脂质体介导外源基因体外转染精子的研究

目的 为探索精子作为外源基因的载体建立转基因小鼠的可行性。 方法 我们从性成熟小鼠的输精管及部分附睾管中取出精子，与阳离子脂质体包裹的DNA混合孵育之后将其注入超排卵小鼠的阴道内，48 h后收集II细胞期胚胎细胞。结果 (1) 精子可转染上外源DNA，转染率达53%；(2) 转染有外源DNA的精子可使II细胞期胚胎携带上外源基因，携带率为11.5%。结论 小鼠输精管及附睾管内的精子可被脂质体包裹的外源DNA转染并可作为载体将此外源DNA带入早期胚胎。     

精子细胞输精管及附睾管内转染法建立转基因小鼠

目前，生产转基因动物主要的方法仍是受精卵显微注射法，所需设备复杂，技术难度大，成功率低。为此，人们都在寻找一种新的方法。利用精子携带外源DNA进入卵母细胞的精子载体法是设想之一。九十年代初，Mare和Rottmann等分别报导了电击法和脂质体转染法让精子在体外携带上外源DNA，再行体外受精的方法，引起了学者们的广泛关注，但其结果不稳定，阳性率极低。我们采用脂质体包裹外源DNA，直接注入输精管内，数天后与雌鼠交配的方法，得到了较为满意的结果，现简报如下。1材料和方法将构建好的WAP－t－PA质粒与脂质体混合制备成转染…     

阳离子脂质体介层的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

目的：探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。方法：用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lac Z报告基因的质粒pCAGGS-lacZ按3种方法转染小鼠脾细胞，（1）常规方法直接转染；（2）脾细胞经刀豆球蛋白A（ConA)活化后再按常规方法转染；（3）用黏附辅助脂质体法（adhesion-assisted lipofection,AAL）转染脾细胞。转染效率用X－gal染色法测定。结果：上述3种方法的转染效率依次为＜0．010，0．057及0．199，经方差分析，3种方法转染效率的差异有显著性（P＜0．01，n=3).结论：AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

精原干细胞体内转染途径建立rsP3111转基因小鼠的可行性研究

目的构建目的基因rsp3111与荧光蛋白融合表达的质粒,并且实现目的基因在体外受精胚胎及在体附睾成熟精子中表达。为进一步通过精原干细胞体内转染途径建rsp3111转基因小鼠奠定基础。方法将rsp3111基因以Xholl和BdmHI酶切后插入经同样酶切处理的真核细胞表达质粒pDsRed-Monomer—N1中,重组质粒为pDsRed-Monomer—N1-rSP3111。采用共培养和脂质体介导方法将ICR小鼠精子与pDsRed-Monomer—N1-rSP3111质粒共孵育,再与成熟的卵母细胞体外受精;或用脂质体介导睾丸直接注射法,将pDsRed-Monomer—N1-rSP3111导入小鼠睾丸中,通过PCR及荧光显微镜观察体外受精后的受精卵及体内睾丸转染rsp3111基因后附睾精子中是否有外源rsp3111基因的表达。结果PCR结果表明,rsp3111基因成功地转入了附睾精子及受精卵中。荧光检测结果表明,目的基因rsp3111在体外受精胚胎及睾丸的曲细精管中均有表达。结论通过雄性生殖细胞载体法实现了大鼠配子特异性蛋白rSP3111在小鼠受精卵及睾丸、附睾精子中的表选为进一步通过精原干细胞体内转染途径建立rsp3111转基因小鼠奠定了基础。     

低浓度臭氧对小鼠生长发育的影响

目的构建目的基因rsp3111与荧光蛋白融合表达的质粒,并且实现目的基因在体外受精胚胎及在体附睾成熟精子中表达。为进一步通过精原干细胞体内转染途径建rsp3111转基因小鼠奠定基础。方法将rsp3111基因以Xholl和BdmHI酶切后插入经同样酶切处理的真核细胞表达质粒pDsRed-Monomer—N1中,重组质粒为pDsRed-Monomer—N1-rSP3111。采用共培养和脂质体介导方法将ICR小鼠精子与pDsRed-Monomer—N1-rSP3111质粒共孵育,再与成熟的卵母细胞体外受精;或用脂质体介导睾丸直接注射法,将pDsRed-Monomer—N1-rSP3111导入小鼠睾丸中,通过PCR及荧光显微镜观察体外受精后的受精卵及体内睾丸转染rsp3111基因后附睾精子中是否有外源rsp3111基因的表达。结果PCR结果表明,rsp3111基因成功地转入了附睾精子及受精卵中。荧光检测结果表明,目的基因rsp3111在体外受精胚胎及睾丸的曲细精管中均有表达。结论通过雄性生殖细胞载体法实现了大鼠配子特异性蛋白rSP3111在小鼠受精卵及睾丸、附睾精子中的表选为进一步通过精原干细胞体内转染途径建立rsp3111转基因小鼠奠定了基础。     

多药耐药基因(MDR1)转染小鼠骨髓造血细胞表达及功能研究

目的：探索含人多药耐药基因（ＭＤＲ１）全长ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体转染小鼠骨髓造血细胞转染时间及转染效率的关系。方法：采用逆转录病毒上清法转染小鼠骨髓造血细胞，依据转染时间不同分为２日组及４日组，分别行ＰＣＲ法检测外源ＭＤＲ１基因；免疫组化法检测ＭＤＲ１基因表达，柔红霉素排出试验检测表达外源基因的功能。结果：ＰＣＲ方法证实转入的外源ＭＤＲ１基因可整合入小鼠骨髓造血细胞基因组中；免疫组化法检测转染率最高达３３％，转染４日组转染率大于转染２日组转染率（Ｐ＜０．０５）；柔红霉素排出试验证实转入外源基因表达产物可行使正常功能。结论：逆转录病毒上清法可有效转染外源ＭＤＲ１基因入骨髓造血细胞中；表达产物可行使正常生理功能；在转染４天时间内，转染率随转染时间延长而增高。     

炎症诱导性表达载体的表达特性

目的：构建一种具有自控性的炎症诱导性表达载体，为探索符合临床实际的抗炎基因治疗新系统奠定基础，方法：（1）将对炎症敏感的SAA3启动子调控片优现报告基因CAT片段重组，构建炎症诱导性表达载体pSAA3/CAT;(2)用脂质体转染法将表达载体pSAA3/CAT转入体外培养细胞或动物体内，观察不同时间，不同剂量的炎性刺激时报告基因的表达变化，分析SAA3启动子体内外转录活性和炎症诱导性。结果：（1）阳离子脂质体包裹表达质粒可以有效地转染肝源性细胞SMMC－7721和单核细胞源性细胞U937，经活化后的U937细胞可迅速表达CAT，6h启动，24h达峰值，72h渐降至基础水平，（2）腹腔注射脂质体包裹DNA可有效转染外源报告基因CAT在体内表达；LPS活化的基因转染小鼠肝脏中的CAT表达与一次典型的急性反应时间一致，鼠肝CAT表达水平与LPS有显著的剂量依赖关系。结论：初步建立了一种具有自控性的有效抗炎基因治疗新系统。     

切割bcr/abl核酶的逆转录病毒载体的构建及其对K562细胞的影响

目的进一步研究ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中作用以及探索ＣＭＬ基因治疗的可能性。方法利用ＤＮＡ重组技术将所设计、合成的针对ｂｃｒ／ａｂｌ融合转录本ｂ３ａ２断裂点“锤头型”核酶的基因用ＨＩｎｄⅢ、ｐｓｔⅠ酶切后克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ±质粒相应酶切位点获得ｐＢＲＺ重组子。测定ＲＺ基因序列与设计的一致。用ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ从ｐＢＲＺ上切下ＲＺ基因，定向克隆到逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ，得到携带ＲＺ基因的重组逆转录病毒载体ＰＬＲＺＸＳＮ。通过脂质体介导的ＤＮＡ转染法，将ＰＬＲＺＸＳＮ导入慢性粒细胞白血病细胞株Ｋ５６２细胞，通过克隆分析法、ＲＴ－ＰＣＲ、流式细胞仪、ＤＮＡ电泳及电镜观察等方法检测核酶对Ｋ５６２细胞的影响。结果（１）核酶转染４８ｈ后，Ｋ５６２细胞克隆抑制率达８５％；（２）核酶转染７２ｈ后Ｋ５６２细胞Ｐ２１０ｂｃｒ—ａｂｌ蛋白表达率比未转染组低５２％；（３）核酶转染４８ｈ后，Ｋ５６２细胞ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达水平比未转染组低７３％；（４）核酶处理的Ｋ５６２细胞发生凋亡，表现为核酶转染Ｋ５６２细胞７２ｈ后，用流式细胞仪可检测到明显凋亡峰，凋亡率为３７．１％，而空载体及脂     

阳离子脂质体介导的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

【目的】探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。【方法】用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lacZ报告基因的质粒 pCAGGS lacZ按 3种方法转染小鼠脾细胞 ,①常规方法直接转染 ;②脾细胞经刀豆球蛋白A(ConA)活化后再按常规方法转染 ;③用黏附辅助脂质体法 (adhesion assistedlipofection ,AAL)转染脾细胞。转染效率用X gal染色法测定。【结果】上述 3种方法的转染效率依次为 <0 0 10 ,0 0 5 7及 0 199,经方差分析 ,3种方法转染效率的差异有显著性 (P <0 0 1,n =3)。【结论】AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

不同山羊个体的精子结合和内化外源DNA能力的差异性研究

目的探讨不同山羊个体的精子结合和内化外源DNA能力差异性，以及精子内化能力对制备转基因山羊胚胎阳性率的影响。方法用地高辛标记与检测试剂盒检测12只山羊的精子分别结合、内化质粒DNApEGFP-N1的效率；体外受精实验检测胚胎阳性率与精子内化pEGFP-N1能力的关系。结果不同山羊个体的精子结合和内化pEGFP-N1的效率存在差异，内化效率最高为53．7％，最低为3．1％；3号公羊的精子体外转染外源基因后行体外受精，所得的2～8细胞胚胎表达外源基因pEGFP-N1的阳性率最高，7、8、10、11号公羊的精子体外转染外源基因后行体外受精，所得的2～8细胞胚胎均未表达GFP蛋白。结论不同山羊个体的精子自发结合、内化外源DNA的能力存在差异；不同山羊个体的精子体外转染外源基因后行体外受精，所得的2～8细胞胚胎表达外源基因的比例不同。     

基因转移的骨骼肌细胞及其在基因治疗中的应用

基因转移的骨骼肌细胞及其在基因治疗中的应用田竟生郑少鹏近年来发现，若将外源基因包括报告基因及目的基因克隆到哺乳动物表达性质粒载体或病毒载体上，再将质粒ＤＮＡ以裸露方式或用脂质体包裹，直接注射或先体外后体内（ｅｘｖｉｖｏ）法，即经骨骼肌的前体细胞——成...     

PDGF-B基因转染骨髓间充质干细胞的研究

目的：探讨血小板源性生长因子B（PDGF-B）基因转染修饰大鼠骨髓闻克质干细胞（MSC）的可行性。方法：应用FAM标记重组真核表达载体系统（pcDNA3-PDGF-B）。以脂质体法转染原代MSC。观察转染结果、表达情况孕对靶细胞活力的影响。结果：MSC的基因转染成功，持续表达时间超过了8周，没有发现明显的细胞毒作用及对细胞活力的显著影响。结论：采用真柱转染技术可以介导外源基因转染MSC，MSC是一种理想的基因载体细胞。可用于PDGF-B的基因治疗。     

脂质体白细胞介素Ⅱ对小鼠b16黑色素瘤肺转移及脾细胞增殖…

小鼠尾静脉注射Ｂ１６黑色素瘤细胞，腹腔注射脂质体白细胞介素Ⅱ和未包裹白细胞介素Ⅱ（ＩＬ－２），连续ｄ，检测小鼠肺湿重、肺转移结节数和ＣｏｎＡ诱导的脾细胞ＤＮＡ掺入量。结果表明，ＩＬ－２可抑制小鼠Ｂ１６黑色素瘤肺转移，促进ＣｏｎＡ刺激的脾细胞增殖，并与剂量明显相关。脂质体包裹ＩＬ－２可使其生物活性提高约５倍。对免疫功能受抑小鼠作用更为明显。     

逆转录病毒介导外源基因高效感染大鼠骨髓间充质干细胞

目的 通过逆转录病毒系统将小鼠同源盒基因Soxl转移至大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）。检测外源基因的表达，感染效率及感染时间。方法 常规分子生物学亚克隆技术构建重组逆转录病毒载体，转染至包装细胞株PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液，感染rMSC，并用带EGFP表达盒的pLEGFP-N1载体的逆转录病毒系统作为平行对照，评估感染率；使用Westernblot以及免疫组织化学的方法检测携带目的基因的重组逆转录病毒在rMSC中的感染和表达情况。结果 本实验成功地制备了pLXSN—Soxl重组逆转录病毒载体并制备出高滴度病毒颗粒；将病毒上清感染rMSC，EGFP阳性细胞为21％，感染时间持续20d，而对照脂质体转染法EGFP阳性细胞仅为3％。免疫组化及Westernblot显示用重组逆转录病毒液感染的rMSC可表达外源基因产物Soxl蛋白。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将外源性基因高效转移至rMSC中，并有外源性基因的稳定表达。     

抑癌基因p53与癌基因mdm2在肺腺癌细胞系GLC—82中的相互作用

探讨抑癌基因ｐ５３和癌基因ｍｄｍ２在肺腺癌细胞系ＧＬＣ－８２中的相互关系和作用。方法；采用脂质体Ｌｉｐｏｆｅｔｉｎ介导的ＤＮＡ转染法。用含有野生型ｐ５３基因和ｍｄｍ２基因的ＰＤＯＲ－ｎｅｏ逆转录病毒载体分别或共转染ＧＬＣ－８２细胞。结果：转染野生型ｐ５３基因可阻止ＧＬＣ－８２细胞生长；抑制ＧＬＣ－８２细胞ＤＮＡ合成；软琼脂培养集落形成率减少及裸小鼠成瘤性减慢，而ｍｄｍ２转染可拮抗野生     

bcl-2基因转染小鼠造血干细胞重建造血的生物学特性

目的 观察ｂｃｌ－２基因转染小鼠造血干细胞重建造血的小鼠对放化疗的抵抗作用。方法 （１）含ｂｃｌ－２ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体质粒,经脂质体介导转染ＰＡ３１７包装细胞,通过Ｇ４１８筛选和克隆,获得高病毒滴度的细胞株（Ｄ３）;（２）用Ｄ３细胞株的病毒上清转染小鼠胚胎肝造血干细胞;（３）经致死剂量照射小全注ｂｃｌ－２转 造血干细胞重建造血;（５）采用脾集落形成和再增殖能力观察ｂｃｌ－２转因干细胞重建造血     

脂质体介导TGF-β1质粒DNA转染家兔角膜上皮细胞的实验研究

为证实TGF-β1质粒DNA能否由脂质体携带进入家兔角膜上皮细胞，用多聚阳离子脂质体携带重组的人TGF-β1质粒转染体外培养的家兔角膜上皮细胞，在转染12h后，表达2d时，用免疫组化方法（SABC）检测TGF-β1质粒DNA的表达情况，结果显示：外源TGF-β1质粒DNA在家兔角膜上皮细胞可以获得表达，基因转染率为23.37%。提示：脂质体作为角膜上皮细胞基因类药物介入的基础研究和应用研究的介导体具有广阔的应用前景。     

人血小板生成素cDNA转染及表达产物对实验性血小板减少症的…

目的 探讨将人血小板生成素（ｈＴＰＯ）ｃＤＮＡ转染ＣＯＳ－７细胞中及表达产物对实验性小鼠血小板减少症（卡铂诱导）的治疗作用。方法 以哺乳动物表达载体ＰＣＩｎｅｏ为运载体，构建受控于ＳＶ４０早期启动子ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ的表达载体，利用脂质体介导转染技术，将重组ＰＣＩｎｅｏ－ｈＴＰＯ表达载体转染ＣＯＳ－７细胞中，经Ｇ４１８作用后，对挑选阳性克隆ＣＯＳ－７细胞中ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ和ｍＲＮＡ分别进行ＰＣＲ     

HGF基因转染关节软骨细胞及其生物学特性影响

目的观察携带有绿色荧光蛋白（gree fluorescent protein，GFP）标记的肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）cDNA转染兔软骨细胞后的主要生物学特性。方法取兔膝关节软骨细胞体外培养至第二代，HGFcDNA转染软骨细胞，空白质粒组为对照组；噻唑蓝（MTT）检测软骨细胞的增殖能力，SABC免疫组化及原位杂交法测其Ⅱ型胶原在转染前后的变化与mRNA的表达。结果软骨细胞在转染后可较长时间的保持其软骨细胞的生物学特性，并可促进软骨细胞的增殖，SABC免疫组化测第VI代软骨细胞的Ⅱ型胶原表达仍呈强阳性，而对照组软骨细胞则明显减弱，说明HGF基因转染软骨细胞后可表达其生物学功能。基因瞬间转染率大约为31．23名。结论GFP标记的HGF基因以脂质体为载体转染兔膝关节软骨细胞后可发挥其生物学功能，加速细胞的生长，在荧光显微镜下可直观的计算软骨细胞的瞬间转染率。     

包裹E1A基因的纳米粒子制备及转染人肺腺癌细胞A549实验研究

目的制备包裹E1A基因（腺病毒早期表达基因）的纳米粒子,并观察其介导E1A基因转染人肺腺癌细胞A549的可行性和效率。方法应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载E1A基因,制备纳米级粒子混合物,检测其包埋率、体外释放情况及粒径大小。用制备的包裹DNA纳米粒子转染人肺腺癌细胞A549,并以阳离子脂质体为对照,用PCR、RT-PCR方法分别检测转染细胞中E1A基因DNA整合和mRNA表达。结果制备的纳米粒子粒径为150～280nm,包埋率为0.78%,体外释放约为22d;在转染相等质量的DNA情况下,纳米组所得克隆数较脂质体组多（P〈0.05）;PCR、RT-PCR结果表明纳米粒子和脂质体转染细胞均有E1A基因整合和mRNA表达。结论成功制备了纳米粒子,纳米粒子可携带外源基因进行基因转染。