幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合蛋白表达的研究

目的：获得大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）与幽门螺杆菌保护性抗原热休克蛋白A亚单位（HspA）的融合蛋白。方法：PCR扩增ltB和hspA基因，依次构建至表达载体pIM-1，转化大肠杆菌，SDS-PAGE、免疫印迹分析目的蛋白表达情况。采用GM1ELISA和D( )-半乳糖亲和层析方法检测重组LTB-HspA融合蛋白LTB组分与GM1神经节苷脂结合活性。结果：重组LTB-HspA融合蛋白表达量最高可达细菌总蛋白的25％。免疫印迹检测结果证实为重组LTB-HspA融合蛋白。GM1ELISA和D( )-半乳糖亲和层析方法检测结果证实重组LTB-HspA融合蛋白具有与GM1神经节苷脂结合的活性。结论：LTB-HspA融合蛋白的表达研究，为研制幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗打下了基础。     

EHECO157∶H7志贺样毒素Ⅱ结合亚单位Stx2B的基因克隆、表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7志贺样毒素B亚单位(Shiga liketoxin2B,Stx2B),并对其初步纯化。方法设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增志贺样毒素B亚单位的编码基因stx2b,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22b(+)-stx2b,经测序鉴定后转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,以Tricine-PAGE和Western blot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白。结果扩增的stx2b基因约210bp;原核表达质粒pET-22b(+)-stx2b经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coliBL21(DE3)中得到高效可溶性表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约7×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达90.1%。结论EHEC O157∶H7志贺样毒素B亚单位的高效表达与初步纯化,有利于进一步的生物学性质研究。     

EHEC O157:H7志贺样毒素Ⅱ结合亚单位Stx2B的基因克隆、表达与纯化

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157H7志贺样毒素B亚单位(Shiga liketoxin 2B,Stx2B),并对其初步纯化.方法设计引物采用PCR法自EHEC O157H7基因组扩增志贺样毒素B亚单位的编码基因stx2b,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22b(+)-stx2b,经测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,以Tricine-PAGE和Western blot分析目的蛋白的表达,并采用固相镍离子亲和层析纯化重组蛋白.结果扩增的stx2b基因约210 bp;原核表达质粒pET-22b(+)-stx2b经酶切和测序鉴定与预期序列一致;并在E.coli BL21(DE3)中得到高效可溶性表达,蛋白表达率约30%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约7×103;经固相镍离子亲和层析纯化后,蛋白纯度可达90.1%.结论EHEC O157H7志贺样毒素B亚单位的高效表达与初步纯化,有利于进一步的生物学性质研究.     

产肠毒素D金黄色葡萄球菌的筛选及其基因克隆和蛋白表达

目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素D基因（entD），表达和纯化其重组蛋白（rSED），以进一步制备抗rSED抗体，研制SED金标免疫快速检测试纸条。方法利用PCR技术．从野生型金黄色葡萄球菌中筛选产肠毒素D金黄色葡萄球菌标准株，扩增entD基因，克隆至pGEM—T Easy载体．亚克隆至原核表达载体pET28a，重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达蛋白，Ni-NTA亲和层析纯化蛋白，免疫印迹检测抗原活性。结果分离获得1株产肠毒素D金黄色葡葡球菌标准株．成功克隆entD序列．测序表明该基因共684bp，与其他entD序列（GenBank登陆号：M28521）具有99％的同源性。rSED蛋白在大肠杆菌中得到高效的可溶性表达。免疫印迹结果表明．rSED蛋白能被抗天然SED抗体识别。结论通过基因重组技术制备的重组SED蛋白具有良好的免疫反应性。     

SARS冠状病毒N蛋白的克隆与表达

目的　克隆和表达SARS冠状病毒N蛋白 ,并分析其免疫学活性。方法　采用RT PCR从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码N蛋白的基因 ;经克隆和测序分析后 ,亚克隆至表达载体pGEX 4T 2 ,转化大肠杆菌JM10 9,PCR和双酶切鉴定 ;阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS PAGE分析 ;大量诱导表达N蛋白 ,亲和层析予以纯化 ;免疫印迹分析纯化蛋白对SARS的诊断效果 ;用纯化的融合蛋白免疫小鼠观察其诱导的抗体应答。结果　RT PCR扩增出N蛋白基因的特异片段 ,获得的阳性克隆序列与Gen Bank中登录的SARS冠状病毒的N蛋白基因序列同源性为 99.8% ;N蛋白基因被亚克隆到表达载体pGEX 4T 2 ,在JM10 9中表达了N蛋白 ,表达的蛋白经亲和层析获得纯化 ;纯化蛋白能被SARS病人血清识别 ;免疫小鼠诱导产生了高滴度的抗体。结论　成功构建了SARS冠状病毒N蛋白的重组表达质粒 ,在大肠杆菌中表达的N蛋白融合蛋白具有良好的免疫学活性。     

六聚组氨酸在重组蛋白中的位置对镍亲和层析的影响

目的研究六聚组氨酸在重组蛋白中的位置对镍亲和层析的影响。方法采用PCR法扩增目的基因,克隆人pMD18-T载体后进行序列测定。构建原核表达载体pET28-His-Cpn10-IL4与pET28-Cpn10-His-IL-4,在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达两种在不同位置带有六聚组氨酸(His-tag)的重组白细胞介素4(rhIL-4)融合蛋白。用SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达产物,采用镍亲和层析的方法纯化两种重组融合蛋白。结果Western印迹证实两种融合蛋白均可与抗组氨酸单克隆抗体特异性结合,但用镍亲和层析方法可以很好地分离纯化融合蛋白His-Cpn10-IL-4,却不能纯化融合蛋白Cpn10-His-IL-4。结论应用镍亲和层析的方法纯化融合蛋白时,His-tag在融合蛋白中的位置对蛋白质的纯化非常重要,His-tag可以在融合蛋白的N端和C端,但不能在中间。     

结核分枝杆菌调节蛋白RelA的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆编码结核分枝杆菌调节基因RelA并在大肠杆菌中表达,纯化后制备兔抗RelA的抗体。方法:利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增RelA基因,构建重组表达质粒pET-32a(+)-RelA;以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,在变性条件下对目的蛋白进行镍离子亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Westem blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性;以表达的RelA蛋白免疫家兔,制备抗RelA的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果:扩增了RelA基因,克隆于表达载体pET-32a(+)中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确。经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子质量(Mr)为120 000的目的蛋白;纯化的RelA免疫家兔后,能有效地刺激特异性抗体的产生,抗血清的效价达到1∶6 400以上,且具有良好的特异性。结论:已成功构建RelA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;制备出兔抗RelA抗体,效价及特异性均良好,为进一步研究RelA蛋白在结核病中的致病机制奠定了基础。     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的表达、纯化及黏膜佐剂活性研究

目的　对大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和黏膜佐剂活性分析。方法　应用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌基因组中扩增出不耐热肠毒素B基因,将此构建于原核表达载体pET 11C,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,然后采用D(+) immobilizedgalactose亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。以纯化后重组LTB为佐剂,与幽门螺杆菌重组尿素酶B亚单位蛋白(rUreB)共同口服和滴鼻免疫BALB c小鼠,分析重组LTB的黏膜佐剂活性。结果　PCR扩增出390 bp LTB基因,与GenBank公布的核苷酸序列的相似性为99.5%。重组LTB蛋白的表达率为6%,以胞周质分泌形式表达,经亲和层析后蛋白纯度大于95%。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性和良好的免疫原性及免疫反应性。动物试验表明,重组LTB与rUreB抗原共同口服和滴鼻免疫小鼠后的特异性血清IgG及鼻腔、气管、胃黏膜和小肠黏膜sIgA水平显著高于单独rUreB抗原免疫组(P<0.05)。结论　所获得的重组LTB具有较好的黏膜佐剂活性,为其在黏膜疫苗中的应用奠定基础。     

人脂联素球状结构域基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:构建人脂联素球状结构域(gAd)基因的原核表达载体PET-28a(+)-gAd,诱导表达并纯化重组gAd蛋白,制备多克隆抗体。方法:以人基因组为模板,用PCR方法扩增人脂联素球状结构域(gAd)基因,构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,经SDS-PAGE,免疫印迹法检测并鉴定表达产物,表达的目的蛋白用镍亲和层析柱纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。结果:原核表达载体PET-28a(+)-gAd转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,获得gAd重组蛋白,免疫印迹证实能与抗his标签检测抗体结合,制备的多克隆抗体经间接ELISA法测得效价为1∶32 000。免疫印迹证实,抗血清不仅能特异性地识别gAd蛋白,还能识别脂联素蛋白,而不与非特异性蛋白结合。结论:成功构建原核表达载体PET-28a(+)-gAd,并表达、纯化重组蛋白gAd,制备的多克隆抗体特异性好,效价较高,为进一步的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌napA-ctxB融合蛋白的基因克隆与表达

目的 克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白napA与霍乱毒素B亚单位ctxB融合基因napA-ctxB(nctB),为制备预防H.pylori感染的疫苗奠定基础.方法 用PCR方法扩增ctxB目的基因片段,克隆至pQE30-napA质粒的napA基因上游,构建含双基因的表达质粒pQE30-napA-ctxB(pQE30-nctB),经测序分析确认后转化E.coli DH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白NCTB,融合蛋白NCTB经镍离子柱纯化.结果 PCR扩增出807 bp的目的基因片段nctB.工程菌pQE30-nctB-DH5α经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr为30 000,与预期的一致,约占菌体总蛋白的27%,重组蛋白用Ni2 -NTA 树脂提纯,纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图象软件分析表明纯度可达94%以上.Western blot 显示重组蛋白质有良好的抗原性.结论 构建含双基因的表达质粒pQE30-nctB成功,并在大肠杆菌DH5α中高效的表达.     

人幽门螺杆菌18 000外膜蛋白与HspA双价疫苗的构建和表达

目的 :构建含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A(HspA)和Mr为 180 0 0的外膜蛋白编码基因的重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,并在E .coliBL2 1中表达。方法 :用PCR方法从HpDNA染色体中 ,扩增HspA编码基因片段。将目的基因HspA与载体 pET32a( )分别经kpnⅠ和BamHI双酶切后 ,进行连接、测序。同时将重组载体 pET32a( ) /HspA和pET32a( ) /Omp18,分别经HindIII和BamHI双酶切 ,通过凝胶电泳回收pET32a( ) /HspA和Mr180 0 0OMPDNA片段 ,经T4连接酶将HspA和Mr180 0 0OMP编码基因通过酶切粘端进行连接 ,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE30 )中表达。表达产物经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,以Westernblot分析其抗原性。结果 :经酶切、测序表明 ,插入的基因片段为HpHspA和Mr 为 180 0 0OMP编码基因 ,由 891个碱基组成 ,与GenBank中登录的序列相比较 ,有 1.15 %的碱基发生变异 ,1.2 6 %的氨基酸残基改变。经SDS PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr 为 5 1× 10 3 ,其中 pET32a( )表达的蛋白Mr 约为 2 0×10 3 ,可溶性表达产物占菌体总蛋白的 18.96 %。重组蛋白经Ni NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上。用Westernblot分析显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清及抗Mr为 180 0 0OMP单     

幽门螺杆菌HspA和UreB双价侯选疫苗株的构建

目的 构建表达幽门螺杆菌的组成成分热休克蛋白Ａ亚单位（ＨｓｐＡ）和尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）的重组蛋的白质的侯选菌株。方法 用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌的染色休ＤＮＡ上分别扩增出ＨｓｐＡ和ＵｒｅＢ基因片段,将它们融合插入原核表达载体ｐＥＴ－２３ｂ（＋）中,并在ＢＬ２１（ＤＥ３）大肠杆菌表达。结果 经测序,ＨｓｐＡ－ＵｒｅＢ（ＨＵ）事例基因片段由２０６１ｂｐ组成,为编码６８７个氨基酸残基的多肽。ＳＤＳ－     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析

目的 获取人幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp)热休克蛋白A基因（hsqA)进行核苷酸序列分析。方法 利用PCR技术扩增HspA的DNA,并将其定向插入PinPoint^TMXa-3载体中进行核苷酸序列分析。结果 大气层克隆的HspADNA序列与GeneBank公布的序列有15个碱基存在差异。同源95.8%。结论 所克隆的HspA基因可用于重组表达及相关研究。     

幽门螺杆菌napA基因的克隆、表达及免疫反应性分析

目的构建高效表达幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)的原核表达系统,为Hp候选疫苗研制打下基础。方法从Hp标准株NCTC11639染色体DNA中扩增napA基因片段,T-A克隆后测序,与GenBank公布的其他Hp菌株的napA基因序列进行比较。目的基因片段酶切后,与表达载体连接,转化至宿主菌,构建napA基因原核表达系统pGEX-4T-1-napA-E.coliTop10。优化诱导表达条件,采用SDS-PAGE鉴定表达产物,GST亲和层析纯化收集重组NAP蛋白,Western blot法鉴定重组NAP的免疫性;采用ELASA法检测胃癌患者Hp阳性血清中抗NAP抗体效价,通过间接ELASA法从29株小鼠抗Hp全菌单克隆抗体(mAb)中筛选抗Hp-NAPmAb。结果所克隆的napA基因全长为435bp,在GenBank上登录(No.DQ341279),与GenBank公布的其他Hp菌株的核苷酸同源性为94%~98%,与国际测序模式株Hp26695、HpJ99同源性达97%,表达的NAP融合蛋白的相对分子质量(Mr)为44000,1mmol/L浓度IPTG诱导4h表达产物量较高,表达产物可被Hp感染患者的血清及兔抗Hp全菌抗体特异性结合,胃癌患者血清中抗NAP抗体效价高于正常人群血清,29株小鼠抗Hp全菌mAb中有3株mAb能与NAP发生强免疫反应。结论成功构建napA基因高效可溶性原核表达系统,重组NAP具有良好的免疫反应性,NAP在胃癌患者血清中高表达可能与胃癌的发病有关,NAP是具有良好前景的抗原。     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的：构建幽门螺杆菌（Hp）UreB-Ompll融合蛋白的重组疫苗候选株，在大肠杆菌中表达UreB-Ompll融合蛋白，并检测其免疫学活性。方法：用PCR方法扩增郑州分离坳菌株MEL-HP27的ureB和ompll基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-ompl1融合基因，将融合基因ureB-ompl1插入原核表达载体pET30a（＋）、pET28a（＋）及pMAL-c2X中，筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达，采用Westernblot对表达产物进行鉴定，并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白，应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析，纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠，Westernblot对免疫小鼠血清进行检测。结果：特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB—ompll克隆人表达载体pE330a（＋）、pET28a（＋）与pMAL—c2X中；重组菌TBl（pMAL-ureB—ompl1）经诱导获得了高效表达的MBP-UreB—Ompll融合蛋白，该融合蛋白可以被却免疫小鼠血清和却阳性患者血清中的相应抗体所识别，纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后，与纯化的融合蛋白进行杂交，结果显示在M，134000处出现特异杂交带，融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论：成功地构建并筛选出了却MELHP27融合蛋白UreB-Ompl1的重组疫苗候选株TBl（pMAL-ureB—ompll），为坳蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株构建和融合蛋白的表达、纯化及免疫学活性

目的:构建幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白的重组疫苗候选株,在大肠杆菌中表达UreB-Omp11融合蛋白,并检测其免疫学活性。方法:用PCR方法扩增郑州分离Hp菌株MEL-HP27的ureB和omp11基因并用重叠延伸PCR法获得ureB-omp11融合基因,将融合基因ureB-omp11插入原核表达载体pET30a( )、pET28a( )及pMAL-c2X中,筛选出合适的表达系统并进行融合蛋白的表达,采用Western blot对表达产物进行鉴定,并用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,Western blot对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法、酶切鉴定并经测序分析后证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pET30a( )、pET28a( )与pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清和Hp阳性患者血清中的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在Mr134000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。结论:成功地构建并筛选出了HpMELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌全长cagA基因和霍乱毒素B亚单位基因的克隆与表达

目的：构建表达幽门螺杆菌（Hp)细胞毒素相关蛋白（CagA)及粘膜免疫佐剂量霍乱毒素B亚单位（CTB）的重组质粒，并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法：用PCR方法从幽门螺杆菌扩增CagA基因片段，从霍乱弧菌扩增CTB基因片段，将它们转入原核载体质粒pGEMEX-1，在大肠杆菌DH5α中克隆，并在JM109DE3中表达。结果：重组质粒pEGEMEX-CTB的全长序列经分析与GenBank公布的序列相符；各表达蛋白经SDS－PAGE分析，相对分子量与文献相符；重组蛋白经Westem blot检测有较强的抗原性。结论：基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于幽门螺杆菌疫苗的研制及检测试剂盒的制备。     

幽门螺杆菌分子内佐剂三价疫苗的构建、纯化及活性研究

目的构建幽门螺杆菌（helicobacter pylori,Hp）中性粒细胞激活蛋白基因napA、黏附素hpaA、尿素酶B亚单位活性功能片段ureB414与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（heat-labile enterotoxin Bsubunit,LTB）的分子内佐剂三价融合蛋白疫苗,并通过13服免疫小鼠研究其抗原性,为疫苗的开发奠定基础。方法利用分子克隆技术构建携带napA-hpaA．ureB414-LTB融合基因的重组原核表达质粒pET-22b-NHUL,转化E．coliB121（DE3）,进行原核表达,重组表达蛋白采用HK26／60Superdex-75分子筛和亲和层析柱Chelating Sepharose进行纯化,Tris-Tricine电泳和Westemblot鉴定,GM1-ELISA检测rNHUL与神经节苷脂的结合。口服免疫Balb／c小鼠,检测重组融合蛋白的抗原性。结果重叠延伸PCR扩增出了约1590bp的NHUL融合基因;其核苷酸序列与GenBank公布的相关序列一致。重组融合蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,表达量约占细菌总蛋白的25％,Tris-Tficine初步测定目的蛋白的肘,约59000,纯化后纯度大于90％。Westemblot检测其具有良好的抗原性。该重组蛋白保持了与神经节苷脂GM1结合的生物学活性。动物实验表明,多亚单位疫苗口服免疫小鼠后血清特异性IgG、IsA和胃黏液、肠黏液的抗原特异性sigA抗体显著高于单一亚单位疫苗。结论所获得重组融合蛋白具有良好的抗原性和黏膜佐剂活性,为进一步的疫苗研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌Catalase基因的克隆、表达及其抗原性鉴定

目的：构建含人幽门螺杆菌（Hpylori，Hp）过氧化氢酶（catalase，KatA）编码基因的重组质粒，测定、分析其核酸序列，并在E.coli中表达，研究其抗原性。方法：应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增KatA编码基因片段，将其T-A克隆和测序，并与GenBank公布的其他Hp菌株的基因序列比较，再将目的基因插入至融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达，用GST亲和层析对其进行纯化。纯化产物用于对29株小鼠抗Hp-全菌单克隆抗体（mAb）的鉴定及与Hp啊感染患者血清进行Western blot。结果：KatA基因全长为1 515 bp，并在GenBank上登录（No．DQ333889），与GenBank公布的其他Hp菌株的核酸的同源性为96％～97％，表达的KatA融合蛋白的相对分子质量（Mr）为85 000，29株小鼠抗Hp全菌mAb中有4株mAb是针对KatA的，表达产物可被Hp感染患者的血清特异性识别。结论：重组KatA具有较好的抗原性，为坳检测试剂和疫苗的研究奠定了基础。