沉默Smad4基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究降低Smad4表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法：体外培养人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中Smad4 mRNA表达水平;Smad4-shRNA与Scramble-shRNA质粒分别稳定转染Smad4高表达MCF-7细胞,实验分为未转染MCF-7细胞组（正常对照组）,采用Smad4基因沉默组和Scramble组（阴性对照组）;采用CCK-8法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,实时荧光定量PCR（Real-time PCR）法检测增殖相关基因CDKN1A、CDK1和CDK2以及凋亡相关基因Suvivin、bcl-2、caspase3和caspase9 mRNA表达水平。结果：各组细胞增殖能力比较差异无统计学意义（P > 0.05）,各组细胞CDKN1A、CDK1和CDK2 mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）;与正常对照组和阴性对照组比较,Smad4基因沉默组细胞凋亡率明显降低（P < 0.01）,Smad4基因沉默组细胞Suvivin和bcl-2 mRNA表达水平明显升高（P < 0.01）,caspase3和caspase9 mRNA表达水平明显降低（P < 0.05）。结论：Smad4可以通过下调Suvivin和bcl-2的表达、上调caspase3和caspase9表达引起细胞凋亡。     

转化生长因子β对口腔粘膜角化细胞增殖的影响

目的：探讨转化生长因子（TGF－β）对口腔粘膜角化细胞增殖分化的调控作用及其机制。方法：对人口腔粘膜上皮角化细胞（KC）进行分离，传代培养和鉴定，加入含有不同质量浓度的TGF－β培养液培养3d，然后用四唑盐（MTT）比色试验检测TGF－β对KC增殖状况的影响。结果：体外培养KC呈多角形，胞浆内有丰富的张力细丝，表面有大量微绒毛，角蛋白本免疫组化呈阳性。TGF－β在一定的浓度范围内对KC的增殖起抑作用。结论：TGF－β对体外培养的KC增殖有抑制作用。     

Smad7基因转染拮抗TGF-β1对培养肾小管细胞的影响

目的 探讨Smad7基因转染对TGF-β1诱导的小管细胞生长阻滞，细胞凋亡和FN分泌的影响。方法 采用Tfx-50脂质体将小鼠Smad7转染入原代培养的。肾小管细胞，用MTT法观测小管细胞的增殖、流式细胞仪观测其细胞周期的变化；ELISA法测定小管细胞FN的分泌。结果 培养基添加TGF-β1(10ng/ml)48h后，小管细胞增殖能力明显下降，停滞于G1期的细胞数增多，细胞分泌的FN量也明显增高，相反，Smad7基因转染后可明显拮抗TGF-β1对小管细胞的上述作用。结论 Smad7基因转染可明显拮抗TGF-β1对小管细胞的影响，此结果为今后体内Smad7基因治疗研究奠定了基础。     

TGFβ1对转染Smad4／Smad7基因的大鼠系膜细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原表达的影响

目的　探讨Smad4 /Smad7信号蛋白在转化生长因子β1(TGFβ1)作用下对大鼠系膜细胞 (MsC)Ⅰ、Ⅳ型胶原表达的影响。方法　经脂质体介导分别将Smad4 /Smad7基因瞬时转染体外培养的大鼠MsC ,并用免疫荧光、RT PCR和Westernblot法检测其转染成功与否 ;再用Westernblot法分别观察转基因MsC及其在TGFβ1作用下 ,其Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白表达的改变。结果　与转染空载体的MsC相比较 ,转染Smad4基因的MsC ,其Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白表达分别增强 1.2和 1.8倍 ,经TGFβ1作用后升高 1.8和 3.3倍 (P <0 .0 1) ;而转染Smad7基因的MsC ,其Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白表达分别下降 1.4和 1.9倍 ,经TGFβ1作用后则降低 1.7和 2 .4倍 (P <0 .0 1)。 结论　TGFβ1/Smad信号通路可从正反两方面调节MsCⅠ、Ⅳ型胶原蛋白的合成而影响肾小球硬化的进展     

Smad7基因过表达对L02肝细胞株增殖的影响

日的观察外源Smad7基因对L02肝细胞株增殖活性的影响。方法分别以重组腺病毒AdSmad7和对照病毒AdGFP在体外感染L02肝细胞，以RT—PCR和Western—blot检测外源Smad7基因表达情况，MTT法检测L02肝细胞增殖活性，流式细胞仪检测其细胞周期变化。结果AdSmad7体外感染L02肝细胞后，Smad7 mRNA和蛋白水平均显著上调。转化生长因子B(TGFB)可抑制L02细胞增殖，诱导其凋亡。导入外源Smad7可拮抗TGFβ的作用。结论利用AdSmad7导入外源Smad7基因可间接促进肝细胞增殖，抑制其凋亡。     

Smad7基因转染对肺癌细胞生长的影响

目的:初步探讨Smad7基因对肺癌细胞生长的影响.方法:设实验组和对照组.实验组以携带Smad7cDNA的重组腺病毒载体Ad-Smad7转染A549细胞,对照组以空腺病毒载体转染A549细胞.转染后,2组培养基中分别加入TGFβ1继续培养.观察2组A549细胞培养12 d后的克隆形成率,培养第1 d、3 d、5 d、7 d的存活细胞数和培养第7 d的细胞周期.结果:实验组细胞生长速率高于对照组(P＜0.05);实验组克隆形成率(34±7)%高于对照组的(13±3)%(t=10.674,P＜0.01);实验组G0/G1期细胞比例0.67±0.16,低于对照组的0.79±0.11(t=4.836,P＜0.05);S期细胞比例0.19±0.02,高于对照组的0.06±0.01(t=15.357,P＜0.01).结论:Smad7参与了肺癌细胞内的TGFβ信号通路,它可以阻断TGFβ对肺癌细胞的生长抑制作用.     

二氧化硅对人支气管上皮细胞TGF—β1基因产物表达的影响分析

目的分析人支气管上皮细胞（16HBE）在二氧化硅（SiO2）粉尘染毒后TGF-β1基因产物的表达情况,为探索矽肺新的治疗途径提供基础资料。方法以16HBE作为靶细胞,以灭菌SiO2粉尘配置30μg／ml及60μg／ml两种不同浓度的悬浮液（以含10％FBS的DMEM培养基定溶）,以不同浓度的SiO2粉尘悬液分别培养16HBE靶细胞8h、16h、24h、32h,各做三个平行实验孔,同时,做10％FBS的DMEM空白对照;以免疫细胞化学方法检测TGF—β1基因产物的表达。结果在经30ug／ml及60ug／mlSiO2粉尘悬浮液培养8h、16h、24h、32h后,各实验孔16HBE细胞扫描灰度值均较对照组细胞低,结果提示,16HBE细胞经SiO2粉尘染毒后TGF—β1基因产物表达增加。结论体外实验条件下,SiO2粉尘可上调16HBE细胞TGF-β1基因产物的表达。     

miRNA-10a对小鼠肝纤维化细胞增殖及TGFβ1/Smads信号转导通路表达的影响

目的 通过观察肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)小鼠肝组织TGFβ1/Smads信号转导通路的表达与HF进展的关系,探讨微小RNA(microRNA,miRNA)-10a对于HF的作用机制.方法 选用9周龄健康雄性小鼠(C57 BL6/J) 40只,按照数字表法随机分为对照组和HF模型组(观察组),对照组生理盐水5μl/g腹腔注射,每周2次,注射8周;观察组10％ CCL4橄榄油5 μl/g腹腔注射,每周2次,注射8周,制作小鼠HF模型.RT-PCR法检测HF细胞中miRNA-10a表达后,将观察组HF细胞进行培养及miRNA-10a模拟物转染(转染组),CCK-8法检测HF细胞增殖能力,Western blotting检测HF细胞中TGFβ1、Smad7的表达水平.结果 与对照组比较,观察组miRNA-10a表达水平明显增加(P＜0.05);与对照组比较,转染组肝细胞miRNA-10a表达水平明显降低(P＜0.05);与对照组相比,低表达miRNA-10a明显降低观察组TGFβ1的表达水平,提高Smad7的表达水平(均P＜0.05).结论 小鼠HF细胞中低表达miRNA-10a,转染miRNA-10a模拟物可明显促进小鼠HF细胞增殖,其作用机制是通过miRNA-10a调控TGFβ1/Smads信号转导通路促进小鼠HF.     

Smad7对转化生长因子β1诱导的肺泡上皮细胞向间质细胞转变的影响

目的检测转化生长因子（TGF）β1能否在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变（EMT）,以及Smad7基因转染能否阻止此种转变及相关信号转导机制。方法采用脂质体法转染Smad7基因到大鼠肺泡Ⅱ型上皮（RLE-6TN）;实时荧光PCR及免疫印迹法检测转染前后上皮细胞标志物（E—cadherin,CK19）、间质细胞标志物（FN、Vimentin及α—SMA）及Smad信号通路相关蛋白表达变化;相差显微镜观察TGFβ1诱导的肺泡上皮细胞形态改变,其超微结构改变采用透射电镜观察。结果成功转染Smad7到RLE-6TN;转染前,在TGFβ1作用下,RLE-6TN间质标志物的表达在mRNA和蛋白水平上调,而上皮标志物表达下调;转染后,其间质标志物下调的同时上皮标志物上调;转染前RLE-6TN在TGFβ1作用下p-Smad2／3表达上调,转染后其表达无明显改变;形态学上,TGFβ1能诱导肺泡上皮发生EMT,Smad7转染则能阻止EMT;超微结构上,TGFβ1能诱导肺泡上皮特有板层小体变性、肿胀并随其时间延长最终完全消失。结论TGFβ1能在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮向间质细胞转变,其机制部分与Smad信号转导途径相关,Smad7转染能在一定程度上阻止该转变。     

Smad7基因过表达对L02肝细胞株增殖的影响

目的观察外源Smad7基因对L02肝细胞株增殖活性的影响.方法分别以重组腺病毒AdSmad7和对照病毒AdGFP在体外感染L02肝细胞,以RT-PCR和Western-blot检测外源Smad7基因表达情况,MTT法检测L02肝细胞增殖活性,流式细胞仪检测其细胞周期变化.结果 AdSmad7体外感染L02肝细胞后,Smad7 mRNA和蛋白水平均显著上调.转化生长因子β(TGFβ)可抑制L02细胞增殖,诱导其凋亡.导入外源Smad7可拮抗TGFβ的作用.结论利用AdSmad7导入外源Smad7基因可间接促进肝细胞增殖,抑制其凋亡.     

沉默CDK7基因对HepG2细胞株的抗增殖作用

目的 筛选对体外培养HepG2细胞抗增殖作用最强的反义寡脱氧核苷酸(anti-senseoligodeoxynucleotides,ASODN)序列,探讨经二次优化后该ASODN片段的抗增殖作用。方法 根据RNAStructure3.71计算机软件模拟人CDK7mRNA获得的二级结构确定待选ASODN,经OligoWalk程序分析这些片段与mRNA互补时的热力学参数变化,以此优选待筛ASODN,以体外培养人肝癌HepG2细胞为筛选体系获得抗增殖作用最强的ASODN,对该片段分别依次向互补区上、下游错位1~5个碱基获得10条ASODN,经结构优化后进行二次筛选。结果 初筛结果显示互补于人CDK7mRNA第284~303片段的部分硫代修饰ASODN抗增殖作用最强,为(40.4±12.6)%;二次筛选显示互补于第287~306片段的全磷酸硫代修饰ASODN抗增殖作用最强,抑制率为(68.3±2.6)%,半数抑制浓度为(51.9±8.6)nmol/L。结论 筛选得到的ASODN片段可显著抑制体外培养HepG2细胞的增殖,有可能作为先导化合物开发特异性CDK7抑制剂。     

积雪草甙对增生性瘢痕成纤维细胞增殖与Smad7蛋白的影响

目的研究积雪草甙对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及对Smad7蛋白的影响.方法用组织块法培养人瘢痕成纤维细胞.应用流式细胞术、免疫细胞化学、RT-PCR及Western blot技术结合光密度扫描分析,观察积雪草甙对增生性瘢痕成纤维细胞细胞周期、凋亡和Smad7在细胞中的定位及其mRNA和蛋白含量的改变.结果积雪草甙可抑制瘢痕的成纤维细胞从S期进入M期,增加瘢痕成纤维细胞中Smad7 mRNA和蛋白的含量.结论积雪草甙抑制瘢痕的作用可能部分通过增加抑制性Smad7蛋白.     

沉默CDK7基因对HepG2细胞株的抗增殖作用

OBJECTIVE: To screen the antisense oligodeoxynucleotides (ASODN) that inhibit cultured hepatoblastoma HepG2 cell proliferation, and evaluate the antiproliferative potency of modified ASODN. METHODS: ASODN sequences were selected based on the secondary structure of human CDK7 mRNA predicted with RNAStructure 3.71 software. The binding thermodynamics of CDK7 mRNA to ASODN was analyzed by OligoWalk program. The sequences with the strongest effect against cultured HepG2 cell proliferation in vitro were selected, and the fragments complementary to 1-5 bases upstream or downstream to the complementary region were structurally modified and screened. RESULTS: The partial phosphorothioate ASODN complementary to 284-303 region of human CDK7 mRNA was the most powerful inhibitor, and the antiproliferative activity reached 40.4+/-12.6%; in the second round of screening, the antiproliferative activity of the full phosphorothioate ASODN complementary to the 287-306 region of the mRNA on HepG2 cells was 68.3+/-2.6%, with IC50 of 51.9+/-8.6 nmol/L. CONCLUSION: Proliferation of HepG2 cells can be significantly inhibited by the screened ASODN, which might be used as a lead compound in the development of specific CDK7 inhibitors.     

RNAi沉默Smad4基因表达对人前列腺癌细胞增殖的影响

目的 观察RNA干扰技术沉默Smad4基因表达对人前列腺癌细胞增殖能力的影响,探讨Smad4在前列腺癌恶性进展中的作用.方法 用半定量RT-PCR和Western blot方法检测LNCaP、PC-3、DU145以及ARCaP亚细胞系IF11、IA8等多种不同前列腺癌细胞Smad4 mRNA及蛋白表达的情况,筛选出Smad4基因阳性表达的细胞;针对Smad4基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),脂质体介导瞬时转染阳性表达Smad4的细胞,转染后48 h分别用RT-PCR和Western blot检测Smad4 mRNA及蛋白表达水平的变化,用MTT法检测沉默Smad4表达对细胞增殖的影响.结果 检测的5种前列腺癌细胞中仅LNCaP、PC-3、DU145 3种细胞表达Smad4 mRNA及蛋白;选择PC-3细胞做siRNA转染,与阴性对照序列组(siRNA-NC)相比,转染48 h后,转染SiRNA1、SiRNA2、SiRNA3的3组PC-3细胞的Smad4 mRNA表达水平均显著下降,但仅有siRNA3组Smad4蛋白表达水平显著降低.转染SiRNA3沉默Smad4基因表达后PC-3细胞的体外增殖能力显著增强(P＜0.05).结论 不同前列腺癌细胞Smad4基因的表达存在差异,靶向siRNA下调Smad4的表达可增强前列腺癌细胞的增殖能力.     

Gli1小分子干扰RNA对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究锌指转录因子Gli1小分子干扰RNA(siRNA)对人胰腺癌PC-2细胞的增殖和凋亡的影响。方法:筛选出最佳的靶向Gli1siRNA转染人胰腺癌PC-2细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹分别从mRNA和蛋白水平检测抑制效果,四甲基偶氮唑蓝(MTT)和TUNEL+PI双染流式细胞检测Gli1被抑制后细胞增殖和细胞凋亡的情况。结果:Gli1siRNA能在mRNA和蛋白水平下调人胰腺癌细胞株PC-2中Gli1基因的表达,以转染72h时最显著。Gli1表达被抑制后,转染后72h时PC-2细胞生长受到明显抑制,凋亡细胞显著增多。结论:Gli1与胰腺癌细胞的生长和凋亡密切相关,抑制胰腺癌细胞中Gli1表达可抑制胰腺癌细胞生长,促进胰腺癌细胞凋亡。     

沉默Dnmt1基因对结肠癌细胞株HT-29细胞增殖及细胞周期的影响

目的 利用RNA干扰技术研究沉默DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,Dnmt1)对结肠癌细胞株HT-29细胞增殖及细胞周期的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 利用LipofectamineTM 2000将Dnmt1 siRNA转染HT-29细胞,实验中将细胞分为3组:未处理组、对照siRNA组和Dnmt1 siRNA组.利用CCK-8试剂盒和流式细胞术分别研究其对HT-29细胞增殖和细胞周期的影响,进一步通过Real-time PCR和Western blotting技术研究与增殖和周期相关基因表达的变化.结果 与未处理组和对照siRNA组相比,Dnmt1 siRNA组中HT-29细胞的增殖受到明显的抑制(P<0.05).Dnmt1 siRNA组中HT-29细胞在G0/G1期的比率高达66.93%,高于未处理组和对照siRNA组中HT-29细胞在G0/G1期的比率(分别为53.45%和54.71%)(P<0.05).此外,与未处理组和对照siRNA组相比,Dnmt1 siRNA组中HT-29细胞的cdk2,cyclin D1和cyclin E基因的mRNA和蛋白的表达明显下调(P<0.05).结论 干扰Dnmt1能明显诱导HT-29细胞周期静止,其可能的机制与cdk2,cyclins D1和cyclin E基因的表达下调密切相关,操纵该基因有可能成为新的结肠癌的分子治疗靶点.     

Effects of Mitofusin-2 Gene on Cell Proliferation and Chemotherapy Sensitivity of MCF-7

In order to evaluate the effect of mitofusin-2 gene （mfn2） on proliferation and chemotherapy sensitivity of human breast carcinoma cell line MCF-7 in vitro, pEGFPmfn2 plasmid carrying full length of mitofusin-2 gene was transfected, by using sofast, into MCF-7 cells. Mitofusin-2 gene expression in MCF-7 cells transfected by sofast after 48 h was detected by PCR and Western blotting, and the stable expression of GFP protein in MCF-7 cells by Western blot analysis. The proliferation of MCF-7 cells was assayed by MTT and cell counting. By using PI method, the effects of mfn2 on the cell cycle distribution of MCF-7 were measured. Annexin-Ⅴ/PI double labeling method was employed to detect the changes in apoptosis induced by chemotherapeutics before and after transfection. The results showed that the MCF-7 cells transfected with mfn2 gene could stably and highly express GFP protein. MTT assay revealed that after transfection of mfn2 cDNA, the proliferation of MCF-7 cells was significantly inhibited. DNA histogram showed that cells arrested in S phase, and the percentage of S phase cells was 42.7, 17.2 and 19.6 in mfn2 cDNA transfection group, blank plasmid transfection group and blank control group, respectively （P〈0.05）. The apoptosis ratio of the cells transfected with mfn2 gene was increased from 3.56% to 15.95%, that of the cells treated with camptothecin （CAMP） followed by mfn2 gene transfection was 69.6%, and that in blank plasmid transfection group and blank control group was 31.0% and 23.4% respectively （P〈0.05）. It was suggested that transfection of mfn2 gene could significantly inhibit the proliferation of MCF-7 cells and promote their sensitivity to CAMP with a synergic effect.     

siRNA沉默Bmi-1基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的探讨siRNA沉默B细胞特异的莫洛尼白血病病毒插入位点1基因(Bmi-1)表达对宫颈癌细胞增殖的影响研究。方法通过脂质体转染siRNA Bmi-1及阴性对照(control)到人宫颈癌Hela细胞,采用Realtime PCR及western blot法检测细胞中Bmi-1的表达。MTT法检测细胞活力,Annexin V-PI流式双染及Hoechst染色检测细胞凋亡情况,流式细胞术检测细胞周期,western blot法检测细胞中p16,p53,Cyclin D1及Rb的表达。结果与Control组比较,siRNA Bmi-1组细胞中Bmi-1蛋白及mRNA表达量皆显著降低(P0.01),同时细胞活力下降,细胞凋亡率提高(P0.01),细胞周期阻滞在G1期(P0.01),细胞中p16表达量上调(P0.01),p53及Cyclin D1表达量下调(P0.01),Rb磷酸化水平降低(P0.01)。结论 Bmi-1具有抑制宫颈癌Hela细胞增殖的作用,可能与调控细胞周期相关蛋白表达有关。