腺病毒介导的野生型p53基因对肺腺癌细胞株生长的抑制作用

为研究野生型p53基因对肺腺癌细胞株GLC-82细胞生长的作用,确立腺病毒介导的野生型p53基因在肿瘤治疗中的意义,应用分子克隆技术首先构建了野生型p53复制缺陷型腺病毒重组体,应用生化染色方法确定了重组体的转染效率,以免疫组化法及PCR技术分别确定了腺病毒载体介导的p53基因转染GLC-82细胞后p53蛋白和p53 cDNA的表达情况;最后应用细胞生物学方法检测了p53对GLC-82细胞扩增及细胞周期的影响.结果表明所构建的重组体可以高效、快速转染GLC82细胞,抑制GLC-82细胞扩增,使细胞合成期和分裂后期的量减少,出现细胞凋亡现象:提示野生型p53基因导入可作为治疗肺腺癌的途径之一     

介导反义cyclin D1的重组腺病毒的构建及其对人肺腺癌细胞的作用 *

目的:构建介导反义cyclin D1的重组腺病毒,研究其对人肺腺癌细胞内的细胞周期、增殖和凋亡的影响.方法:将cy-clin D1基因反向克隆于穿梭质粒载体pAdCMV中,通过脂质体与pJM17共转染293细胞,经同源重组产生编码反义cyclin D1的重组腺病毒.体外观察和检测重组腺病毒感染人肺腺癌细胞系GLC-82和SPC-A-1以及人胚肺二倍体细胞2BS后,细胞周期的改变、凋亡的发生和相关基因表达的变化.结果:构建并扩增、纯化得到编码反义cyclin D1的重组腺病毒Ad-AS cyclin D1,滴度达1×10~(10)pfu/ml.肿瘤细胞感染Ad-AS cyclin D1后,RT-PCR分析显示cyclin D1基因表达下调;同时出现了明显的G1期阻滞和凋亡,凋亡相关基因bcl-2和bax基因的表达分别出现下调和上调;人胚肺二倍体细胞感染Ad-ASmyc后无上述变化.肿瘤细胞体外克隆形成能力Ad-AS cyclin D1抑制.结论:反义cyclin D1的重组腺病毒感染肿瘤细胞可使cyclin D1基因表达下调,继而诱导肿瘤细胞G1期阻滞和凋亡,使肿瘤细胞致瘤能力和肿瘤生长被抑制,但不影响正常细胞.     

重组复制缺陷型腺病毒Ad p53AIP1的抗肿瘤效应及其作用机制

目的:探讨外源性p53AIP1（p53regulated apoptosisinducing protein 1）基因抗肿瘤效应及其作用机制，以评估p53AIP1基因在肿瘤基因治疗中应用的可行性。方法：构建携带p53AIP1基因的重组复制缺陷型腺病毒Adp53AIP1，感染人肝癌细胞HepG2，应用MTT比色法、Western blotting、流式细胞术、罗丹明染色以及电镜等观察外源性p53AIP1基因表达对肿瘤细胞的作用及其相关机制。小鼠皮下接种感染Adp53AIP1的小鼠乳腺癌4T1细胞，观察Adp53AIP1对肿瘤细胞体内成瘤性的影响;建立4T1细胞皮下移植瘤小鼠模型, 直接瘤内多点注射重组腺病毒，观察Adp53AIP1的抗肿瘤疗效。结果：感染Adp53AIP1的HepG2细胞能够高效表达P53AIP1蛋白。MTT检测显示Adp53AIP1对人肝癌细胞HepG2的生长抑制率达50％以上；流式细胞术分析证实p53AIP1使肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期；罗丹明染色、电镜观察以及凋亡相关蛋白PARP表达的检测均证实p53AIP1 能诱导肿瘤细胞发生明显凋亡。感染Adp53AIP1的肿瘤细胞体内成瘤受到非常明显的抑制（P<001）, Adp53AIP1瘤体注射对移植瘤生长也有明显的抑制作用（P<0.05）。Western blotting以及RTPCR检测证实Adp53AIP1对p53mRNA表达无影响，能下调mdm2 基因的表达；p53AIP1能上调P53蛋白的表达、下调MDM2蛋白的表达水平，同时还影响P21等细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达。结论：p53AIP1有明显的体内外抗肿瘤作用，其作用机制与其反向调控P53蛋白、调控多种细胞周期和细胞凋亡相关蛋白、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡有关，该基因在肿瘤基因治疗中具有潜在的应用前景。     

凋亡抑制基因c-FLIPs对人肺腺癌细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨过表达凋亡抑制基因c-FLIPs重组腺病毒对人肺腺癌细胞增殖和凋亡的作用。方法:构建过表达凋亡抑制c-FLIPs的重组腺病毒Ad5 c-FLIPs,感染人肺腺癌细胞Calu-3。Real-time PCR检测感染前后c-FLIPs、Caspase-8,Caspase-10和Bcl-2的表达。MTT法检测细胞增殖。流式细胞仪检测感染Ad5 c-FLIPs后人肺腺癌细胞的凋亡情况。结果:成功构建过表达c-FLIPs重组腺病毒Ad5 c-FLIPs,real-time PCR检测凋亡抑制基因c-FLIPs在Calu-3细胞株高表达,过表达c-FLIPs基因,凋亡相关基因Caspase-8、Caspase-10和Bcl-2的表达明显降低。MTT法检测感染前后细胞增殖情况发现,过表达c-FLIPs基因可诱导细胞增殖,流式细胞仪分析经PI染色后的Calu-3细胞株,对照组和腺病毒感染组细胞的凋亡率分别为（55.17±9.68）%和（10.97±1.66）%,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:凋亡抑制基因c-FLIPs可明显诱导人肺腺癌细胞增殖并抑制凋亡。     

重组hIFN-β腺病毒对食管癌细胞增殖及细胞周期的影响

背景与目的:Ⅰ型干扰素包括IFN-α和IFN-β,是多功能的细胞因子,具有抗病毒,抗增殖,抗血管生成及免疫调节作用。许多研究已经证明,IFN-β能明显抑制多种肿瘤的生长。然而,IFN-β蛋白极短的半衰期是临床应用中面临的主要问题。此外,临床实验表明最大剂量给药后机体IFN-β血清浓度远远低于抗肿瘤效应所需要的有效药物浓度。由载体介导的基因治疗解决了这一难题。许多研究已经表明,腺病毒载体介导的IFN-β基因能在肿瘤组织局部高效表达,抑制这些肿瘤细胞和组织的生长,并能诱导其凋亡。所以,基因治疗是一种具有应用前景的治疗手段,本实验用重组腺病毒载体转染食管癌细胞,观察腺病毒(Ad)介导的hIFN-β基因对人食管癌细胞体外增殖及细胞周期的影响。方法:重组腺病毒AdhIFN-β转染食管癌细胞系KYSE150,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从RNA水平检测hIFN-β基因在KYSE150细胞中的表达,细胞生长抑制实验、集落形成能力实验检测hIFN-β基因对KYSE150细胞的体外增殖的影响;流式细胞术(FCM)检测细胞周期改变。结果:重组腺病毒经HEK293细胞扩增、纯化后滴度可达2×1011pfu/ml,且30 MOI(multiplicity of infection)的病毒可使95%以上的KYSE150细胞感染;RT-PCR检测到外源性hIFN-β基因在KYSE150细胞中的表达;MTT实验和集落形成能力实验表明,与对照组相比,AdhIFN-β转染后细胞生长受到明显抑制;流式细胞仪检测显示细胞阻滞于S期。结论:腺病毒介导的hIFN-β基因能抑制食管癌细胞的增殖及诱导S期阻滞,为该基因应用于食管癌的治疗提供了理论基础。     

重组复制缺陷型腺病毒Ad-p53AIP1的抗肿瘤效应及其作用机制

目的：探讨外源性p53AIP1（p53-regulated apoptosis—inducing protein1）基因抗肿瘤效应及其作用机制，以评估声3A，H基因在肿瘤基因治疗中应用的可行性。方法：构建携带p53AIP1基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad—p53AIP1，感染人肝癌细胞HepG2，应用MTT比色法、Westernblotting、流式细胞术、罗丹明染色以及电镜等观察外源性p53AIP1基因表达对肿瘤细胞的作用及其相关机制。小鼠皮下接种感染Ad—p53AIPl的小鼠乳腺癌4T1细胞，观察Ad—p53AIP1对肿瘤细胞体内成瘤性的影响；建立4T1细胞皮下移植瘤小鼠模型，直接瘤内多点注射重组腺病毒，观察Ad—p53AIP1的抗肿瘤疗效。结果：感染Ad—p53AIP1的HepG2细胞能够高效表达p53AIP1蛋白。MTT检测显示Ad—p53AIP1对人肝癌细胞HepG2的生长抑制率达50％以上；流式细胞术分析证实p53AIP1使肿瘤细胞周期阻滞于G2／M期；罗丹明染色、电镜观察以及凋亡相关蛋白PARP表达的检测均证实p53AIP1能诱导肿瘤细胞发生明显凋亡。感染Ad—p53AIPl的肿瘤细胞体内成瘤受到非常明显的抑制（P〈0．01），Ad—p53AIP1瘤体注射对移植瘤生长也有明显的抑制作用（P〈0．05）。Western blotting以及RT—PCR检测证实Ad—p53AIP1对声3mRNA表达无影响，能下调mdm2基因的表达；p53AIP1能上调P53蛋白的表达、下调MDM2蛋白的表达水平，同时还影响P21等细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达。结论：p53AIP1有明显的体内外抗肿瘤作用，其作用机制与其反向调控P53蛋白、调控多种细胞周期和细胞凋亡相关蛋白、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡有关，该基因在肿瘤基因治疗中具有潜在的应用前景。     

携带p16基因增殖缺陷型腺病毒对胃癌细胞皮下移植瘤的治疗作用

目的:研究携带p16基因的增殖缺陷型腺病毒载体对裸鼠皮下胃癌细胞移植瘤的抗肿瘤活性。方法:PCR扩增p16cDNA,构建腺病毒载体pSuCMV-p16表达质粒,在293细胞内重组增殖缺陷型腺病毒AdCMV-p16;建立胃腺癌细胞SGC-7901皮下移植瘤裸鼠模型,分为3组(AdCMV-p16组、Ad-LacZ组、空白对照组),以2×108pfu/100μl的重组腺病毒Ad-CMV-p16直接瘤内多点注射,隔日1次,共5次,空白对照组以等量病毒保存液注射,定时测量瘤体生长情况,并以p16免疫组化、TUNEL凋亡检测等观察AdCMV-p16抗肿瘤的疗效。结果:携带p16基因的增殖缺陷型腺病毒AdCMV-p16对胃腺癌裸鼠移植瘤有明显的抑制作用,抑瘤率为58.12%,而对照病毒Ad-LacZ对胃癌移植瘤的抑瘤率仅为4.26%;病理学检查显示,病毒治疗的癌组织中细胞坏死以凋亡为主,癌细胞中检测到p16基因的表达。结论:携带p16基因的增殖缺陷型腺病毒能恢复胃癌细胞中p16基因的表达,对胃癌移植瘤生长有明显的抑制作用。     

RGD修饰的腺病毒介导LIF和IL-24双基因共表达对MEG01白血病细胞的抑制作用

目的 利用RGD修饰改造白血病抑制因子（LIF）和白细胞介素 24（IL-24）双基因共表达腺病毒载体,以提高感染效率,探讨其对人白血病MEG01细胞的抑制作用。方法 同源重组法构建RGD修饰的表达LIF、IL 24的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD -IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。在QBI-293A细胞中扩增腺病毒,检测病毒滴度。流式细胞仪检测各组腺病毒载体对MEG01细胞的感染效率。应用Western blotting检测目的基因LIF、IL-24在MEG01细胞中的表达。CCK-8法检测各组腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24感染MEG01细胞后对细胞增殖的影响。PE-AnexinV／7-AAD双染后,经流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达。PI染色后,流式细胞仪检测目的基因表达对MEG01细胞周期的影响。实时定量PCR检测细胞周期调控基因p21和E2F1的表达。结果 成功构建了RGD修饰的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。RGD修饰后的腺病毒能够显著增强对MEG01细胞的感染效率。CCK-8检测显示,与PBS组比较,携带单个目的基因的腺病毒载体Ad.RGD-LIF和Ad.RGD-IL24在第5 d对细胞生长的抑制率分别为29.2％和31.5％,均能够显著抑制MEG01细胞的生长;携带Ad.RGD-LIF-IL24双基因组的抑制率达42.5％,优于单基因组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。凋亡检测显示,与PBS组（4.5％）和空病毒组Ad.RGD（7.4％）比较,Ad.RGD-IL24（20.9％）、Ad.RGD LIF（17.8％）均能够显著促进细胞凋亡,且Ad.RGD-LIF-IL24双基因组（29.7％）的促凋亡作用更强。Western blotting显示,LIF和IL-24能够提高促凋亡蛋白p53、Bax的表达,同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达。目的基因LIF、IL-24过表达会影响MEG01细胞周期的进程,使细胞阻滞在G2期。实时定量PCR显示,LIF和IL-24能够上调细胞周期调控基因p21的转录,抑制E2F1的表达。结论LIF和IL-24过表达的腺病毒载体在体外通过调节p53、Bax、Bcl-xl的表达,影响白血病细胞MEG01的生长,诱导其凋亡,并通过调控p21、E2F1的水平影响细胞周期的进程。     

Bmi-1-siRNA抑制肺腺癌SPC-A1细胞的增殖及其机制

背景与目的：Bmi-1(B-cell specific moloneymurine leukemiavirus insertion site 1)基因是多梳基因家族的重要成员之一,主要通过调控INK4a/ARF位点来调节细胞的增殖和衰老。本研究旨在探讨Bmi-1-siRNA对具有INK4a/ARF位点的肺腺癌SPC-A1细胞生长和增殖的影响,并探讨其作用机制。方法：①本实验选用已确定有效的siRNA序列进行病毒包装,构建反转录病毒si-Bmi-1 pSUPERretro-neo,然后感染到SPC-A1细胞中,建立稳定表达Bmi-1-siRNA的肺癌细胞株。②利用RT-PCR和蛋白质印迹法(Western blot)技术分析Bmi-1基因在Bmi-1-siRNA转染后SPC-A1细胞中表达情况。③利用台盼蓝拒染法、MTT法、平板克隆形成实验和裸鼠实验,分析Bmi-1-siRNA对SPC-A1细胞体内外增殖能力的影响。④利用流式细胞术分析SPC-A1各组细胞的周期分布。⑤利用Western blot法分析增殖通路相关分子：p16^INK4a、p53、Cyclin D1、PTEN和Ser473p-Akt等蛋白表达情况。结果：反转录病毒介导的Bmi-1-siRNA被转染后,有效抑制了SPC-A1细胞中Bmi-1基因的转录和表达,抑制了SPC-A1细胞的体内外增殖能力(P<0.01),并使转染组细胞阻滞在G₁期［(64.6±1.2)%,P<0.05］。沉默Bmi-1基因后,与对照组细胞相比,p16^INK4a、p53和Akt蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),Cyclin D1和Ser473p-Akt表达水平下降(P<0.01),PTEN表达水平上调(P<0.01)。用PTEN抑制剂处理转染组细胞后,Bmi-1和Ser473p-Akt蛋白表达得以重塑。结论：Bmi-1-siRNA通过将肺腺癌SPC-A1细胞周期阻滞于G₁期来抑制肿瘤细胞增殖,这种抑制作用可能不依赖于p16^INK4a来调控Cyclin D1的表达,进而参与调控肿瘤细胞增殖。     

腺病毒介导mda-7/IL-24基因感染对卵巢癌耐药细胞凋亡的影响

背景与目的:Mda-7/IL-24基因是一个具有选择性的诱导肿瘤细胞凋亡和细胞因子免疫调节功能双重作用的基因,在抗肿瘤基因治疗方面有很好的应用前景,本研究利用构建的mda-7/IL-24重组腺病毒感染卵巢癌耐药细胞株,了解其对卵巢癌耐药细胞的抗肿瘤作用.方法:利用腺病毒AdEasy 1载体构建含目的基因的Ad.mda-7/IL-24,感染两种卵巢癌耐药细胞株OVCAR-3和OVCAR-8/TR,Western blot法检测感染后MDA-7/IL-24蛋白表达,用Hoechst33258凋亡染色和流式细胞仪检测感染后细胞的凋亡和细胞周期改变.结果:Ad.mda-7/IL-24经测序、酶切电泳、感染后Western blot检测MDA-7蛋白表达,表明构建成功;感染Ad.mda-7后72 h内OVCAR-3细胞最高凋亡率为14.1%,OVCAR-8/TR细胞为32.4%,明显高于空载体组和未感染组.结论:成功构建了Ad.mda-7/IL-24重组腺病毒,用其感染卵巢癌耐药细胞可诱导细胞凋亡.     

红色诺卡氏菌细胞壁骨架治疗恶性胸水36例的临床观察

目的：本文在利用COS／TPC同源重组法高效制备人CD80重组腺病毒的基础上,对感染人CD80重组腺病毒的肺癌细胞的体外生物学特性进行研究。方法：以缺陷型重组腺病毒为载体,将人CD80基因导入肺癌细胞,利用PCR和琼脂糖电泳对肺癌细胞中人CD80基因进行了检测,以FACS、电镜等方法观察分析肺癌细胞被rAd-CD80感染前后的变化。结果：人CD80重组腺病毒经扩增、纯化后,滴度可达10610PFU/ml,当病毒为30MOI时,腺病毒对肺癌细胞Anip973的转染率达90%以上。转染rAdCD80的肺癌细胞除表达结构和超微结构有轻微变化外,其生长能力及克隆形成率无明显变化,rAdCD80对肺癌细胞的增殖周期亦无影响。结论：以上结果为制备肿瘤疫苗打下基础。     

人突变p27基因对大肠癌细胞SW480生长的影响

目的：观察人突变p27基因（p27mt）对人大肠癌细胞生长的影响，探讨p27mt基因在大肠癌基因治疗中的作用机制。方法：以携带突变p27基因复制缺陷型腺病毒（Ad—p27mt）为载体，转染大肠癌细胞SW480；用Western blot方法检测p27mt蛋白的表达；细胞计数法检测p27mt对SW480细胞生长的抑制作用；用流式细胞仪检测细胞周期：用DNA片段分析法检测细胞凋亡。结果：通过免疫印迹分析Ad—p27mt转染SW480细胞后，p27在细胞中出现了蛋白高表达。PI染色流式细胞仪检测77．96％的细胞阻滞于G0/G1期，而Ad—LacZ组及空白对照组分别为27．57％和25．29％；生长曲线显示Ad—p27mt对细胞生长就有明显的抑制作用；DNA片段分析示p27mt基因可诱导细胞的凋亡。结论：p27mt对细胞周期有明显的阻滞作用，主要阻滞于G0／G1期；p27mt基因对细胞的生长抑制机制与诱导细胞凋亡和细胞周期的阻滞有关。     

Changes in p21WAF1, pRb, Mdm-2, Bax and Bcl-2 expression in cervical cancer cell lines transfected with a p53 expressing adenovirus

The aim of this study was to provide some insights into the molecular mechanisms involved in p53-dependent apoptosis and growth arrest. Changes in the levels of p53 protein and proteins regulated by p53 were studied in relation to events of the cell cycle and apoptosis in cervical cancer cell lines upon transfection with a p53 expressing adenovirus (Ad5-p53). The post-transfection level of p53 protein in SiHa cells was found to be unchanged during the 24-48 h period. In contrast, the level of p21WAF1 protein was shown to increase to its highest level at 24 h, and decreased gradually up to 48 h after the Ad5-p53 transfection. We further noted that the increase of p21WAF1 was accompanied by G1 arrest at 24 h and the decrease of p21WAF1 was associated with apoptosis at 36-48 h after transfection. An anti-p21WAF1 antibody cross-reactive protein band of approximately 14 kDa was observed in HeLa and C-33A cells when these cells were committed to apoptosis upon Ad5-p53 transfection. In SiHa cells, phosphorylation of pRb was inhibited during the early stage of Ad5-p53 transfection. This was followed by the cleavage of pRb. However, Ad5-p53 transfection did not change the levels of Bax and Bcl-2 proteins. Our results suggested that, Bax and Bcl-2 may not be important for the apoptosis of these cells, whereas cleavage of Rb, and the decrease of p21WAF1 could play important roles in p53-dependent apoptosis.     

受体依赖性TRAIL重组腺病毒对人肺癌细胞凋亡的诱导作用

目的：观察重组TRAIL腺病毒（Ad5TRAIL及Ad5F35TRAIL）对人非小细胞肺癌（nonsmallcell lung cancer,NSCLC）原代培养细胞和细胞株的凋亡诱导作用,探讨两种AdTRAIL用于肺癌基因治疗的价值。方法：采用流式细胞术检测人肺癌细胞系A549、Z793、QG56和NCIH520及10例原代培养肺癌细胞中CAR和CD46的表达水平;分别以Ad5TRAIL及Ad5F35TRAIL重组腺病毒按MOI 10和50感染上述细胞,48 h后Annexin VFITC双标法流式细胞术检测细胞的早期凋亡。结果：A549、Z793、QG56和NCIH520 4株肺癌细胞中,CD46的表达均明显高于CAR表达。Z793、QG56细胞对Ad5TRAIL和Ad5F35TRAIL的作用较敏感, MOI=10感染后凋亡率分别为（11.76±2.10）%、（15.96±2.89）%和（6.05±158）%、（10.11±1.26）%,显著高于对照组\[（2.33±0.37）%和(5.95±1.89）%,P<0.05\];MOI=50感染时NCIH520细胞凋亡率分别为（12.89±3.2）%和（9.08±1.35）%,与对照组（7.04±2.17）%相比差异无统计学意义（P>0.05）;Ad5TRAIL和Ad5F35TRAIL均不能诱导A549细胞凋亡。10例原代肺癌细胞CD46表达也明显较CAR高;Ad5TRAIL或Ad5F35TRAIL 感染后,5例的原代肺癌细胞检测到凋亡;与Ad5TRAIL相比,Ad5F35TRAIL诱导的凋亡率更高。结论：两种TRAIL重组腺病毒对非小细胞肺癌细胞均有凋亡诱导作用,Ad5F35TRAIL的作用强于Ad5TRAIL,更适合于非小细胞肺癌的基因治疗。     

Survivin基因的shRNA 干扰对结肠癌SW480 细胞增殖和凋亡的影响*

目的:以携带shRNA 片段的腺病毒为载体,对结肠癌细胞SW480 中Survivin基因的表达进行干扰,研究其对肿瘤细胞中Survivin基因沉默效果及对细胞周期、凋亡和增殖的影响。方法:将构建好的携带Survivin-shRNA 片段腺病毒,体外转染结肠癌细胞株SW480。以EGFP为报告基因,采用流式细胞计数测定不同感染复数（MOI）下的转染效率,选取适当病毒浓度进行下一步实验。通过RT-PCR 和Western blot检测基因沉默后结肠癌细胞内Survivin mRNA和蛋白的表达水平;在Annexin V-FITC 和PI染色后通过流式细胞术检测并分析Survivin基因沉默后细胞周期和凋亡的变化;同时采用噻唑蓝（MTT）法、克隆增殖实验对细胞不同时期增殖活性进行观察,明确对细胞增殖的抑制时效性。结果:腺病毒转染后MOI 值在0～50时,剂量与转染效率成正比,确定最佳MOI 值为50并进行后续实验;shRNA 干扰后细胞内Survivin mRNA和蛋白表达水平降低,较对照细胞组差异有统计学意义（P<0.01）。 流式细胞仪检测结果显示基因沉默后细胞凋亡率升高,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。 同时基因沉默后,细胞周期也有明显变化,表现为G1/S 期细胞增多和G2/M期细胞减少,与对照细胞组相比差异有统计学意义（P<0.05）。 MTT 和单克隆平板实验均显示Survivin基因的沉默,对细胞的增殖和生长均具有明显抑制作用（P<0.05）。 结论:采用腺病毒对结肠癌进行靶向Survivin基因的shRNA 干扰,能有效降低目的基因的表达。其介导的Survivin基因的沉默,可以有效的诱导结肠癌细胞凋亡,同时Survivin基因可以通过抑制细胞G1/S 期转化来阻止细胞分裂,抑制细胞生长。      

Enhancement of Adenovirus-Mediated Gene Transfer to Human Bone Marrow Cells

Adenovirus infection of CD34⁺ hematopoietic stem/progenitor cells is dependent on the multiplicity of infection (MOI), time of incubation, the volume in which the co-incubation occurs and the presence or absence of growth factors. Studies revealed that a brief co-incubation (1-8 hours), resulted in low levels of transgene expression, suggesting that adenovirus infection of CD34⁺ cells occurs slowly, and optimal transduction requires a 24 hour exposure to adenovirus. Infection by Ad/β-gal or Ad/p53 at a MOI of 500:1 provided a high transduction efficiency but inhibited hematopoietic function. However, treatment at a MOI of 50-100 resulted in efficient transduction (10.7-15.7% positive) without detectable toxicity. Secondary proof of adenovirus transgene expression was demonstrated by detection of mRNA for p53 in Ad/p53 infected stem cells. We conclude that a 24 hour exposure to recombinant adenovirus encoding p53 or β-gal, at a MOI of 50-100 is optimal for in vitro gene transfer to BM cells and has no significant effect on hematopoietic function. Adenovirus-mediated transduction of BM cells can also be modulated by growth factors (IL-3, GM-CSF and G-CSF) with improved gene delivery and maintenance of hematopoietic function. In summary, adenovirus vectors can be used to transiently transduce stem cells, and conditions have been defined to maximize expression and limit inhibitory effects on CD34⁺ cells. These data support continued investigation of this vector for local cytokine delivery and purging of stem cell products.     

Down-regulation of bcl-2 is associated with p16INK4-mediated apoptosis in non-small cell lung cancer cells

We introduced a functional p16 cDNA into non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines expressing different combinations of normal and mutated p16, p53, and Rb genes via a recombinant adenovirus to determine the effect of exogenous p16 expression on cell growth. Analysis of p16-deficient cells infected with Adv/p16 identified growth arrest of the cells in the G0 - G1 phase early on. Apoptosis was identified to occur by the 5th day after infection which corresponded with increased p16 expression, reduced Rb expression, and increased Rb hypophosphorylation, but only occurred in cells expressing functional p53. Further analysis indicated that the expression of the anti-apoptotic protein bcl-2 was greatly reduced in the NSCLC cell lines H460 and A549 (both -p16, +p53, +Rb), again only by the 5th day after Adv/p16 infection, but no affect on Bax expression was observed. H1299 cells (-p16, -p53, +Rb) infected with Adv/p16 only exhibited apoptosis by an additional infection with Adv/p53 which also corresponded with a down-regulation of bcl-2. In addition, the infection of A549 cells with Adv/p16 followed by a subsequent infection with Adv/Rb lead to a significant decrease in apoptosis which correlated with an increase in bcl-2 expression. These studies suggest that p16 is capable of mediating apoptosis in NSCLC cell lines expressing wild-type p53, through a direct down-regulation of Rb and an indirect down-regulation of the anti-apoptotic protein bcl-2.