甲基化转移酶抑制剂治疗急性髓系白血病的研究进展

深入研究肿瘤表观遗传学发现,DNA甲基化异常在血液肿瘤的发生和转化中起着重要作用.地西他滨是一种去甲基化药物,具有抑制甲基化转移酶的作用,在骨髓增生异常综合征和白血病的治疗中具有很好的疗效.地西他滨的表观遗传学治疗在急性髓系白血病治疗中的地位也日益重要.笔者就甲基化转移酶抑制剂治疗急性髓系白血病的研究进展进行综述.     

急性髓系白血病SFRP4基因启动子区异常甲基化研究

目的研究急性髓系白血病中SFRP4基因启动子区的异常甲基化状态,探讨其与急性髓系白血病发生的关系。方法应用甲基化特异性PCR法对99例急性髓系白血病患者的骨髓或外周血进行SFRP4基因启动子区甲基化状况检测,并以70例门诊普通患者的外周血作为对照。结果 99例急性髓系白血病患者中有17例SFRP4基因的启动子区发生了甲基化,甲基化率为17.2%;而正常对照组中未检出SFRP4基因启动子区的甲基化。SFRP4基因在急性髓系白血病患者中的甲基化率极显著的高于正常对照(P<0.001)。SFRP4基因的甲基化状态与急性髓系白血病患者的年龄、性别及临床分型间均未出现显著相关性(P>0.05)。结论 SFRP4基因启动子区的异常甲基化与急性髓系白血病的发生有相关性,SFRP4基因的甲基化可能是引起急性髓系白血病的分子机制之一。     

急性髓系白血病患者dapk基因启动子甲基化改变的研究

本研究旨在分析中国人群急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者死亡相关蛋白激酶(deathassociated protein kinase,DAPK)基因启动子的甲基化状况及其临床相关性。应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术对112例AML患者骨髓标本dapk基因甲基化状态进行检测。结果表明:13例对照组均未发生dapk基因启动子甲基化,而112例AML患者中82例(73.2%)发生dapk基因甲基化,dapk基因甲基化改变与患者的性别、年龄、白细胞、血红蛋白、血小板计数、AML分型以及染色体异常等结果均无相关性(p0.05)。结论:dapk基因甲基化是AML中的一个常见分子事件。     

FLT3基因表达水平及内部串联重复突变与急性髓系白血病的关系及临床意义

目的 研究FLT3基因表达水平及内部串联重复(internal tandem duplication,ITD)突变与急性髓系白血病(AML)的关系及临床意义.方法 采用实时定量RT-PCR技术检测129例AML患者治疗前后共152份骨髓标本单个核细胞FLT3 mRNA,应用RT-PCR技术检测其中75例初发未治AML患者的FLT3/ITD突变.结果 80例初发未治AML患者FLT3 mRNA表达水平为0.1041(0～33.8736),10名正常人骨髓FLT3 mRNA表达水平为0.0020(0.0006～0.0040),差异有统计学意义(P=0.001).75例初发未治AML患者检出FLT3/ITD突变者11例,突变率14.7%,FLT3/ITD突变组的FLT3 mRNA表达水平为0.2200(0.0297～33.8736),与FLT3/ITD阴性组[0.0975(0～26.2200)]比较,差异无统计学意义(P=0.093).在M,患者中,FLT3/ITD阳性者缓解率显著低于FLT3/ITD阴性者(P=0.015).FLT3/ITD阴性的非M3患者中FLT3 mRNA高表达组(表达水平>0.04)患者的化疗缓解率(37.5%)显著低于低表达组(缓解率100%).追踪观察20例患者,完全缓解组的FLT3 mRNA表达水平迅速或缓慢下降至少1个对数级,未缓解组的FLT3 mRNA表达水平无明显变化.结论 AML患者FLT3 mRNA的表达量及FLT3/ITD突变,可作为评价AML患者治疗效果、估计预后的指标,为微量残留病监测、观察AML患者病情变化提供有用工具.     

急性髓系白血病E-cadherin基因表达和CpG岛甲基化状态的研究

目的 探讨急性髓系白血病（AML）患者中上皮钙黏附素（E-cadherin）基因表达及其甲基化状态。方法 分别用RT-PCR和流式细胞术方法检测55例AML患者骨髓细胞和7份正常对照骨髓细胞中E—cadherin基凶和蛋白的表达，并用甲基化特异性PCR方法分析E—cadherin基因5’端CpG岛的甲基化状况。结果 55例AML患者骨髓细胞中E-cadherinmRNA和蛋白表达阳性率分别为23．6％和18．2％，较正常对照组明显下调（P值均〈0．01）；E—cadherin基因5’端甲基化的阳性率为69．1％。E-cadherin mRNA和蛋白表达阴性的31例患者中，29例（93．5％）E—cadherin甲基化阳性，其蛋白水平和mRNA表达水平与启动子甲基化呈明显负相关（P〈0．01）。7份正常对照骨髓细胞E—cadherin mRNA和蛋白表达均为阳性，E—eadherin基因的CpG岛无明显甲基化。结论 AML的粒系分化成熟障碍可能与E—cadherin基因表达下调有关。5’端CpG岛的甲基化可能影响E-cadherin基因表达。     

地西他滨对急性髓系白血病细胞增殖和凋亡的影响

目的:探索地西他滨对急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)细胞增殖和凋亡的影响,并分析它对细胞增殖的调控作用.方法:体外培养AML细胞系THP?1和U937,根据预实验结果,地西他滨1μmol/L分别作用于AML细胞系THP?1和U937,于药物作用后24 h,48 h,72 h及96 ...     

白血病细胞系中抑癌基因PTEN启动子区甲基化状态检测及其去甲基化研究

目的 探讨抑癌基因PTEN表达沉默的机制及诱导PTEN表达对白血病细胞的作用.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation specific PCR,MSP)检测白血病细胞系HL-60、Nalm-6、Raji、KG-1a、U937、NB4、K562中PTEN基因启动子区域甲基化状态;用甲基化转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理白血病细胞,MSP检测甲基化状态的改变、RT-PCR检测PTEN mRNA水平的改变、瑞特染色观察细胞形态学改变、膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V/PI)标记染色检测细胞凋亡.结果 检测的白血病细胞系中HL-60、Nalm-6、Raji、KG-1a、U937细胞PTEN基因显示超甲基化状态,而NB4和K562细胞显示低甲基化状态;5-Aza-CdR处理HL-60和Nalm-6细胞后,PTEN基因甲基化降低、mRNA表达水平则逐渐增高,并呈剂量依赖性,细胞出现凋亡现象.结论PTEN基因启动子区异常甲基化可能导致该基因转录表达失活或沉默,甲基化抑制剂可以诱导PTEN表达,并引起白血病细胞凋亡.     

急性白血病Id4基因启动子区甲基化状态研究

本研究探讨正常人和不同疾病状态急性白血病（AL）患者Id4基因启动子区甲基化状态差异。采用甲基化特异性聚合酶链反应（MS—PCR）对正常人和AL患者骨髓进行Id4基因启动子区甲基化状况检测。结果表明：Id4基因在正常骨髓中呈完全性非甲基化状态，初治AML和ALL患者中Id4基因甲基化比例分别为84％和86％。8例复发难治的AL患者中Id4基因全部甲基化，14例Id4基因甲基化的完全缓解ALL患者中有8例在12个月内复发，而9例Id4基因非甲基化的完全缓解ALL患者中12月内复发仅1例；Id4基因呈甲基化状态的完全缓解的AML患者中12个月内复发率为62．5％，而在非甲基化的患者中12个月内复发率仅为10％，两者差异有显著性意义。完全缓解的ALL患者甲基化比例为64．3％，而完全缓解的AML患者甲基化比例为28．6％，两者差异有显著性意义。39例初治AL中。有33例Id4基因呈甲基化状态，8例复发难治的AL患者的Id4基因均呈甲基化状态，58例完全缓解的AL中。有24例Id4基因呈甲基化状态。结论：与正常人不同，AL患者中Id4基因都发生了不同程度的甲基化改变，缓解状态患者的甲基化比例低于非缓解状态患者，Id4基因甲基化模式的改变与AL的发生密切相关。     

恶性血液病患者mdr1基因启动子区甲基化状态及其与表达的关系

为了探讨多药耐药 (mdr1)基因启动子区的甲基化状态及其与表达的关系 ,采用甲基化敏感的HpaⅡ酶切结合竞争性定量PCR检测 5 4例急性白血病 (AL)和 9例多发性骨髓瘤 (MM)患者mdr1基因启动子区位于转录起始点上游 - 110和 - 5 0bp处两个CCGG位点 (I区和Ⅱ区 )的甲基化率 ;半定量RT PCR检测mdr1基因的表达水平。结果显示I区、Ⅱ区及总甲基化率均与表达呈负相关 ,I区比Ⅱ区相关密切 (r分别为 - 0 .6 4和 - 0 .4 0 )。低甲基化组(n=36 )mdr1高表达率显著增高 (P <0 .0 0 1)。与化疗敏感组 (n =8)相比 ,耐药组 (n=16 )I区 (P =0 0 5 )、Ⅱ区 (P <0 .0 5 )和总甲基化率 (P <0 .0 5 )均减低。与未化疗组 (n =36 )相比 ,化疗后组 (n =14 )I区和总甲基化率均减低 (P <0 .0 5 ) ,Ⅱ区甲基化率也减低 ,但无统计学意义 (P >0 .0 5 )。化疗后组随甲基化率减低 ,mdr1表达升高 ,但尚无统计学意义 (P =0 .0 6 )。结论 :AL和MM患者骨髓mdr1基因表达水平与基因转录起始点上游 - 110和- 5 0处两个CCGG位点的甲基化程度呈负相关 ,且与 - 110处关系更密切。化疗后及耐药病人mdr1基因甲基化水平相对降低。化疗后mdr1基因表达增高与其甲基化水平降低有关。     

聚合酶链反应方法检测急性白血病p15基因高度甲基化

目的 探讨ｐ１５基因高度甲基化在急性白血病发病中的作用。方法 用甲基化敏感的限制性核酸内切酶消化结合聚合酶链反应技术。结果 在３６例急性白血病患中有２２例（６１．１％）存在ｐ１５基因高度甲基化,其中２６例急性非淋巴细胞白血病（ＡＮＬＬ）有１７（６５．４％）,１０例急性淋巴细胞白血病有５例（５０．０％）存在ｐ１５基因高度甲基化。结合临床资料分析,有ｐ１５基因甲基化的ＡＮＬＬ患有较高的外周血白细胞     

p15INK4B甲基化与骨髓增生异常综合征患者预后及地西他滨疗效的关系

目的 通过检测初诊骨髓增生异常综合征(MDS)患者p15INK4B甲基化水平,观察地西他滨治疗前、后p15INK4B甲基化状态变化,探讨p15INK4B甲基化水平与预后的关系及其对地西他滨疗效的影响.方法 261例初诊MDS患者,其中男143例,女118例,中位年龄52(32 ～78)岁.低危组172例(低危104例、中危-1 68例),高危组89例(中危-2 52例、高危37例).收集患者骨髓单个核细胞,采用甲基化特异性PCR (MSP)检测p15INK4B甲基化水平,按p15INK4B甲基化程度对患者进行生存分析.采用MSP方法分别检测58例MDS患者地西他滨治疗前及治疗2个疗程后骨髓p15INK4B甲基化水平,分析p15INK4B甲基化对地西他滨疗效的影响.结果 低危组患者p15INK4B甲基化水平明显低于高危组患者(117.22对157.63,P＜0.05).p15INK4B甲基化阳性患者2年预期生存(OS)率低于阴性患者(69.8％对91.8％,P＜0.05);在低危组,p15INK4B甲基化阳性患者2年预期OS率低于阴性患者(78.2％对92.0％,P＜0.05);在高危组,p15INK4B甲基化阳性患者OS率及中位OS时间与阴性患者比较差异无统计学意义[35.6％对38.5％,(17.0±9.3)个月对(18.0±5.7)个月,P＞0.05].COX分析结果显示p15INK4B甲基化水平是OS时间的独立预后因素.治疗前p15INK4B甲基化阳性组患者地西他滨治疗的总反应率及完全缓解率与阴性组比较差异无统计学意义(65.9％对76.5％,22.0％对29.4％,P＞0.05).地西他滨治疗有效组p15INK4B甲基化水平在治疗前、后差异无统计学意义(P＞0.05).结论 初诊时p15INK4B甲基化水平高的MDS患者生存时间更短,但p15INK4B甲基化水平对地西他滨疗效无明显影响.     

聚合酶链反应检测急性非淋巴细胞白血病患者FLT3/ITD基因突变及临床意义

目的　探讨急性非淋巴细胞白血病 (ANLL)患者FLT3基因及内部串联重复 (ITD)突变及临床意义。方法　采用聚合酶链反应 (PCR )方法扩增 71例ANLL患者FLT3 /ITD基因突变。结果　 71例ANLL患者中有 65例 ( 91 5% )FLT3基因检测阳性 ,其中有 17例出现FLT3 /ITD基因突变 ,71例ANLL患者FLT3 /ITD基因突变阳性率为 2 3 9%。FLT3 /ITD基因突变阳性ANLL患者外周血白细胞计数及骨髓白血病细胞比例显著高于FLT3 /ITD基因突变阴性ANLL患者 (P <0 0 1和P <0 0 5)。FLT3 /ITD基因突变阳性ANLLCR后 1年内复发率显著高于FLT3 /ITD基因突变阴性组(P <0 0 5)。结论　FLT3 /ITD基因突变可作为部分ANLL患者微小残留病检测的新的基因标记 ;FLT3 /ITD基因突变阳性ANLL常伴外周血高白细胞数、骨髓中高白血病细胞比例及明显增高的复发率 ,FLT3 /ITD基因突变阳性ANLL预后较差     

Id4基因甲基化在急性白血病微量残留病检测中的意义

目的探讨Id4基因甲基化作为检测急性白血病（AL）微量残留病变指标的可行性.方法采用甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）技术对细胞系中不同比例的白血病细胞以及正常人、初诊和完全缓解期的AL患者骨髓进行Id4基因甲基化状态检测.结果MS-PCR方法可在低于1%白血病细胞中检测到Id4基因甲基化.Id4基因在正常骨髓中呈完全性非甲基化状态,初治急性髓系白血病（AML）和急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中甲基化比例分别为84%和86%.Id4基因在完全缓解的ALL患者中甲基化比例达60.9%,高于完全缓解状态的AML患者.Id4基因甲基化检测阳性的14例ALL患者中有8例在12个月内复发,而甲基化检测阴性的9例ALL患者仅有1例复发.Id4基因呈甲基化状态的8例AML患者中有5例在12个月内复发,而Id4基因呈非甲基化的20例AML患者中12个月内仅有2例复发.结论MS-PCR检测Id4基因甲基化有可能作为AL微量残留病的检测方法.     

采用甲基化特异性聚合酶链反应研究急性白血病p15基因CpG岛甲基化

目的　探讨ｐ１５ 基因ＣｐＧ岛甲基化作为各型急性白血病通用的基因标志物的可行性。方法　采用甲基化特异性聚合酶链反应（ＭＳＰ）法检测４０ 例初治或复发急性白血病、５ 例完全缓解期白血病及８ 例（ 份） 正常骨髓的ｐ１５ 基因ＣｐＧ岛甲基化,并对ＭＳＰ产物进行序列测定。结果　急性白血病患者ｐ１５ 基因ＣｐＧ岛甲基化阳性率为８０％ ,ＡＭＬ与ＡＬＬ的阳性率（分别为８３％ 和７３％） 差异无显著性;５ 例完全缓解期白血病患者中１ 例ｐ１５ ＣｐＧ岛甲基化阳性（该例患者不久白血病复发）;正常骨髓８ 例均为阴性,表明ｐ１５ ＣｐＧ岛甲基化为白血病细胞所特有;ＭＳＰ产物测序结果与理论结果相符合,ＭＳＰ敏感度可达１０ －３。结论　ｐ１５ ＣｐＧ岛甲基化在各型急性白血病中均有很高的发生率,可以作为各型急性白血病通用的微量残留病（ＭＲＤ） 指标;白血病完全缓解期ｐ１５ ＣｐＧ 岛甲基化仍为阳性可能预示着复发;ＭＳＰ法ＤＮＡ需要量极少,不需要有特异性酶切位点,无同位素污染,对标本要求不高,敏感度高,是甲基化研究的一个简便、敏感、特异的新手段。     

急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征患者NPM基因突变的研究

目的探讨染色体核型正常的急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合征（MDS）患者NPM基因突变。方法染色体核型正常的AML患者40例（初治28例，首次完全缓解期12例），MDS患者33例，用基因组DNAPCR法扩增NPM基凶第12外显子，PCR产物纯化后直接测序，发现突变患者，将PCR产物克隆至pUCm—T载体，转化大肠杆菌DH5α，至少挑选5个以上重组克隆，小量制备质粒后进行测序。结果共发现NPM突变患者6例（AML4例，MDS2例），A型突变4例，B型突变1例，新发现突变1例（命名为R型）。结论新发现了一个NPM突变类型，并在国内外首次证实MDS患者也存在NPM基凶突变，为进一步研究NPM突变与AML及MDS发生的关系提供了重要线索．     

急性髓系白血病患者NPM1基因突变分析

目的研究成人急性髓系白血病（AML）患者的NPM1基因第12外显子突变的发生率及临床特征。方法采用PCR扩增产物直接测序法或毛细管电泳法检测101例成人AML患者（M0 1例，M1 17例、M2 25例、M3 23例、M4 7例、M5 25例、M6 3例）NPM1基因第12外显子的突变情况，了解NPM1基因突变阳性患者的临床特征。结果101例AML患者中共检出32例（31．7％）具有NPM1基因突变，其中M 01例、M1 9例、M2 7例、M4 2例、M5 13例。59例正常核型AML患者中27例（45．8％）发生NPM1基因突变，明显高于异常核型组（42例中5例，11．9％）（P〈0．001），且多见于M1和M5。NPM1基因突变型患者年龄相对较大（P〈0．05），外周血白细胞高，CD34和CD117表达水平低（P值均〈0．05）。对突变型患者的序列分析发现5种已知的NPM1基因突变类型（分别是A、B、D、NM、PM型突变），在1例患者中还发现了一种新型突变（暂命名为S型）。结论NPM1基因第12外显子的突变多见于正常核型AML患者，M1和M5患者更为多见，突变患者年龄较大，外周血白细胞数量高，并与CD34和CD117低表达相关。