大鼠激素性股骨头坏死的基因组学研究

目的 通过基因芯片寻找大鼠激素性股骨头坏死组织中表达变化的基因,尝试探讨激素诱发股骨头坏死的始动因素和分子机制.方法 2007年1月至2010年2月,选取20只成年健康Wistar大鼠随机分为对照组和模型组,每组10只.模型组大鼠腹腔注射大肠杆菌内毒素后,于左侧臀肌注射大剂量甲泼尼龙的方法建立激素性股骨头坏死模型;对照组大鼠腹腔注射大肠杆菌内毒素后,于左侧臀肌注射相同剂量生理盐水.6周后取各组大鼠的左侧股骨头标本进行组织病理学观察确认造模成功后,抽提各组大鼠股骨头组织mRNA,经反转录获得大鼠股骨头组织cDNA探针,进行基因芯片检测.检测结果经荧光定量聚合酶链反应(PCR)验证,并用基因本体(gene ontology,GO)分类方法对差异表达的基因进行分析.结果 与对照组相比,模型组有190条基因的表达存在显著变化,其中52条基因上调表达,138条基因下调表达.这些差异表达基因中102条基因为已知基因(已在GeneBank中登录),88条为未知基因.已知基因根据其生物学功能可被分为:氧化应激、细胞凋亡、信号转导、细胞外基质和脂代谢等基因家族.RT-PCR验证结果与基因芯片检测结果相符.结论 激素性股骨头坏死的发生发展是多种因素、多条途径相互作用的复杂的动态过程.实验结果提示,下调表达基因明显多于上调表达基因,说明在此过程中细胞功能发生了简化;差异表达基因中尚有很多未知基因,说明激素性股骨头坏死还有很多未知领域.     

骨质疏松大鼠股骨内单次注射辛伐他汀强化骨骼的实验研究

 目的 研究骨质疏松骨骼局部注射辛伐他汀刺激成骨的效果, 探索疏松骨骼局部给药预 防脆性骨折的治疗方法。 方法36 只3 月龄雌性SD 大鼠双侧卵巢切除后加低钙饮食3个月, 制备大鼠 骨质疏松模型。实验大鼠随机分为3 组, 每组12 只, 分别在实验大鼠的左侧股骨髓腔内单次注射辛伐 他汀溶液5 mg、10 mg, 对照组单纯注射空白载体。分别在术后1 个月及术后5 个月每组随机处死半数 大鼠(n=6)并取材。双能X 线骨密度仪测定骨密度、Micro-CT扫描并定量分析骨组织形态改变、骨生物 力学测试研究骨骼力学性能的变化。 结果 辛伐他汀局部注射后1 个月和5 个月, 辛伐他汀注射组的 骨密度、骨微结构参数如骨皮质厚度、骨小梁密度及连接率明显优于对照组, 股骨髁及股骨颈的力学性 能明显高于对照组。单次注射辛伐他汀的局部骨强化效果至少持续5 个月, 对照组骨量则持续丢失, 力 学性能持续降低。 结论 疏松骨骼单次注射小剂量辛伐他汀可强效而持久地促进皮质骨形成及骨小梁 改建, 改善骨骼微结构, 增加骨密度及骨强度, 可作为强化局部、防治骨质疏松骨折的新选择。     

重组腺相关病毒介导 VEGF 和 BMP 双基因共表达对兔早期激素性股骨头坏死的修复作用

 目的 探讨重组腺相关病毒介导 VEGF 和 BMP 双基因共表达对兔早期激素性股骨头坏死的修复作用。方法制备兔早期激素性股骨头坏死模型,经 MRI 筛选的成模动物随机分为 rAAV-IRES-hrGFP（AAV-GFP）、rAAV-hVEGF₁₆₅- IRES-hrGFP（AAV-VEGF）、rAAV-hBMP-7-IRES-hrGFP（AAV-BMP）及 rAAV-hVEGF₁₆₅-IRES-hBMP-7（AAV-VEGF/BMP）四组。通过髓芯减压手术分别将四种重组腺相关病毒载体直接注射入各组髓芯减压区内（25 μl/侧）。注射 12 周后分别应用 Western blot 检测、HE 及免疫组织化学染色、MR 检查、核素骨扫描、股骨头血管墨汁灌注冰冻切片、Micro-CT 及股骨头生物力学检测等方法综合评估重组腺相关病毒载体对兔早期激素性股骨头坏死的修复作用。结果 兔早期激素性股骨头坏死模型成模率可达 73.33%。病毒注射 12 周后,rAAV-hVEGF₁₆₅-IRES-hBMP-7 载体有效表达 hVEGF₁₆₅及 hBMP-7 基因,并产生 hVEGF₁₆₅及 hBMP-7 目的蛋白;体内表达的 hVEGF165 目的蛋白通过增加股骨头内新生血管数量改善血供,促进了骨坏死区组织代谢;体内表达的 hBMP-7 目的蛋白通过增加股骨头区骨矿物质密度,促进髓芯减压后骨生成。AAV-VEGF/ BMP 组重组腺相关病毒载体较 AAV-VEGF 组及 AAV-BMP 组更有效地提高了兔早期激素性股骨头坏死的修复效果。结论 hVEGF₁₆₅和 hBMP-7 双基因共表达重组腺相关病毒载体通过增加股骨头的血供及增强股骨头骨质量,对兔早期激素性股骨头坏死具有良好的修复作用。     

家兔激素性股骨头缺血坏死血管壁中差异表达基因的研究

目的 运用基因芯片技术,筛选激素影响的血管壁中主要生长因子基因的差异表达情况,进一步探讨激素性股骨头缺血坏死的发病机理. 方法中国大白兔25只.随机分为对照组(n=5),内毒素组(n=10)和模型组(n=10),利用大肠杆菌内毒素及甲泼尼龙诱导股骨头缺血坏死模型,分别取旋股内侧动、静脉,提取组织总RNA,与含有122个兔基因的寡核苷酸基因芯片杂交、洗涤、染色和扫描,分析检测数据. 结果在检测的122个基因中,差异显著的基因动脉有10个,静脉有27个,生物学信息分析发现这些基因大部分与血管生成、炎症免疫、骨化相关. 结论激素在导致股骨头缺血坏死的过程中降低了血管壁中主要促血管生长因子的转录,进而影响了其在血管壁中的生物活性.     

蛋白酶体抑制剂对骨关节炎大鼠NF-κB 信号通路的影响

 目的 观察蛋白酶体抑制剂MG-132 对骨关节炎软骨及滑膜组织NF-κB 信号通路的影响。方法 SD大鼠144 只, 离断前十字韧带及内侧半月板建立膝关节骨关节炎模型, 随机分为四组: MG-132 组, 造模术后24 h于膝关节腔内注射100 μl 质量浓度为0.007 g/L的MG-132 溶液;DMSO(二甲基亚砜, Dimethyl sulfoxide)组, 造模术后24 h于膝关节腔内注射100 μl 体积分数为0.1% 的DMSO溶液;假手术组, 仅行关节囊切开;正常对照组, 仅于膝关节腔内注射100 μl 质量浓度为0.007 g/L 的MG-132 溶液。术后2、4 和12 周处死动物, 于膝关节软骨组织及滑膜组织取材, 行病理形态学观察, 根据Mankin 评分标准进行半定量评估;应用RT-PCR 法检测NF-κB p65、I-κB、TNF-α、IL-1β等基因mRNA的表达水平;荧光分光光度法检测20S 蛋白酶体活性, 并行相关性分析。结果 MG-132 组各时相的Mankin评分均比DMSO组低, 假手术组与正常对照组相近且较前两组低, 差异有统计学意义。MG-132组各时相的软骨及滑膜组织中NF-κB p65、IL-1β、TNF-αmRNA 表达水平均低于DMSO组, 除2 周滑膜组织NF-κB p65 和12 周软骨组织IL-1βmRNA外差异均有统计学意义。MG-132 组术后2 周软骨组织及4 周滑膜组织I-资B mRNA表达水平高于DMSO 组, 差异有统计学意义。结论 MG-132 具有减轻滑膜炎症、保护关节软骨的作用, 从而延缓骨关节炎进程。     

显微CT观察右归饮对鼠激素性股骨头坏死预防作用的实验研究

目的:用显微CT观察右归饮对鼠激素性股骨头坏死的预防作用。方法:将25只SD大鼠采用随机数字表分成激素组(A组)10只、右归饮组(B组)10只和正常对照组(C组)5只。A组和B组大鼠腹腔注射内毒素2 d后,每周臀肌注射2次甲泼尼龙琥珀酸钠,持续6周;B组大鼠同时每日用中药右归饮灌胃,持续8周;C组不做任何处理。第10周处死25只大鼠,用显微CT扫描鼠离体股骨头,观察右归饮对鼠激素性股骨头坏死的预防作用。结果:A、B两组相比,BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、BS/TV、DA差异均有统计学意义,而SMI差异无统计学意义。A、C两组相比,BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、BS/TV、DA、SMI差异均有统计学意义。结论:从BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、BS/TV、DA指标可以观察出右归饮对鼠激素性股骨头坏死有一定的预防作用。     

蛋白激酶Cξ蛋白通路调控周期性牵张应力促进成骨细胞增殖的研究

 目的 探讨蛋白激酶Cξ(protein kinases Cξ, PKCξ)蛋白通路参与响应调控周期性牵张应 力促进成骨细胞增殖的相关机制。 方法无菌环境下, 组织分离法培养SD大鼠成骨细胞, 应用BioDynamic 细胞应力加载系统对第三代大鼠成骨细胞进行单轴周期性牵张应力加载, 形变量为2%, 加载频 率为0.25 Hz, 单轴向周期性牵张应力180 min(即实验组);应用同样的方法加载以PKCξ特异性经典抑 制剂Myristoylate 预处理的成骨细胞(即经典抑制剂组);使用同样的培养加载方式形变量为0%单轴向 周期性牵张应力180 min(即静态对照组)。应用流式细胞术检测大鼠成骨细胞的细胞周期表达, 并使用 免疫印迹法(Western blotting)、免疫荧光法分别检测实验组、经典抑制剂组和静态对照组大鼠成骨细胞 内转导蛋白通路PKCξ与磷酸化PKCξ(p-PKCξ)的表达。 结果 与静态对照组、经典抑制剂组相比, 单 轴向周期性牵张应力可以使大鼠成骨细胞S 期显著前移, 并显著上调大鼠成骨细胞转导蛋白通路PKCξ 与p-PKCξ的表达;同时, 抑制剂可以明显抑制p-PKCξ活化, 从而抑制PKCξ的表达。 结论 成骨细胞 PKCξ蛋白通路参与感知周期性牵张应力刺激, 并调控促进大鼠成骨细胞增殖, 是力学信号传导通路中 重要的环节。     

骨髓间质干细胞复合脱钙骨基质和骨形态发生蛋白行兔腰椎横突间融合

 目的 探讨骨髓间质干细胞复合脱钙骨基质和骨形态发生蛋白进行兔腰椎横突间融合的效果。
方法 体外分离、培养骨髓间质干细胞,复合于脱钙骨基质材料,以骨形态发生蛋白进行成骨化诱导。日本大耳白兔60只,随机分为三组,A组以骨髓间质干细胞+脱钙骨基质+骨形态发生蛋白、B组以脱钙骨基质、C组以自体髂骨行L_5,6横突间融合。术后8周取腰椎标本,评估植入材料融合情况;行DR片灰度分析,计算成骨密度及成骨面积;行CT扫描三维重建观察横突间融合形态。HE染色分析横突间融合组织结构。
结果 大体可见A组及C组植入材料与宿主横突融合,融合组织质地硬,形态不规整;B组横突间植入材料大部分被吸收。DR片示A组与C组横突间呈高密度影,成骨密度不均;B组未达到骨性融合。CT示A组与C组融合标本有明显的连续骨痂通过横突间区;B组未见连续骨痂。A组成骨密度和成骨面积均高于B组,与C组无差异。组织学观察示A组与C组大量软骨形成,靠近横突处新生骨小梁形成;B组横突间连接主要为纤维组织。
结论 骨髓间质干细胞复合脱钙骨基质和骨形态发生蛋白行兔腰椎横突间融合,其成骨能力接近自体髂骨,优于单纯应用脱钙骨基质。     

骨肉瘤血清蛋白标志物的初步研究

 目的 利用 Link-test统计方法整合分析基因芯片和蛋白质质谱分析数据寻找骨肉瘤血清蛋白标志物。方法利用基因芯片检测从骨肉瘤细胞系(MG-63、Saos-2和 U-2 OS)中筛选骨肉瘤候选标志基因;运用蛋白质质谱分析技术分析 27个骨肉瘤患者血清标本及 47个健康人的血清标本, 从中筛选差异具有统计学意义的蛋白质质谱峰;采用 Link-test统计方法对筛选到的骨肉瘤候选标志基因和蛋白质质谱峰进行相关性分析, 得到交叉验证的骨肉瘤血清蛋白标志物;运用免疫印迹法比较一种候选血清蛋白标志物在骨肉瘤患者和健康人血清中的含量差异。结果利用基因芯片检测到 653个候选骨肉瘤标志基因, 蛋白质质谱分析筛选到 6个蛋白质质谱峰。经 Link-test统计分析, 共鉴定出 13个候选骨肉瘤血清蛋白标志物, 其中包括细胞色素 C(Cytochrome c1, CYC-1)。在 13个候选蛋白质标志物中, 12个在骨肉瘤中表达上调, 1个表达下调。免疫印迹实验发现 CYC-1在骨肉瘤患者血清中的含量明显高于健康人, 差异具有统计学意义。结论利用 Link-test统计方法整合分析基因芯片和蛋白质质谱分析数据是寻找骨肉瘤血清蛋白标志物的有效方法, 共发现 13个候选骨肉瘤血清蛋白标志物。     

生物力学因素在激素性股骨头坏死中对软骨细胞的作用

目的建立大鼠激素性股骨头坏死正常负重和超负重模型,探究力学因素在激素性股骨头坏死中对于软骨细胞的作用。方法4月龄健康Wistar大鼠随机分成实验组与对照组。臀肌注射地塞米松磷酸钠(20mg/kg),每周1次,共计8w。实验组,置于1km/h跑步机中,强迫动物跑动,形成股骨头坏死超负重模型;对照组,生理状态下正常负重。分别于2、4、6、8w处死大鼠,取右侧股骨头标本,行免疫组织化学法Bcl-2和MMP-1染色,比较不同组之间的累计光密度(IOD)值。取左侧股骨头行组织病理学检查。结果实验组Bcl-2和MMP-1累计光密度(IOD)与对照组比较,第4周起有明显统计学差异(P0.05)。实验组Bcl-2和MMP-1表达随激素注射时间增加有统计学意义(P0.05),q检验显示实验组Bcl-2和MMP-1表达从4w开始两两之间有统计学意义,8w时表达最多(P0.05)。实验组8w时病理学呈股骨头坏死表现。结论力学因素通过影响Bcl-2和MMP-1的生成,调节着软骨细胞的凋亡,促进软骨组织的改建。     

激素性股骨头坏死骨代谢变化的实验研究

目的　观察激素性股骨头坏死生化指标的变化 ,探讨骨代谢变化在激素性股骨头坏死过程中的作用。方法　健康成年雄性新西兰大白兔 30只 ,随机分为模型组和对照组 ,采用臀肌注射大剂量醋酸氢化泼尼松进行造模。每隔 2周分别测定股骨头羟脯氨酸 (HOP)、氨基已糖 (HOM )、钙 (Ca)及血清钙、钙磷的含量 ,并计算出HOM /HOP、Ca/HOP的比值及血清钙磷乘积 ,同时观察股骨头X线和组织学的变化。结果　模型组羟脯氨酸、氨基已糖、钙含量及HOM/HOP、Ca/HOP比值均明显低于对照组 (P <0 0 5 ,P <0 0 1) ,血清钙、钙磷乘积亦明显低于对照组 (P <0 0 1,P <0 0 0 1) ;X线示模型组股骨头及周围骨小梁变稀疏 ;组织学显示模型组骨陷窝空缺数明显增多 ,骨小梁稀疏细长 ,髓腔内充满增大的脂肪细胞。结论　大剂量激素可引起股骨头骨细胞早期坏死 ,大剂量激素引起股骨头骨代谢变化是骨坏死综合因素之一。     

ATP6i基因干扰治疗大鼠激素性股骨头坏死塌陷的生物力学研究

  目的 探讨ATP6i 基因干扰治疗大鼠激素性股骨头坏死塌陷的生物力学作用机制。方法雄性SD大鼠40只,随机分为空白对照组、实验对照组、 ATP6i SiRNA（+）慢病毒组及ATP6i SiRNA（-）慢病毒组,每组10只。后三组应用大肠杆菌内毒素联合激素注射12周构建激素性股骨头坏死塌陷大鼠模型。建模 后取双侧股骨髁间窝入路,钻孔达股骨颈下,ATP6i SiRNA（+）慢病毒组及ATP6i SiRNA（-）慢病毒组予以ATP6i SiRNA转染干扰ATP6i基因表达治疗,实验对照 组注射等量生理盐水。1个月后取大鼠右侧股骨头行生物力学检测,测量各组股骨头软骨下骨的载荷、应力强度、弹性模量及轴向刚度;取左侧股骨头行病理组 织学检查。结果 ATP6i SiRNA（+）慢病毒组的载荷、应力强度、弹性模量及轴向刚度分别为（307.01±27.34） N、（60.44±5.38） MPa、（125.29±11.16） MPa、（162.42±14.45） N/mm,高于ATP6i SiRNA（-）慢病毒组及实验对照组（P<0.05）。与ATP6i SiRNA（-）慢病毒组及实验对照组相比,镜下观察ATP6i SiRNA（+）慢病毒组的股骨头软骨下骨骨小梁明显增粗,而骨骺线变性、坏死及破坏情况无差异。结论 ATP6i 基因干扰治疗大鼠激素性股骨头坏死塌陷能明显 抑制破骨细胞的泌酸活性,改善股骨头的生物力学性能。     

大鼠激素性坏死股骨头Runx2、Osterix表达的变化

目的：研究大鼠激素性坏死股骨头内Runx2、Osterix基因表达和蛋白合成动态变化,探讨与骨合成代谢的关系。方法：用臀肌注射糖皮质激素和强迫负荷运动的方法制作股骨头坏死大鼠模型,HE染色确定模型诱导成功,提取大鼠股骨头内总RNA及总蛋白,行实时荧光定量PCR及Western blot检测,研究激素性股骨头坏死时股骨头内Runx2、Osterix基因表达、蛋白合成的动态变化。结果：造模8、10、12周时,模型组大鼠股骨头内Runx2和Osterix基因表达、蛋白合成较正常组减少,两者mRNA的表达量分别为正常组的0.9621、0.3259、0.0512和0.9661、0.2026、0.0194倍,且随时间推移两者的基因表达、蛋白合成呈下降趋势。结论：激素性股骨头坏死早期,股骨头内Runx2、Osterix mRNA表达和蛋白合成降低,抑制骨形成。     

Oxidative Stress Induced Osteocyte Apoptosis in Steroid‐Induced Femoral Head Necrosis

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of Glucocorticoids (GCs) induced oxidative stress and apoptosis on necrosis of the femoral head in patients and rats.MethodsEight patients with steroid‐induced avascular necrosis of the femoral head (SINFH) and eight patients with developmental dysplasia of the hips (DDH) were enrolled in our study. In animal model, twenty male Sprague‐Dawley rats were randomly divided into two groups (SINFH group and NS group). The SINFH model group received the methylprednisolone (MPS) injection, while control group was injected with normal saline (NS). MRI was used to confirm SINFH rat model was established successfully. Then, the rats were sacrificed 4 weeks later and femoral head samples were harvested. Histopathological staining was preformed to evaluate osteonecrosis. TUNEL staining was performed with 8‐OHdG and DAPI immunofluorescence staining to evaluate oxidative injury and osteocyte apoptosis. Immunohistochemistry staining was used to detect Nox1, Nox2, and Nox4 protein expression.ResultsMRI showed signs of typical osteonecrosis of femoral head in SIHFH patients. Histopathological staining showed that the rate of empty lacunae in SINFH patients was significantly higher (56.88% ± 9.72% vs 19.92% ± 4.18%, T = −11.04, P < 0.001) than that in DDH patients. The immunofluorescence staining indicated that the TUNEL‐positive cell and 8‐OHdG‐positve cell in SINFH patients were significantly higher (49.32% ± 12.95% vs 8.00% ± 2.11%, T = −7.04, P = 0.002, 54.6% ± 23.8% vs 9.75% ± 3.31%, T = −4.17, P = 0.003) compared to the DDH patients. The immunohistochemistry staining showed that the protein expression of NOX1, NOX2 and NOX4 in SINFH patients were significantly increased (64.50% ± 7.57% vs 37.58% ± 9.23%, T = −3.88, P = 0.018, 90.84% ± 2.93% vs 49.56% ± 16.47%, T = −5.46, P = 0.001, 85.46% ± 9.3% vs 40.69% ± 6.77%, T = −8.03, P = 0.001) compared to the DDH patients. In animal model, MRI showed signs of edema of femoral head in MPS group, which represents SINFH rat model was established successfully. Histological evaluation showed the rate of empty lacunae in MPS group was significantly higher (25.85% ± 4.68% vs 9.35% ± 1.99%, T = −7.96, P < 0.001) than that in NS group. The immunofluorescence staining indicated that the TUNEL‐positive cell and 8‐OHdG‐positve cell (in MPS group were significantly increased (31.93% ± 1.01% vs 11.73% ± 1.16%, T = −32.26, P < 0.001, 47.59% ± 1.39% vs 22.07% ± 2.45%, T = −22.18, P < 0.001) compared to the NS group. The immunohistochemistry staining showed that the expression of NOX2 in MPS group was significantly increased (76.77% ± 8.34% vs 50.32% ± 10.84%, T = −4.74, P = 0.001) compare with NS group.ConclusionOur findings indicated that GC‐induced NOXs expression may be an important source of oxidative stress, which could lead to osteocyte apoptosis in the process of SINFH     

激素致股骨头骨细胞坏死、凋亡及对bcl-2表达影响的实验研究

目的：探讨激素性股骨头坏死的发病机制。方法：选用健康成年大白鼠30只，体重约200g，随机分为实验组(冲击注射地塞米松)和对照组。实验8周处死动物，取股骨头作骨细胞组织病理学、超微结构观察，并用TUNEL及免疫组化技术分别检测骨细胞凋亡和bcl-2表达情况。结果：光镜下实验组较对照组股骨头骨小梁变细、稀疏、空骨陷窝明显增多，脂肪细胞增大。电镜下实验组骨细胞体积缩小，核固缩，线粒体及高尔基体肿胀，染色质边聚较多见。实验组凋亡骨细胞增多，bcl-2表达骨细胞轻度增加。结论：激素性股骨头坏死是骨细胞凋亡和坏死共同作用的结果。     

活血化瘀中药对激素性股骨头缺血坏死模鼠TGF-β1表达的实验研究

目的：观察活血化瘀中药对激素性股骨头缺血性坏死大鼠转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响,进一步探讨其防治激素性股骨头坏死的作用机制。方法：采用清洁级SD大鼠40只,随机分为空白组4只和模型组36只．模型组每周2次腹腔注射醋酸泼尼松龙24．5mg／kg,经6周诱导出早期激素性股骨头缺血坏死的模型,空白组每周2次腹腔注射同等剂量的生理盐水。6周后处死空白组4只和模型组4只,进行光、电镜观察,确定造模成功。随后将其余32只模型组大鼠再随机分为治疗组16只和对照组16只,分别灌服桃红四物汤和生理盐水,于灌胃后第6、8周检测血清中TGF-β1的含量;检测股骨头局部TGF-β1mRNA的转录及股骨头局部TGF-β1的表达。结果：①图像分析仪分析：治疗组股骨头局部TGF—β1较对照组表达明显增强,两组有明显差异（P〈0．01）。②血清TGF-β1含量检测：治疗组血清中TGF-β1的表达增强,与对照组相比有明显差异（P〈0．01）。③股骨头局部TGF-β1 mRNA的转录：治疗组在第6周时表达即增强,在第8周时表达又降低,而对照组在第6周时表达减少,在第8周时未检测到TGF-β1 mRNA的表达,两组有明显差异（P〈0．05,P〈0．01）。结论：活血化瘀中药可促进激素性股骨头缺血坏死模鼠股骨头局部TGF-β1 mRNA的转录水平以及股骨头局部TGF-β1的表达,促进坏死股骨头的修复。