初级纤毛在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞中的作用

目的:研究初级纤毛在白藜芦醇诱导大鼠骨髓基质细胞(MSCs)分化为神经元样细胞中的作用.方法:全骨髓贴壁法分离、培养、纯化MSCs.含15 μmol/L白藜芦醇的无血清DMEM/F12诱导MSCs分化.倒置显微镜下观察细胞形态,免疫印迹检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达.免疫荧光法检测MSCs增殖情况.扫描电子显微镜检测MSCs表面初级纤毛,免疫荧光法检测初级纤毛蛋白(Ac-Tu)的表达.结果:白藜芦醇诱导后60％的细胞胞体收缩,立体感增强,类似神经元.免疫印迹显示MSCs及对照组细胞有NSE蛋白的轻度表达,诱导后NSE、MAP-2蛋白表达阳性,随着诱导时间延长,NSE、MAP-2的表达渐增强.经过24 h饥饿后,90％的MSCs处于生长静止状态.扫描电子显微镜及免疫荧光显示,处于生长静止期的MSCs具有初级纤毛,且白藜芦醇可诱导具有初级纤毛的MSCs分化为神经元样细胞.对照组则无明显变化.结论:白藜芦醇能诱导MSCs分化为神经元样细胞.在此过程中,初级纤毛可能发挥着重要作用.     

间充质干细胞源神经细胞的表型特征及胞质钙离子浓度的变化

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)源神经细胞的特征及其胞质钙离子的变化.方法:利用贴壁法培养大鼠骨髓MSCs, DMSO+BME联合应用将MSCs向神经细胞诱导,检测诱导组细胞巢蛋白、微管相关蛋白-2(MAP2)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)的表达和胞质Ca2+的变化.结果:DMSO+BME联合诱导MSCs 48h后80%以上的细胞变为神经元样形态,胞体发出数个突起,有的似轴突,突起交织成网.诱导后细胞表达神经干细胞的特征性生物学标记Nestin,其表达率在诱导后2h和10h较高,分别为48%和71.4%,而在诱导后48h仅为0.06%;表达神经元特异性标志物MAP2、 NSE和NF,其表达率分别为88.6%、 87.1%和85.8%.诱导后细胞内Ca2+浓度明显增高.结论:MSCs源神经细胞具有神经元的特征,且细胞内钙离子浓度显著升高,提示钙离子介导的信号通路可能参与细胞分化.     

骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞的表型变化

为了研究大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)诱导分化为神经细胞的表型特征,利用贴壁培养法获得骨髓MSCs。化学诱导剂二甲基亚砜(DMSO)和β-巯基乙醇(BME)联合诱导MSCs。免疫组织化学染色检测神经元特异性标志物MAP2、NSE和NF的表达,以及胶质细胞标志物GFAP的表达。硫堇-伊红染色检测细胞内Nissl体。结果表明,DMSO和BME联合诱导MSCs后48h,80%以上的细胞变为神经元样形态,胞体发出数个突起,有的似轴突,突起交织成网。免疫组化结果表明,诱导后细胞表达神经元特异性标志物MAP2、NSE和NF,其诱导率分别为88.6%,87.1%和85.8%。神经干细胞的特征性生物学标记nestin的诱导率在诱导后2h和10h较高,分别为48%和71.4%,而在诱导后48h仅为0.06%。诱导后细胞不表达GFAP。Nissl染色结果表明,诱导后细胞胞质中含有Nissl体。本研究结果证明DMSO和BME联合诱导MSCs可获得具有神经元表型特征的MSCs源性神经细胞。     

隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的： 体外培养猴骨髓间质干细胞（MSCs）并定向诱导分化为神经元样细胞。 方法： 体外分离培养猴MSCs，流式细胞仪检测其表面标志，用含隐丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSCs分化为神经元样细胞，免疫细胞化学检测单克隆抗体特异性神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。 结果： 体外培养的猴MSCs表达CD29、CD44、CD105、CD166，并且具有正常的二倍体核型，不随传代而发生改变。bFGF预诱导24 h 后，隐丹参酮可以将MSCs诱导为神经元样细胞，免疫细胞化学显示NSE、NF表达阳性，阳性率分别为68.3％±3.5％、70.3％±1.5％，而GFAP表达阴性。 结论： 隐丹参酮可以在体外将猴MSCs诱导分化为神经元样细胞。     

人脐血MSCs向神经元样细胞分化过程中neurogenin1的表达变化

目的: 探讨人脐血间质干细胞(MSCs)体外向神经元样细胞分化过程中neurogenin 1的表达变化。方法: 常规从人脐血中分离MSCs,采用生长因子EGF和bFGF联合诱导人脐血MSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学法检测诱导前、后神经元表面标志蛋白NF-M、NSE、胶质细胞标志蛋白GFAP和neurogenin 1的表达情况;Western blotting和RT-PCR法检测诱导前、后人脐血MSCs中neurogenin 1蛋白和mRNA的表达变化。结果: 诱导前,人脐血MSCs不表达NF-M、NSE和GFAP;诱导7 d,人脐血MSCs可以分化为神经元样细胞, 同时表达NF-M、NSE和GFAP。诱导前,人脐血MSCs不表达neurogenin 1,诱导后neurogenin 1蛋白和mRNA表达显著增加。结论: Neurogenin 1可能参与了体外诱导人脐血MSCs向神经细胞分化的过程。     

骨髓间充质干细胞分化神经元后多巴胺D2受体的表达

目的:检测骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)分化为神经元后多巴胺D2受体(dopamine receptor D2,DRD2)的表达,探讨体外分化神经元的基本功能。方法:采用密度梯度离心法和贴壁培养的方法分离纯化MSCs,流式细胞仪检测MSCs表面标志,DMSO/BHA/FSK作为诱导剂来诱导分化;硝酸银染色法检测神经纤维丝,RT-PCR和免疫细胞化学法检测NSE、DRD2 mRNA及蛋白的表达情况。结果:分离纯化的MSCs经流式细胞仪检测显示CD34、CD45表达阴性;间充质干细胞相对特异性标志CD44强阳性表达;加入诱导剂后,MSCs形成多极神经元的形态。银染色法显示神经纤维丝阳性表达,RT-PCR显示诱导后细胞表达NSE、DRD2 mRNA,免疫组化显示NSE、DRD2蛋白表达阳性。结论:MSCs分化为神经元后可以表达神经受体DRD2。     

黄连素诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:黄连素体外定向诱导SD大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。方法:用全骨髓细胞悬液体外扩增和纯化骨髓间质干细胞。选用第5代以后骨髓间质干细胞进行诱导分化,用含10 μg/L碱性细胞生长因子(bFGF)的完全培养液预诱导24 h,后更换含黄连素的无血清DMEM诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元烯醇酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间质干细胞体外扩增第5代后细胞形态达到均一,成梭形。加黄连素诱导1h-8 h,间质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,形似神经细胞。免疫组化显示诱导的神经元样细胞NSE、NF表达阳性,GFAP阴性。结论:黄连素可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

二甲基亚砜体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

目的 探索二甲基亚砜（DMSO）体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的方法。方法 取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,应用终浓度为1.0%的DMSO定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学、激光扫描共聚焦显微镜技术检测结蛋白（desmin）,α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、心肌特异性肌钙蛋白（C-TnT）的表达,透射电镜观察超微结构。结果 MSCs经体外诱导后分化的细胞均阳性表达desmin、α-sarcomeric actin、C-TnT。透射电镜下可见到平行排列的肌丝和丰富的粗面内质网。结论 大鼠骨髓间充质干细胞体外在DMSO诱导下可以定向分化为心肌样细胞。     

NT-3基因修饰及维甲酸预诱导的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处分化为神经元样细胞的研究

目的 探讨移植在脊髓损伤处的神经营养素-3(NT-3)基因修饰及维甲酸(RA)预诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的潜能.方法 将MSCs、RA诱导的MSCs、LacZ基因修饰的MSCs、NT-3基因修饰的MSCs和NT-3基因修饰及RA预诱导的MSCs分别立即移植到脊髓全横断处(T10脊髓),术后67d取材和冷冻切片,用免疫荧光组织化学染色方法检测MSCs的分化潜能,计算各细胞移植组脊髓损伤处的MSCs分化为神经元样细胞的百分率.结果 移植的MSCs在受损伤的脊髓内可分化为神经干细胞(nestin阳性)、神经胶质样细胞(GFAP阳性)和神经元样细胞(NF和MAP2阳性),有些还可以向含有某种神经递质和有形成突触潜能的神经元样细胞分化(ChAT、5-HT和PSD95阳性).联合应用NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在受损伤的脊髓内更有效地提高MSCs向神经元样细胞分化的百分率.结论 NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在脊髓损伤处更好地分化为神经元样细胞.     

体外培养诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为肌样细胞的实验研究

目的:体外培养并诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)分化为肌样细胞。方法:采用常规技术对SD鼠MSCs进行体外培养传代、鉴定、诱导分化和免疫组化、透射电镜检测分析。结果:流式细胞仪检测, 细胞表达CD29和CD44, 不表达CD11b和CD45;经一定浓度5-氮杂胞苷和两性霉素B诱导分化后细胞desmin和myoglobin染色阳性;电镜观察肌样细胞胞浆靠胞膜缘可见无细胞器的条状肌丝区带。结论:传代贴壁生长的梭形细胞为MSCs。MSCs可能具有表达肌细胞的特异性启动或分化调控基因;5-氮胞苷等化合物可使DNA的胞嘧啶去甲基化, 从而诱导MSCs向肌源性细胞分化。临床有运用MSCs治疗肌萎缩性疾病的前景。     

诱导大鼠间充质干细胞形成的神经元样细胞的形态特征

目的 研究诱导大鼠骨髓间充质于细胞(MSCs)形成的神经元样细胞的形态特征.方法 通过贴壁法培养鉴定大鼠骨髓MSCs,体外培养扩增纯化后加入新生鼠脑匀浆上清诱导48 h.倒置显微镜和透射电镜下观察诱导前后细胞的形态结构变化,免疫细胞化学方法鉴定诱导后细胞的性质.结果 倒置显微镜下可见MSCs呈纺锤形和多角形,核居中,有1或2个核仁,诱导后细胞呈神经元样,细胞伸出较长的轴突样和树突样突起;免疫组织化学方法显示NSE、NF阳性,GFAP阴性.透射电镜下可见诱导前MSCs胞质较丰富,有较多的细胞器,细胞核呈圆形或椭圆形,也可见不规则形核,核染色质较疏松,有明显核仁,多为1个.有的MSCs表面可见较多的微绒毛.诱导后细胞胞质丰富,细胞核多为不规则形,染色质疏松,核仁较大,1～3个不等,细胞表面有发达的微绒毛.结论 MSCs是一种多分化潜能的细胞,诱导后分化成为具有成熟细胞器的神经元.     

骨髓间质干细胞定向分化的实验研究

为了探讨体外定向诱导人骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的机制,本研究将分离的人MSC进行体外扩增培养,并观察脑心舒定向诱导MSC分化为类神经元样细胞的效应。在光镜下观察细胞形态,用免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志。结果显示人MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。脑心舒诱导120min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、nestin呈阳性和GFAP阴性。上述结果提示人骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

人脐带间充质干细胞的富集及向神经细胞的诱导分化

目的:寻找一种稳定、高效的分离人脐带间充质干细胞(MSCs)的方法,并探讨脐带MSCs向神经细胞方向分化的可能性。方法:分别采用组织块贴壁法和双酶消化法分离人脐带MSCs,对比其培养成功率;BrdU掺入实验检测脐带MSCs的增殖能力;流式细胞仪检测脐带MSCs表面分子标志;采用丹参联合生长因子的方法诱导其向神经细胞分化,免疫荧光方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:组织块贴壁法获得脐带MSCs成功率高;BrdU阳性标记率达90%以上;流式细胞仪检测显示细胞表达CD29、CD44和CD90,不表达CD34;脐带MSCs经诱导分化,伸出长突起,呈神经元样细胞改变,且表达神经元标志性蛋白NSE、MAP2。神经胶质细胞标志性蛋白GFAP表达较少。结论:成功建立了高效、稳定的脐带MSCs分离培养方法。脐带MSCs经诱导可向神经细胞方向分化,为临床移植治疗神经系统疾病提供了理想的细胞来源。     

体外诱导人脐静脉间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

探讨来源于人脐静脉内皮及内皮下分离的间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的可能性,以期为脐静脉MSCs的神经移植提供理论依据。通过在无菌条件下收集正常足月剖宫产新生儿脐带并对脐静脉进行胶原酶消化,将获取的内皮及内皮下贴壁细胞进行培养。经传代培养及免疫细胞化学鉴定后,取第2代细胞用β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导其向神经元方向分化,并以免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果表明脐静脉经胶原酶消化后的贴壁细胞主要表现为间充质样细胞和内皮细胞;传2代后,间充质样细胞可得到纯化和扩增。免疫细胞化学染色显示诱导前细胞不表达血管性血友病因子(vWF),诱导后MSCs表达巢蛋白(nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE),而不表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。以上结果提示,来源于脐静脉内皮及内皮下的MSCs在体外可以培养、扩增,并具备在诱导剂的作用下向神经元样细胞分化的潜能,可作为神经系统疾病细胞移植治疗的备选来源。     

丹参诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化

目的:探讨骨髓间充质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs)向神经细胞分化中神经蛋白分子及相关基因的表达情况。方法:分离提取大鼠的MSCs,体外培养扩增。用含丹参的无血清的L-DMEM培养基进行诱导,并以不含丹参的无血清L-DMEM培养基作为对照。提取两组的MSCs总RNA,RT-PCR检测ngn-1、mash-1的表达。结果:丹参诱导90 min后,细胞发生了明显的形态学变化,大多数细胞转变为类似双极或多极神经元样形态,伸出轴突或树突样突起。免疫细胞化学显示诱导后的MSCs表现为nestin、NSE、GFAP染色阳性,对照组为阴性。未经诱导的MSCs ngn-1,mash-1 mRNA为阴性,诱导后有表达。结论:丹参可诱导大鼠MSCs向神经前体细胞和神经细胞分化。MSCs向神经元样的分化可能与ngn-1,mash-1有关。     

天然脑活素定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的： 探讨天然脑活素（NC）诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的作用。方法: 取6-8周龄SD大鼠,无菌获取胫骨和股骨骨髓,全骨髓贴壁筛选法分离培养并纯化大鼠MSCs,应用天然脑活素诱导MSCs向神经元分化。倒置相差显微镜追踪比较观察分化过程中细胞形态的变化,免疫细胞化学和逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)方法检测神经元特异性标志物：巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。免疫细胞化学检测细胞微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达。结果：经全骨髓贴壁筛选法获得了纯度较高（90%以上）的大鼠MSCs,天然脑活素含药血清诱导分化后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,分别从mRNA和蛋白水平上证实诱导分化后的细胞表达神经元标记物NSE和nestin,不表达神经胶质细胞标记物GFAP。诱导分化后细胞MAP-2的表达明显。结论：天然脑活素可诱导MSCs向神经元样细胞的定向分化。     

骨髓基质干细胞诱导成神经元样细胞分化相关基因的表达

目的:分析骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后相关基因的表达。方法:用β-巯基乙醇诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化,诱导后8 h,提取诱导前后的骨髓基质干细胞mRNA,进行微管相关蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白43(GAP-43)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、中间丝nestin和神经丝(NF)基因的RT-PCR,观察其诱导前后的表达。结果:NSE在诱导前后均有表达, MAP-2、GAP-43、nestin和NF诱导前无表达, 诱导后有表达。结论: 骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化与MAP-2、GAP-43、nestin和NF可能有关。     

神经生长因子转染骨髓间充质干细胞诱导分化成神经样细胞

目的探讨神经生长因子(NGF)转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后的表达及其对MSCs分化成神经样细胞的影响。方法在体外低密度扩增大鼠骨髓MSCs。应用基因重组技术,构建pEGFP-NGF真核表达质粒,并将其转染至MSCs中。免疫荧光标记法检测中间神经丝蛋白(NF-M)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。在荧光显微镜下观察MSCs阳性荧光的表达率、细胞的形态变化和类型。结果MSCs阳性荧光的表达率约为30%。转染后,MSCs呈现多突起,且几个突起之间互相连接成网状,似神经元样的形态。免疫荧光标记法鉴定其中一部分细胞表达NF-M,另一部分细胞表达GFAP。结论转染的MSCs可表达NGF并在含有NGF的微环境中分化成神经样细胞。     

Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的:寻找促进骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。方法:首先体外分离培养大鼠MSCs并传代,形态学观察和流式细胞学检测细胞表型CD44、CD9、CD34和CD45。采用bFGF分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化。免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a和Wnt5a对MSCs向神经元样细胞分化的影响。结果:MSCs为长梭形,CD9、CD44高表达,CD34、CD45低表达。Wnt3a诱导组的Nestin和NSE呈阳性,而GFAP无明显表达,诱导后细胞的活力良好。Wnt5a诱导组Nestin呈弱阳性表达,而NSE及GFAP阴性。RT-PCR结果显示Wnt3a诱导组Nestin在诱导前后均有表达,NSE在诱导后5d可见明显的扩增条带,10d后更加明显。GFAP在诱导10d后出现较弱的扩增条带。Wnt5a组、对照组MSCs在诱导后10dNestin有微弱表达,NSE和GFAP几乎无表达。结论:Wnt3a分子能够促进体外培养的MSCs向神经元样细胞分化。