携带p16基因增殖缺陷型腺病毒对胃癌细胞皮下移植瘤的治疗作用

目的:研究携带p16基因的增殖缺陷型腺病毒载体对裸鼠皮下胃癌细胞移植瘤的抗肿瘤活性。方法:PCR扩增p16cDNA,构建腺病毒载体pSuCMV-p16表达质粒,在293细胞内重组增殖缺陷型腺病毒AdCMV-p16;建立胃腺癌细胞SGC-7901皮下移植瘤裸鼠模型,分为3组(AdCMV-p16组、Ad-LacZ组、空白对照组),以2×108pfu/100μl的重组腺病毒Ad-CMV-p16直接瘤内多点注射,隔日1次,共5次,空白对照组以等量病毒保存液注射,定时测量瘤体生长情况,并以p16免疫组化、TUNEL凋亡检测等观察AdCMV-p16抗肿瘤的疗效。结果:携带p16基因的增殖缺陷型腺病毒AdCMV-p16对胃腺癌裸鼠移植瘤有明显的抑制作用,抑瘤率为58.12%,而对照病毒Ad-LacZ对胃癌移植瘤的抑瘤率仅为4.26%;病理学检查显示,病毒治疗的癌组织中细胞坏死以凋亡为主,癌细胞中检测到p16基因的表达。结论:携带p16基因的增殖缺陷型腺病毒能恢复胃癌细胞中p16基因的表达,对胃癌移植瘤生长有明显的抑制作用。     

携带p16基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带p16基因的重组腺病毒并对目的基因的表达进行研究。方法 lipofectamine介导质粒共转染293细胞构建重组腺病毒，病毒DNA提取及电泳，免疫组化检测p16蛋白表达。结果 构建的携带目的基因的重组体腺病毒，经扩增，纯化后，病毒滴度均达到了10^10 pfu/ml 以上。用Ad-LacZ为代表进行重组体腺病毒转导效率的检测，发现当MOI为625以上的感染强度时，就可使100％的体外培养的肿瘤细胞被转导。重组体腺病毒能介导p16外源基因在脑胶质瘤细胞系TJ899和TJ905细胞中表达。结论 腺病毒载体能携带p16基因在转导细胞中表达，并有很高的转导效率。     

腺病毒介导的p53基因对喉癌细胞生长的抑制作用

目的探索ｐ５３基因在喉癌基因治疗方面的可行性。方法以人喉癌细胞系Ｈｅｐ－２为实验对象,将载有人野生型ｐ５３ｃＤＮＡ并含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的重组腺病毒（Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３）感染Ｈｅｐ－２细胞及肿瘤组织,体内外实验观察Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３对Ｈｅｐ－２细胞生长的影响。结果当Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３在１００ＭＯＩ效靶比时,全部Ｈｅｐ－２细胞得到转染。感染２天后ｐ５３蛋白表达达到高峰,Ｈｅｐ－２生长受到明显的抑制。Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３感染Ｈｅｐ－２细胞在裸鼠中失去致瘤性。瘤内注射Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３后,荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显减小。结论Ａｄ５ＣＭＶ－ｐ５３转导野生型ｐ５３基因可能是一种有效的喉癌基因治疗途径。     

腺病毒介导的p21基因联合顺铂对胃癌细胞的影响

目的：探讨腺病毒介导的p21基因^WAF1/CIP1基因（p21基因）在人胃癌细胞系SGC0－7901中的表达及其联合顺铂化疗对胃癌细胞生长和荷瘤小鼠的作用。方法：采用腺病毒载体携带p21基因感染人胃癌细胞系，用流式细胞仪测定p21基因对SGC－7901细胞周期的影响，并与DDP联合应用，观察p21基因和（或）DDP对SGC－7901细胞系和荷瘤小鼠的作用。结果：腺病毒介导的p21基因可在胃癌细胞系SGC－7901中过度表达，使胃癌细胞系S期含量下降，抑制其生长，并可诱导胃癌细胞的凋亡；p21基因联合DDP作用使SGC－7901细胞G2／M含量明显下降，并可抑制荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长，且联合作用比单一用药作用更明显。结论：腺病毒介导的p21基因可抑制人胃癌细胞系的生长，抑制瘤体的生长，结合化疗药物其作用更强，为临床应用提供了依据。     

p53基因重组腺病毒协同免疫活性细胞实验性抗喉癌作用的研究

为探索临床头颈肿瘤生物治疗新途径,对CD3AK、LAK细胞单独应用及其联合p53基因重组腺病毒体外抗喉癌的效应进行比较研究.重组腺病毒载体的Anderson CancerCenter提供,含巨细胞病毒(CMV)启动子、野生型p53基因cDNA和SV4D多聚腺苷信号,为E1区缺失的复制缺陷型病毒.病毒在293内大量繁殖,CSC1密度梯度离心法纯化,空斑形成法测定纯化病毒滴度.(3)于5?S的RPMI1640中传代培养靶细胞-喉鳞癌Hep-2细胞.杀伤活性检测前24-48h传代Hep-2,实验当日消化成单个细胞.从健康献血者新鲜外周静脉血,常规法分离单个核细胞,体外诱导LAK细胞和CD3AK细胞.(5)杀伤活性的检测:于细胞活性高峰     

腺病毒介导的野生型p53基因对肺腺癌细胞株生长的抑制作用

为研究野生型p53基因对肺腺癌细胞株GLC-82细胞生长的作用,确立腺病毒介导的野生型p53基因在肿瘤治疗中的意义,应用分子克隆技术首先构建了野生型p53复制缺陷型腺病毒重组体,应用生化染色方法确定了重组体的转染效率,以免疫组化法及PCR技术分别确定了腺病毒载体介导的p53基因转染GLC-82细胞后p53蛋白和p53 cDNA的表达情况;最后应用细胞生物学方法检测了p53对GLC-82细胞扩增及细胞周期的影响.结果表明所构建的重组体可以高效、快速转染GLC82细胞,抑制GLC-82细胞扩增,使细胞合成期和分裂后期的量减少,出现细胞凋亡现象:提示野生型p53基因导入可作为治疗肺腺癌的途径之一     

p16基因重组质粒的构建及其对人肺癌细胞的抑制作用

表达大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶(CD)基因的重组腺病毒AdCD体外转染小鼠黑色素瘤细胞B16F10,结果显示转染了CD基因的B16F10细胞对5-氟胞嘧啶(5FC)的敏感性显著提高.将经AdCD/5FC系统处理的B16F10细胞上清倍比稀释后.加至野生型B16F10细胞中,发现当上清仅占6.25%时即可对野生型B16F10细胞发挥明显的杀伤作用,提示AdCD/5FC介导的旁观者效应可能是通过5FC经CD酶代谢产生的毒性产物扩散而实现的.本实验还观察了CD基因体内转染后的杀伤效果,荷瘤小鼠经注射AdCD并连续10天给予5FC治疗后,与PBS、对照病毒AdLacZ/5FC治疗小鼠比较,小鼠肿瘤生长明显受到抑制,小鼠存活期明显延长.     

肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体的构建及其活性表达

目的：克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,构建在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体,研究p16基因表达对肝癌细胞的影响。方法：采用分子生物学技术手段,克隆AFP启动子和p16基因全长cDNA,将其插入腺病毒载体质粒中,并在293细胞中重组出携带p16基因的腺病毒AdAFP-p16。Western Blot检测p16基因在肝癌细胞中的特异性表达。细胞病变效应（CPE）观察p16基因表达对肝癌细胞生长的抑制作用。结果：AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,而对正常细胞中p16的表达没有影响;p16基因表达能够特异性抑制肝癌细胞的生长。结论：采用AFP启动子可以实现p16基因的肝癌细胞中定向而特异性表达,提高基因表达产物在肿瘤局部的浓度,有利于提高治疗效果。     

蜂毒素基因重组腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用

目的：构建携蜂毒素基因及甲胎蛋白（AFP）启动子（rAFP)的重组腺病毒载体，探讨rAFP驱动的蜂毒素基因在体外对肝癌细胞的特异性杀伤作用。方法：人工合成蜂毒素基因，置于rAFP之后，用细菌内高效同源重组法将目的基因重组入腺病毒质粒中，转染人胚肾293细胞进行腺病毒包装；采用MTT法测定蜂毒素基因转染对AFP阳性，阴性肝癌细胞及正常肝细胞增殖的影响。结果：携蜂毒素基因重组腺病毒载体构建成功，MTT实验证明携蜂毒素基因重组腺病毒转染后，AFP阳性肝癌细胞的增殖受到明显抑制，而对AFP阴性肝癌细胞及正常肝细胞无明显影响；无蜂毒素基因的重组腺病毒转染，则对各种细胞增殖均无抑制作用。结论：表达rAFP驱动的蜂毒素基因的重组腺病毒在体外可特异性地杀伤AFP阳性肝癌细胞。     

腺病毒介导CDES融合基因对乳腺癌细胞的抑制作用

目的:构建一种重组腺病毒rAdCDES,在体内外进行抑瘤和放疗增敏作用实验研究.方法:用细菌内同源重组法与腺病毒骨架质粒重组构建出重组腺病毒质粒,经脂质体介导转染293包装细胞扩增获取重组腺病毒rAdCDES.用测定生长曲线和MTT法检测其对人乳腺癌细胞株MCF-7的生长抑制情况;建立津白号鼠乳腺癌模型,观察rAdCDES和放疗对瘤体大小及鼠存活期的影响.结果:成功构建了rAdCDES;rAdCDES对MCF-7细胞生长抑制率达(83.1±8.1)%,与对照rAdLacZ(19.2±7.8)%相比较有显著性差异(P＜0.01);体内rAdCDES对小鼠乳腺癌MA737细胞有明显生长抑制作用,延长了小鼠的存活期,且对放疗有肯定的增敏作用.结论:本文所构建的rAdCDES在体内外对乳腺癌细胞均有明显的抑制作用和对放疗的增敏作用.     

亚硒酸钠抗氧化作用与抑瘤效应的实验观察

人ｐ１６基因是最近发现的一种肿瘤抑制基因。ｐ１６蛋白作为一种细胞增殖的负调控因子，在恶性肿瘤发生发展中起重要作用。为了进一步探讨ｐ１６基因的抗肿瘤特性，我们通过运用分子克隆技术构建重组人ｐ１６基因表达载体（ｐｃＤＮＡ３－ｐ１６），并通过电穿孔方法将ｐ１６基因导入到人肺腺癌ＮＣＩ－Ｈ４６０细胞中，经Ｃ４１８筛选获得可稳定表达ｐ１６的人肺腺癌细胞，观察ｐ１６基因对人肺腺癌细胞周期的影响和细胞增殖的作用     

腺病毒介导人血管抑素抑制乳腺癌生长的研究

目的：研究腺病毒介导的重组人血管抑制Plasminogen K5基因对乳腺癌的治疗作用。方法：通过PCR将人血纤维蛋白酶原的信号肽基因加至Plasminogen的K5结构域基因，克隆到质粒pCA13，并在293细胞中同源重组，得到腺病毒AdK5。将Ad-K5体外感染乳腺癌细胞B－Cap-37和血管内皮细胞ECV304，观察其对细胞生长的影响，同时在乳腺癌的裸鼠动物模型上，检测其对肿瘤生长的抑制作用。结果：在感染Ad-K5的B－Cap-37细胞中检测到K5基因mRNA的表达。Ad-K5对血管内皮细胞ECV304有抑制作用，但对癌细胞B-Cap-37没有直接抑制作用。动物实验表明Ad-K5能显著抑制肿瘤的生长。结论：K5基因能抑制乳腺癌实体瘤的生长。     

携带p16基因增殖缺陷型腺病毒对胃癌细胞皮下移植瘤的治疗作用

诱导免疫原性肿瘤细胞死亡是抗肿瘤化疗药物的目标之一,该作用可以通过免疫系统的“旁观者效应”根除对化疗药物抵抗的肿瘤细胞和肿瘤干细胞。蒽环类化疗药物(anthracyclin)在激发机体免疫原性的抗肿瘤反应方面具有显著的效应,但DNA损伤类化疗药物如依托泊苷(etoposide)和丝裂霉素C(mitomycin C)则不能有效地诱导免疫原性的细胞死亡。蒽环类化疗药物是如何使机体免疫系统能够识别肿瘤细胞,继而激发机体抗肿瘤效应呢?该研究的结果表明,蒽环类化疗药物能够快速诱导促凋亡的钙网蛋白(calreticulin,CRT)从胞质转位到胞膜,从而被树突状细胞表…     

p16基因转染对肾癌细胞生物学特性的影响

[目的]探讨p16基因修饰后小鼠肾癌细胞体外生物学特性的变化。[方法]将携带p16基因的腺病毒体外转染小鼠肾癌Renca细胞,观察腺病毒对Renca细胞的转染效率以及p16基因修饰的Renca细胞体外生物学性质的改变。[结果]在多重感染度（MOI）值为50,转染时间为12h时,能够达到75%-80%的转染效率,并获得目的基因p16蛋白的高效表达。转染p16基因的Renca细胞生长明显受到抑制,Fas和MHCⅠ类抗原表达增高,细胞周期分析显示细胞阻滞于C0/C1期的比例明显高于对照组（85%比62%）。[结论]小鼠肾癌细胞中外源p16基因的表达不仅直接抑制肿瘤细胞的恶性增殖,还可诱导细胞发生凋亡,同时能增强肿瘤细胞的自身免疫原性。     

非小细胞肺癌中P14ARF与P16INK4a和p53蛋白表达及其相互关系的研究

目的:检测p14ARF、p16INK4a和p53蛋白在非小细胞肺癌中表达情况,对它们在非小细胞肺癌发生过程中的作用及其相互关系进行初步探讨方法:应用免疫组化方法检测了40例非小细胞肺癌组织标本的p14AHF、p16INK4a和p53基因的表达水平.结果:非小细胞肺癌组织中p14ARF、p16INK4a和p53蛋白总阳性率分别是72.5%,50.0%和52 5%,与癌旁正常组织(分别是95.0%,92.5%,2.5%)有显著性差异(P＜0.01);非小细胞肺癌中p14ARF和p53蛋白表达异常与肿瘤分期、组织类型、分化程度、淋巴结转移情况无显著相关性;p16INK4a蛋白表达水平与组织分化程度相关(P＜0.05),但与肿瘤分期、组织类型、淋巴结转移情况无关;p14ARF和p53蛋白在组织中表达呈负相关,r2=-0.475(P＜0.0),而p14ARF和p16INK4a蛋白表达无关;p14ARF蛋白在Ⅰ期病例中强阳性( )占阳性比例为41.7%,在Ⅲ期中强阳性( )比例为10.0%.结论:p14ARF、p16INK4a和p53三个基因在NSCLC发生过程中起重要作用,特别在肿瘤早期可能起到更为重要的作用;p14ARF和p53基因在同一调节通路上;p14ARF、p16INK4a和p53蛋白可以作为非小细胞肺癌早期生物学检测指标.     

p16基因在人卵巢上皮癌细胞系中的缺失分析研究

目的：了解新型抑癌基因ｐ１６在人卵巢上皮癌细胞系中的变异情况,为认识卵巢上皮癌的形成和发展依据。方法：应用ＰＣＲ扩增、ｍＲＮＡ原位杂交和免疫细胞化学方法,对５种人卵巢上皮癌细胞系ＣＡＯＶ３、ＯＶＣＡＲ３、ＡＯ、ＨＯ－８９１０及ＨＯ－８９１０ＰＭ进行分析。结果：５种人卵巢上皮癌细胞系中只有ＣＡＯＶ３（２０％）显示ｐ１６基因纯合性缺失,ＣＡＯＶ３细胞亦无ｐ１６基因ｍＲＮＡ及蛋白表达。ＯＶＣＡＲ３、Ｈ０     

人PTEN基因表达载体的构建及其在U251细胞中的表达

背景与目的:克隆人野生型和突变型PTEN的cDNA并构建其表达载体,探讨该表达质粒在人星形胶质瘤细胞U251中的表达情况.材料与方法:分别从新鲜胎盘组织和结肠癌组织中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增人野生型和突变型PTEN基因全长cDNA,分别克隆入pMD 18-T载体上,经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆,进行核苷酸序列分析.再分别将两段基因定向克隆入pcDNA3.1( )载体中构建表达载体,转染入U251细胞.结果:成功克隆了人野生型及突变型PTEN cDNA并成功构建其表达载体,发现突变型PTEN蛋白对细胞生长无明显抑制作用,而野生型PTEN蛋白对细胞生长有明显抑制作用.结论:PTEN可能能抑制肿瘤细胞生长,为后进一步开展PTEN对肿瘤相关功能的研究奠定基础.