T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测结直肠癌细胞方法的建立及其意义

目的探讨T7RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测循环血中结直肠癌细胞的可行性及其价值。方法配制不同浓度的HT29细胞悬液并加入1×107个健康人外周血单核细胞,建立模拟结直肠癌循环肿瘤细胞的模型,从中分离出有核细胞后,加入生物素化抗CEA单克隆抗体(针对Gold抗原决定簇Ⅳ),孵育后加入亲和素-生物素-DNA分子,再加入T7 RNA聚合酶进行转录扩增反应,对生成的RNA产物进行荧光检测,并用RT-PCR检测从模型中分离出的有核细胞中CEA mRNA的表达情况。结果建立了检测结直肠癌细胞的T7 RNA聚合酶催化荧光扩增技术,最低可从1×107个单核细胞中检出5个癌细胞,比RT-PCR最低可从1×107个单核细胞中检出1×102个癌细胞更加敏感。结论T7 RNA聚合酶催化荧光扩增技术可用于检测外周血中的循环肿瘤细胞,是一种敏感的检测结直肠癌细胞的方法。     

小牛胸腺DNA、DNP受照射后转录RNA的蛋白质合成

一些文献报导,照射可引起DNA转录能力的变化,从受照射的DNA所合成的RNA,其链长及核苷酸组成都有改变。作者设想这种改变可能影响RNA的转译活力。本文报告了体外照射的小牛胸腺DNA及DNP所转录的RNA的转译能力。作者采用Nirenberg的大肠杆菌无细胞的蛋白质合成系统来研究从小牛胸腺DNA或DNP合成的RNA的转译活力。在此系统中,随RNA合成之后进行蛋白质合成,~3H标记的氨基酸掺入到蛋白质中。若在此系统中除去模板或RNA聚合酶,则标记氨基酸的掺入量降到很低。说明这种蛋白质合成确实是依赖于体外合成的RNA的。从小牛胸腺DNA或DNP合成的     

RNA干涉抑制NIH3T3细胞中外源PC-1基因表达

目的：获得能有效抑制PC—1基因表达的RNAi靶标，用RNAi技术研究PC-1基因表达在前列腺癌中的作用。方法：用DNA重组技术构建了可表达短发夹RNA的重组质粒，将重组质粒与表达PC-1-EGFP融合蛋白的质粒共转染NIH3T3细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达差异，从5个候选靶标中初筛出最合适的RNAi靶标，再通过RT—PCR和Western印迹从mRNA水平和蛋白质水平检测该RNAi靶标抑制PC-1基因表达的效果。结果：利用RNA干涉有效靶点抑制了NIH3T3细胞中外源PC-I基因表达。结论：这一策略适合大量筛选：RNAi有效靶标序列，其结果为研究RNAi技术降低PC-1基因的表达对前列腺癌细胞的影响奠定了基础。     

RNA干涉抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达

目的：通过抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达，从而部分恢复抑癌基因的表达。方法：采用RNAi技术来抑制DNMT1的活性。应用体外转录的方法，共合成了5个针对DNMT1不同靶位的siRNA序列，并转染人肺癌细胞NCI-H157。采用MSP-PCR、COBRA等方法对抑癌基因RASSF1A进行甲基化分析，半定量RT-PCR检测DNMT1 mRNA的敲降与RASSF1A基因的表达。结果与结论：5个靶位的siRNA序列中有两个靶位能够有效地抑制DNMT1的表达，且呈剂量依赖效应。人肺癌细胞NCI-H157中抑癌基因RASSF1A发生了高度甲基化，在抑制DNMT1活性后，RASSF1A基因去甲基化而恢复表达。     

16S rDNA寡核苷酸芯片鉴定致病菌的初步研究

目的：建立一种基于16SrDNA寡核苷酸芯片的检测和鉴定常见致病茵的技术。方法：以16SrDNA为靶标，针对待检细菌设计合成一系列寡核苷酸探针，制备寡核苷酸芯片。细菌DNA经通用引物扩增标记后，与芯片杂交，对杂交图谱进行分析归纳，得到一套种和属特异的检测模式。结果：以本室保存的33株茵(包括7个属15个种)进行初步检验，结果表明，种水平上的鉴定准确率为78．79％，21．21％可鉴定到属的水平。结论：该研究建立的16SrDNA寡核苷酸芯片技术可以稳定、特异地实现细菌的高通量鉴定，为进一步检测研究奠定了基础。     

DMRIE-C、Lipofectamine2000和TransMessenger转染HCV RNA效率比较

目的比较和优化DMRIE-C、Lipofectamine2000和TransMessenger3种转染试剂的转染效率,选择适合建立丙型肝炎病毒（HCV）复制子或感染克隆的转染试剂和条件。方法将含有萤火虫荧光素酶报告基因的HCVRNA,分别通过上述3种转染试剂转染Huh7和Huh7.5.1细胞系,于转染24h后裂解细胞,测定荧光素酶活性。2~3周后,结晶紫染色细胞集落。结果在Huh7和Huh7.5.1细胞中,DMRIE-C比Lipofectamine2000和TransMes-senger的转染效率高。在Huh7细胞中,4μlDMRIE-C转染试剂组的荧光素酶活性比其他组高（P〈0.05）。在Huh7.5.1细胞中,3μlDMRIE-C转染试剂组的荧光素酶活性比其他组高（P〈0.05）。在细胞集落形成实验中,DMRIE-C组的细胞克隆数多于其他两种转染试剂组。结论在Huh7和Huh7.5.1细胞中,DMRIE-C比Lipo-fectamine2000和TransMessenger的转染效率高。当建立HCV复制子或感染克隆试验时,既要选择合适的RNA转染试剂,又要考虑细胞生长状态的影响。     

Runx2特异性siRNA筛选和功能鉴定

目的:筛选Runx2特异性siRNA,优化反应条件,抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化,探讨异位骨化基因治疗的新思路。方法:使用Ambion公司提供的网上工具,设计5条针对小鼠Runx2的mRNA的模板,用体外转录合成法合成5条siRNA;采用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质两个水平,在培养的MC3T3-E1成骨前体细胞中筛选有明显抑制作用的siRNA,并优化反应条件。将筛选出的siRNA转染成骨细胞,在不同时间点检测成骨细胞相关基因I型胶原、骨桥蛋白、骨钙蛋白、骨涎蛋白mRNA的表达,采用碱性磷酸酶活性分析检测碱性磷酸酶活性的变化。结果:在合成的5条siRNA中,siRNA1657-1677对Runx2的抑制效果最明显,最佳反应条件是:浓度80nM、脂质体/siRNA为1∶1、转染时间为72小时。采用RNAi技术抑制Runx2的表达可以抑制成骨相关基因如I型胶原、碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙蛋白等的表达,阻止成骨细胞分化。结论:Runx2特异性siRNA可以抑制成骨细胞分化,可用于异位骨化基因治疗的实验研究。     

HBV启动子对肝细胞具有特异性转录活性的研究

目的：探讨HBV转录调控核心序列在肝细胞中转录的活性。方法：构建HBV增强子和启动子调控的荧光素酶报告栽体，用脂质体转染法将其转染肝细胞和非肝细胞，双荧光素酶报告基因试验检测其在不同细胞中的转录活性。结果：HBV启动子在2、2.15细胞中转录活性最高，在其他肝细胞中的转录活性显著高于非肝细胞。结论：由HBV启动子构建的载体可能是一种新颖的有前景的靶向性肝癌细胞基因治疗栽体。     

体外诱导人中枢神经系统金属硫蛋白合成:对电离辐射的神经防护作用

目的 :采用人中枢神经细胞原代培养法观察电离辐射对金属硫蛋白 (MT) m RNA转录水平和蛋白合成的影响 ,同时观察锌和镉对高剂量辐射诱导的 MT合成的神经保护作用。方法 :取 3月龄人胎前脑 ,分离神经细胞 ,体外无血清原代培养 14d,6 0 Goγ射线照射剂量为 15～ 6 0 Gy,剂量率为 0 .1Gy/ s。采用镉 -血红蛋白分析法检测神经细胞总 MT量 ,采用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)法检测其 MT- 和 MT- 的 m RNA水平 ,应用试剂盒检测乳酸脱氢酶 (L DH)释放量 ,进行细胞毒性分析 ,通过检测 DNA片段分析细胞凋亡 ,采用免疫组化法测定特异星…     

慢病毒载体介导E6AP基因敲低乳腺癌细胞株的构建及其功能检测

目的：构建E6AP基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并检测其对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成两条E6AP基因的siRNA,并将其与siRNA表达载体pSIH-H1连接。经过酶切和测序鉴定成功后,人胚肾细胞293T包装E6AP siRNA的慢病毒,然后感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低E6AP表达的稳定细胞株。稳定细胞株建立后通过实时定量PCR（ qRT-PCR）和Western 印迹等方法检测RNAi的干扰效果,并利用细胞生长实验检测E6AP siRNA对乳腺癌细胞生长的影响。结果 DNA测序证明,成功构建了E6AP siRNA的表达载体。实时定量PCR和Western 印迹实验证明,构建的siRNA确能有效抑制E6AP基因的表达,并建立了敲低E6AP表达的稳定细胞株。生长实验表明,E6AP siRNA可有效抑制细胞的生长。结论成功构建E6AP基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效地抑制E6AP基因的表达,且抑制细胞ZR75-1的生长。     

新城疫病毒Italien株辅助质粒的构建及功能鉴定

目的 构建基于T7启动子的含新城疫病毒(NDV)Italien株核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)和蛋白(L)基因的表达质粒,作为构建重组NDV所需的辅助质粒.方法 将NDV的NP、P和L基因酶切后置于T7启动子和核糖体进入位点序列的下游,分别构建NP、P和L基因的表达质粒,转染BSR-T7/5细胞,采用间接免疫荧光法(1FA)检测病毒蛋白的表达,利用微型基因组(MG-L)质粒检测辅助质粒组装核糖核酸蛋白质复合物(RNP)的功能.结果 测序证实辅助质粒构建正确.IFA检测可观察到NP和P基因的表达.与MG-L单转染对照组和空白对照组相比,辅助质粒和MG-L共转染后,报告基因萤火虫荧光素酶得到高效表达(P＜0.001).结论 成功构建了基于T7启动子的NDV辅助质粒,为进一步构建重组溶瘤NDV Italien株奠定了基础.     

应用RNAi技术沉默survivin基因对肺腺癌A549细胞的影响

目的 探讨RNA干扰(RNAi)沉默survivin基因对肺腺癌A549细胞的影响.方法 应用RNAi技术,以化学合成的survivin小干扰RNA(siRNA)体外转染A549细胞,采用MTT法及流式细胞仪检测转染前后A549细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化,通过RT-PCR及Western blot分析survivin mRNA和蛋白的表达情况.结果 survivin siRNA对A549的生长抑制作用呈浓度依赖性(P＜0.05),并能引起G1期细胞比率的增加和S期细胞相应的减少,诱导一定数量的细胞凋亡,转染后36、60、84、108、132h的IC50值分别为152.4、151.2、136.0、144.0、150.4nmol/L.100～200nmol/L siRNA转染组细胞的survivin表达在蛋白及RNA水平都显著低于对照组(P＜0.01),但空白对照组与空质粒组间无明显差异(P＞0.05).结论 应用siRNA沉默survivin基因可以下调肺腺癌A549细胞survivin的表达,进而抑制细胞生长、增殖并诱导细胞凋亡.RNAi的抑制效果具有特异、高效和持久的特点.     

Bcl-2基因特异性小干涉RNA增强食管癌细胞辐射敏感性的实验研究

目的 探讨Bcl-2基因特异性的小干涉RNA (siRNA)对食管癌细胞的辐射增敏作用。方法 构建表达Bcl-2基因特异性siRNA的真核表达载体,并借助脂质体将其转入食管癌细胞EC109。Western blot检测Bcl-2蛋白在食管癌细胞的表达,流式细胞仪检测食管癌细胞的凋亡,克隆形成实验和裸鼠移植瘤生长抑制实验检测Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体联合X射线照射对食管癌的生长抑制作用。结果 Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体可抑制Bcl-2蛋白在EC109细胞中的表达,诱导EC109细胞凋亡,增强X射线照射对EC109细胞克隆形成的抑制能力,增强X射线照射对EC109裸鼠移植瘤生长的抑制作用。结论 Bcl-2基因特异性siRNA真核表达载体可显著增强食管癌细胞对X射线照射的敏感性,具有良好的临床应用前景。     

siRNA靶向抑制PKR基因及其对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

目的研究siRNA（small interfering RNA,siRNA）对宫颈癌Hela细胞中双链RNA（dsRNA）激活的蛋白激酶（protein kinase regulated by dsRNA,PKR）基因的抑制作用,观察其对dsRNA诱导的细胞凋亡的影响。方法采用RNAi技术,对宫颈癌Hela细胞PKR基因进行特异性抑制;用阳离子脂质体与化学合成的Pre-designed anti-PKR siRNA构建转染复合体,反转染Hela细胞72h后提取总蛋白,用Western blot检测PKR蛋白表达水平的变化,用流式细胞仪检测细胞的凋亡率,激酶活性检测法测定半胱氨蛋白水解酶-3（caspase-3）活性变化。结果 siRNA能降低PKR基因的蛋白表达;未转染组的Hela细胞在加入dsRNA后,细胞凋亡明显增加,caspase-3激酶活性增强（P〈0.05）。与对照组相比,转染组的Hela细胞在加入dsRNA后,细胞凋亡显著减少,caspase-3激酶活性降低（P〈0.05）。结论 siRNA可特异有效地干扰宫颈癌Hela细胞内PKR基因的表达,从而影响肿瘤细胞凋亡。dsRNA可通过激活PKR,增强caspase-3激酶活性,而促进Hela细胞的凋亡。     

T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术检测结直肠癌循环肿瘤细胞hTERT与临床病理的关系

目的探讨T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术(Cellular FACTT)检测人循环肿瘤细胞中hTERT表达与临床病理的关系。方法Cellular FACTT法检测76例结直肠癌患者循环肿瘤细胞,与术后患者临床病理特征进行统计学分析。结果 76例结直肠癌患者CellularFACTT方法检测外周血循环肿瘤细胞阳性检出率与TNM分期、M分期相关及与肿瘤分化程度具有相关性。结论 T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术具有很高的敏感性,有可能作为一种新的检测方法用于临床的诊断,对判断结直肠癌预后、指导治疗具有一定临床意义。     

siRNA表达载体对MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达抑制的研究

目的构建人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,探讨该载体对人乳腺癌MCF-7细胞生长及hTERT基因表达的影响。方法设计针对hTERT基因的干扰靶序列,构建siRNA重组表达质粒pGenesil-hTERT,将该质粒酶切测序鉴定后,以脂质体转染MCF-7细胞,RT-PCR和Western blot技术分别检测hTERT基因及其蛋白的表达,MTT法观察转染后MCF-7细胞生长情况。结果酶切电泳和测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。该质粒转染MCF-7细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平均显著降低,MCF-7细胞生长抑制。结论内源性短发夹状siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖生长,这也为肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

反义寡核苷酸体外抗丁型肝炎病毒的初步研究

以质粒（ｓＳＶＬＤ３）为模板，通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增得到一条１３９ｂｐ的片段，它含有丁型肝炎病毒（ＨＤＶ）基因组ＲＮＡ中核酶（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）区的ｃＤＮＡ，该核酶具有自身裂解功能，将上述片段插入到ｐＧＥＭ－３Ｚ中，经筛选、鉴定，得到一重组质粒（ｐＨＤＶ１０８），经测序发现有２个碱基变异，以该质粒为模板，通过Ｔ７ＲＮＡ聚合酶，转录出核酶的前体，并观察到其自身裂解产物，自裂率达７１％。针对核酶两个重要的单链区，设计并合成二条反义寡核背酸（ＡＳＯＮ），当在转录反应中同时加入ＡＳＯＮ后，核酶的自裂率下降均较明显，当ＡＳＯＮ浓度为１６ｕｍｏ１／Ｌ时，核酶自裂抑制率均在７０％以上。提示，ＡＳＯＮ可与核酶两个重要的单链区结合，从而抑制核酶的自裂活性。     

siRNA真核表达载体构建及对细胞MSTN基因抑制的研究

肌肉生长抑制素是肌肉生长的负调控因子。本研究为了得到有效抑制绵羊MSTN基因的siRNA分子,设计8对siRNA寡聚核苷酸引物,经退火与pSilencerTM4.1-CMV neo连接构建siRNA真核表达载体,转染C2C12细胞后,利用RT-PCR及real time PCR检测干扰效果。结果显示,8条siRNA分子中有3条对MSTN基因有显著的抑制作用,其中psi-mstn-717和psi-mstn-986分子对MSTN mRNA抑制效率分别达到61%和53%。本研究证实载体表达siRNA能有效抑制细胞MSTN mRNA的表达,下一步筛选的siRNA将用于体内实验。     

锌指蛋白A20基因沉默载体制备及初步应用

目的 设计并制备有效干扰细胞内锌指蛋白A20(简称A20)表达的基因沉默载体,初步用于观察A20基因沉默对细胞炎症应答的影响. 方法 人工设计并合成A20特异性RNA干扰寡核苷酸片段(ASRF),构建A20基因沉默载体pSUPER-EGFP-A20 siRNA.采用基因转染技术使人单核细胞株THP1感染pSUPER-EGFP-A20 siRNA,用适时荧光定量PCR技术鉴定转染细胞A20基因的沉默率;用ELISA测定细胞核内NF-κB活性及培养上清液中的TNF-α水平.结果 在设计的2条ASRF中,以M59465-385R/F对细胞A20表达的抑制效果最佳,基因沉默率达83.86%.初步应用表明,A20基因沉默后THP1内NF-κB活性水平增加了78.13%,释放的TNF-α增加了49.30%. 结论 成功得到了高效A20基因沉默载体,初步应用研究提示A20表达的意义在于下调细胞炎症应答程度.