向外侧,形成外隧道的外侧壁和顶壁.外隧道的内侧壁由第三排外毛细胞构成,Deiter细胞指突移向Hensen细胞构成外隧道的外侧壁和顶壁,外隧道腔隙逐渐缩小.第三、四回的外隧道完全被Deiter细胞所充填,Deiter细胞指突和Hensen细胞密切接触.结论 豚鼠耳蜗Corti器外隧道的这种结构特征在研究Corti器的微细结构方面增加了新的认识.     

新生大鼠耳蜗K?lliker器在体凋亡的研究

目的：了解不同天龄新生大鼠耳蜗K?lliker器的形态变化,研究凋亡相关因子的mRNA及蛋白的表达水平,探讨K?lliker器在听觉功能发育过程中凋亡的机制。方法选取出生后不同天龄的Sprague－Dawley大鼠共192只,其中出生后1天（P1）、5天（P5）、12天（P12）各6只大鼠耳蜗冰冻切片后,通过苏木精－伊红染色及免疫荧光染色等方法,观察耳蜗K?lliker器的形态结构变化;取 P1大鼠6只行耳蜗基底膜免疫荧光观察;提取出生后1、3、5、7、10、12及14天（P1、P3、P5、P7、P10、P12和P14）大鼠耳蜗基底膜mRNA（各6只）及蛋白（各18只）,运用real－time PCR及蛋白质印迹的方法,观察出生后各天龄组大鼠耳蜗基底膜 K?lliker 器凋亡过程中 bcl－2、caspase－3、caspase－8及caspase－9的表达规律。结果出生后大鼠听力出现之前其耳蜗K?lliker器支持细胞的形态自顶回向底回从高柱状向矮柱状变化,同时支持细胞的数量逐渐减少。出生后不同天龄大鼠耳蜗基底膜的caspase－3、caspase－8、caspase－9及bcl－2的mRNA和蛋白的表达水平均呈明显的时间依赖性。结论在大鼠出生后、听力出现前耳蜗发育的整个阶段,K?lliker器自底回向顶回逐渐发生退化;caspase－3、caspase－8、caspase－9及bcl－2的mRNA和蛋白的表达表现为时间依赖性。     

Organ of Corti Kinematics

The internal workings of the organ of Corti and their relation to basilar membrane motion are examined with the aid of a simple kinematic model. It is shown that, due to the lever system embodied in the organ of Corti, there is a significant transformer gain between basilar membrane and cilia displacements. While this transformation is nonlinear, linear response prevails in the narrow physiologically relevant operating range of the ciliary transducer. The model also simulates cilia deflection when the mechanical stimulus is the length change of outer hair cells.     

人Corti‘s器扫描电镜观察

目的 了解正常人Corti’s器的超微结构特征。方法 用扫描电镜观察成年人和胎儿的Corti’s器。结果成人和胎儿Corti’s器基底圈内、外毛细胞排列规则,中圈和顶圈毛细胞排列不规则,内毛细胞以一排,外毛细胞以三排排列。可观察到列外的内、外毛细胞,四排排列和自然缺失的外毛细胞。外毛细胞粗大的静纤毛以及由于固定不及时引起的外毛细胞静纤毛气球样改变。结论 用扫描电镜观察成人和胎儿Corti’s器的精细结构,发现了毛细胞排列的基本规律和一些异常的形态。及时固定是保存Corti’s器结构完好的必要条件。     

小鼠出生后早期耳蜗柯蒂氏器巨噬细胞形态的变化

目的 揭示小鼠出生后早期耳蜗柯蒂氏器是否存在巨噬细胞及柯蒂氏器巨噬细胞形态和分布的变化.方法 选1～4周龄的C57BL/6J小鼠,解剖取耳蜗基底膜.CD45抗体(一种全白细胞标记物)染色耳蜗基底膜,F4/80(巨噬细胞专有蛋白标记物)确认巨噬细胞,碘化丙锭标记细胞核,荧光显微镜下观察CD45染色阳性细胞的形态和分布变化...     

Direct Evidence of Nitric Oxide Production in the Guinea Pig Organ of Corti

Production of nitric oxide (NO) in the organ of Corti of the guinea pig was investigated using the new fluorescence indicator 4,5-diaminofluorescein diacetate for direct detection of NO. The organ of Corti, lateral wall of the cochlea and isolated outer and inner hair cells were examined to locate NO production sites. The fluorescence intensities were augmented by stimulation with L-arginine or glutamate, and significantly increased after inoculation with lipopolysaccharide. This is the first direct evidence of NO production in the cochlea. NO may play an important role in the physiology of the organ of Corti and may also be involved in hearing disorders.     

重组腺病毒Ad-GFP转染新生小鼠离体耳蜗基底膜的实验分析

目的观察重组腺病毒Ad-GFP转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织的情况。方法取新生1～5 d小鼠的耳蜗基底膜,离体培养1 d后,加入重组腺病毒Ad-GFP继续培养1 d,在荧光显微镜及Confocal显微镜下观察病毒对离体耳蜗基底膜的转染情况。结果耳蜗基底膜离体培养1 d后,在显微镜下观察,可见基底膜贴壁生长良好,外周有新生上皮细胞和成纤维细胞长出;高倍显微镜下可见耳蜗内外毛细胞和支持细胞等结构。离体耳蜗基底膜培养组织加入重组腺病毒Ad-GFP继续培养1 d后,可见重组腺病毒Ad-GFP能高效转染新生小鼠离体耳蜗基底膜及其外周长出的新生上皮细胞和成纤维细胞;在新生小鼠离体耳蜗基底膜上,不仅大上皮嵴细胞区域、小上皮嵴细胞区域的细胞能被高效转染,毛细胞也能被高效转染。结论重组腺病毒Ad-GFP能高效转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织。     

Organ of Corti: Observation technique in the living animal

This paper describes a new technique for visualizing the organ of Corti in the living guinea pig. The various cell types and blood supply can be viewed at magnifications up to 625X through a microscope, as seen reflected by a tiny mirror in scala vestibuli. Glass microelectrodes can also be seen as they penetrate the tissues, and can be accurately localized.     

Cation distribution in the organ of Corti of the guinea pig

Summary Cations were precipitated with potassium antimonate in the cochlea of the guinea pig and the distribution of the formed precipitates was studied by electron microscopy. The precipitate density in different cells of the organ of Corti was determined on electron micrographs by counting numbers of precipitates per unit area. The spatial distribution of the precipitates was also determined by electron spectroscopic imaging (ESI). Significant differences were found among the cells of the same tissue being analyzed. These precipitate-rich cells may play a role in a postulated current flow in the organ of Corti.     

Partial amino acid sequence of organ of Corti protein OCP-II

Summary We have previously described two low-molecular-weight, highly acidic proteins which are present in the organ of Corti in extremely high concentrations. Since the function of these proteins is not known, they have been assigned the tentative names OCP-I and OCP-II. In the hope of obtaining information about their function through homology studies, we have initiated amino acid sequencing of these proteins. We have recently succeeded in obtaining a brief amino-terminal sequence of OCP-II. We now report on a significant extension of the amino-terminal sequence of OCP-II and our first results on sequences of peptide fragments obtained by limited digestion with V8 protease. Together, the sequenced segments account for about one-third of the total sequence. Comparisons with the sequences of known proteins suggest that OCP-II is not a structural protein, but that it may exhibit biologic activity.Supported by a grant from the Deafness Research Foundation and by NIDCD Program Project Grant P01 NS 24372Presented at the 26th Workshop on Inner Ear Biology in Paris, France, 3–6 September 1989     

Interaction of light with the organ of Corti

Summary A cochlear postmortem preparation has been developed which allows for hydromechanical studies of the transilluminated organ of Corti. It was found that cochlear hair cells act as optical waveguides. This property of hair cells is important for optical cochlear investigations. It may be used in the study of the motion of single hair cells.