AML-M2a诱导TCR Vβ T细胞的克隆性增殖和细胞毒作用

目的:了解急性髓性白血病(AML)M2a细胞诱导的体外增殖T细胞的特异性杀伤作用和克隆性增殖情况.方法:利用肿瘤细胞-T淋巴细胞混合培养方法(MLTC),分别收集3例经AML-M2a细胞体外诱导不同扩增时间的健康人T细胞,利用LDH释放方法分析其特异性细胞毒作用,同时利用RT-PCR和基因扫描方法分析经AML-M2a细胞诱导前后T细胞的24个TCR Vβ亚家族基因的表达和克隆性情况.结果:在培养第12天和第21天时,1例AML-M2a细胞诱导的3例健康人T细胞对该诱导细胞的平均杀伤率分别为39.88±7.79%和62.14±9.79%,而对AML-M2a患者和健康人外周血T细胞均无杀伤作用.TCR Vβ谱系分析发现诱导后3例健康人T细胞均出现Vβ16的克隆性增殖.结论:AML-M2a细胞可诱导健康人T细胞成为具有克隆性增殖的特异性CTL,并以Vβ16的克隆性增殖为主.     

AML-M_5细胞诱导TCR Vβ T细胞克隆性增殖研究

目的　了解急性髓细胞白血病 (AML)M5亚型细胞诱导T细胞的TCRVβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况。方法　采用混合淋巴细胞 /肿瘤细胞培养 (MLTC)方法 ,用AML M5细胞体外诱导供者外周血和脐血的T细胞增殖 ,用RT PCR扩增经MLTC前后获得细胞的 2 4个TCRVβ亚家族基因的互补决定区 (CDR3) ,了解病人各Vβ亚家族的利用情况。并经基因扫描分析确定M5细胞诱导的T细胞克隆性特点。结果　脐血和供者外周血分别表达 13和 5个TCRVβ亚家族T细胞 ,经MLTC培养初期 ,则表达全部 2 4个Vβ亚家族 ,随着诱导时间的增加 ,诱导T细胞所表达的Vβ亚家族逐渐减少。基因扫描显示AML M5细胞诱导后的T细胞出现寡克隆和双克隆增殖改变 ,主要为Vβ2 1的克隆性增殖T细胞。结论　AML M5细胞可诱导TCRVβT细胞克隆性增殖 ,这可能是对AML M5细胞相关抗原的特异细胞免疫应答的结果。     

AML-M_5细胞诱导TCR Vβ T细胞克隆性增殖研究

目的　了解急性髓细胞白血病 (AML)M5亚型细胞诱导T细胞的TCRVβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况。方法　采用混合淋巴细胞 /肿瘤细胞培养 (MLTC)方法 ,用AML M5细胞体外诱导供者外周血和脐血的T细胞增殖 ,用RT PCR扩增经MLTC前后获得细胞的 2 4个TCRVβ亚家族基因的互补决定区 (CDR3) ,了解病人各Vβ亚家族的利用情况。并经基因扫描分析确定M5细胞诱导的T细胞克隆性特点。结果　脐血和供者外周血分别表达 13和 5个TCRVβ亚家族T细胞 ,经MLTC培养初期 ,则表达全部 2 4个Vβ亚家族 ,随着诱导时间的增加 ,诱导T细胞所表达的Vβ亚家族逐渐减少。基因扫描显示AML M5细胞诱导后的T细胞出现寡克隆和双克隆增殖改变 ,主要为Vβ2 1的克隆性增殖T细胞。结论　AML M5细胞可诱导TCRVβT细胞克隆性增殖 ,这可能是对AML M5细胞相关抗原的特异细胞免疫应答的结果。     

CML细胞和K562细胞诱导TCR Vβ亚家族T细胞克隆性增殖和杀伤性的研究

目的：了解CML细胞和K562细胞体外诱导CML细胞特异性T细胞的TCRVβ亚家族利用、克隆性培殖和杀伤性情况。方法：采用混合淋巴细胞／白血病细胞培养法(MLTC)体外将CML细胞和K562细胞与脐血和成人外周血MNC混合培养和扩增，运用RT—PCR—基因扫描技术分析其TCRVβ亚家族的利用和克隆性特点，以及应用间接荧光单抗标记技术和LDH法分析诱导增殖的T细胞免疫表型和杀伤性。结果：CML细胞和K562细胞可以诱导出呈寡克隆或寡克隆趋势生长的Vβ亚家族T细胞，并具有识别和杀伤CML细胞的功能。结论：CML细胞和K562细胞可在体外诱导出异体CML细胞特异性CTL，该CTL可能为优势表达的Vβ亚家族克隆性T细胞。     

AML-M6患者外周血TCR Vβ亚家族T细胞限制性增殖情况

 引言多数肿瘤和白血病患者存在细胞免疫缺陷情况 ,通过T细胞受体基因分析各家族基因的表达情况 ,可以进一步明确患者外周血中所缺失的T细胞亚家族的情况 ,而通过T细胞克隆性分析 ,可以了解患者体内是否存在白血病抗原相关的克隆性增殖T细胞 ,从而为白血病特异性免疫治疗提供依据。1　材料与方法1.1　样本　收集经细胞形态学和组织化学按FAB诊断标准确诊的急性髓性白血病M 6型 (AML M 6 )病人 3例 (编号C1 C3) ,10例正常人作为对照。外周血单个核细胞的分离 ,RNA提取和cDNA合成均按常规方法进行。1.2　RT PCR和T细胞克隆性分析　按我们以往研究报道的方法进行操作[1] 。首先利用 2 4个Vβ引物和一Cβ引物分别进行 2 4个PCR反应 ,了解样本中各TCRVβ亚家族的表达情况 ,然后利用 5’端荧光素标记的Cβ fam引物标记PCR产物 ,并进一步经 6 %聚丙酰胺凝胶中电泳 ,经 377ADNA序列仪 (ABI ,PerkinElmer)的基因扫描 6 72分析软件分析产物的长度和荧光素强度 ,从而了解所扩增PCR产物的特点 ,而确定所属Vβ亚家族T细胞的克隆性[1] 。2　结果R...     

克隆性增殖T细胞的检测和研究进展

肿瘤部位出现大量淋巴细胞浸润的病人常有较好的预后，推测这是宿主对肿瘤相关抗原的一种直接反应。目前理想的检测是否存在针对肿瘤细胞的克隆性增殖Ｔ细胞的方法是ＣＤＲ３长度分析法。克隆性增殖了细胞的研究有助于进一步阐明肿瘤免疫机制，并有可能用于过继细胞免疫治疗。     

APL患者外周血TCR VβT细胞克隆性增生特点

目的了解急性早幼粒细胞白血病（APL）患者TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性。方法利用RT—PCR和基因扫描技术分析21例APL患者外周血单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因的CDR3长度,10例正常人作为对照。结果21例患者外周血T细胞所表达的Vβ亚家族数量差别很大,2～21个Vβ家族不等,其中,以Vβ2（71．4％）,Vβ15（61．9％）和Vβ5（57．1％）出现频率较高,而Vβ10,和Vβ14出现频率最低（14．3％）。除2例外,患者外周血均可检测到某些Vβ亚家族的克隆性T细胞,主要为Vβ12,Vβ21和Vβ23克隆性T细胞。结论APL患者外周血Vβ亚家族T细胞的倾斜性分布特点,并存在克隆性增生的T细胞,这可能是机体T细胞受白血病细胞相关抗原的刺激作用而引起机体产生相应的特异性免疫反应。     

利用Genescan分析TCR Vβ亚家族CDR3长度的方法检测AML的T细胞克隆性

目的 分析急性髓性白血病（ＡＭＬ）的Ｔ细胞克隆性，方法 利用反转－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）法分析５例ＡＭＬ，８例正常人的外周血单个核细胞和Ｔ细胞株Ｊｕｒｋａｔ的Ｔ细胞受体ＴＣＲＶβ２４个亚家族的互补决定区３（ＣＤＲ３）长度，ＰＣＲ产物进一步进行基因扫描（ｇｅｎｅｓｃａｎ）和核苷酸序列分析，结果 ＲＴ－ＰＣＲ分析显示８例正常人外周血单个核细胞除Ｖβ２０外，存在各Ｖβ亚家族的Ｔ细胞，而５例病人则仅     

APL患者外周血TCR Vα亚家族T细胞分布和增殖特点

目的:了解急性早幼粒细胞白血病(APL)患者外周血TCRVα亚家族T细胞的分布及其克隆性。方法:利用RT-PCR扩增9例APL患者和10例正常人外周血单个核细胞中29个TCRVα亚家族基因的互补决定区3(CDR3),了解TCRVα亚家族T细胞的分布;阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度,从而了解其克隆性。结果:9例患者外周血T细胞所能检测到的Vα亚家族T细胞分别为1~9个亚家族,以Vα3和Vα19出现频率较高;克隆性增殖T细胞可在8例患者中检测到,以Vα3、Vα26和Vα27出现克隆性T细胞频率较高(3/8)。正常人外周血T细胞中表达绝大多数Vα亚家族,呈多克隆性增殖特点。结论:APL患者外周血Vα亚家族T细胞存在明显的倾斜性分布和克隆性增殖特点,后者可能是对APL细胞抗原的反应性增殖,是否具有特异性杀伤作用,有待进一步检测。     

基因扫描分析一例T—NHL病人外周血的T细胞克隆性

Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）重排时，由于ＶＤ，ＤＪ区之间可有不同数量和序列的核苷酸插入（Ｎ区），故形成一可变的区域（ＶＮＤＮＪ区），称为互补决定区３（ＣＤＲ３）。不同重排（不同克隆）时，其ＣＤＲ３长度不同［１］，利用这一特点，采用基因扫描分析方法检测ＴＣ...     

B-ALL病人TCR Vβ基因谱系和克隆性分析

 目的　了解B ALL病人外周血T细胞的TCRVβ基因谱系及其克隆性增殖情况。 方法　利用RT PCR方法扩增 13例初发未治B ALL病人外周血单个核细胞中 2 4个TCRVβ基因的互补决定区 3(CDR3) ,PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性。结果　 13例B ALL病人分别表达 2～ 18个Vβ亚家族。 13例病人均存在 1个或多个Vβ亚家族的克隆增殖T细胞 ,增殖形式包括寡克隆及寡克隆增殖趋势、双克隆和单克隆。Vβ2 1和Vβ2 3亚家族出现克隆增殖性T细胞的频率较高。结论　B ALL病人外周血T细胞的TCRVβ谱系呈现优势利用的特点 ,并存在克隆性增殖的T细胞 ,这可能是机体对白血病相关抗原产生的特异性免疫反应 ;Vβ2 1和Vβ2 3亚家族T细胞发生克隆增殖改变的趋向性比较明显 ,可能与B ALL相关抗原刺激有关     

CML相关TCRVα亚家族T细胞的克隆性分布特点

 目的 了解慢性粒细胞白血病（CML）患者外周血TCR Vα亚家族T细胞的克隆性分布特点。方法 采用RT-PCR扩增10例CML患者外周血的单个核细胞的TCR Vα29个亚家族基因，分析其TCR Vα亚家族的利用情况。PCR产物进一步经基因扫描分析，了解其CDR3长度以判断T细胞的克隆性。结果 不同病人外周血中所能检测出的Vα亚家族数量不等（1～21个），以Vα3、Vα4、Vα8、Vα10和Vα14为常见，并在Vα1、Vα2、Vα3、Vα4、Vα5、Vα8、Vα10、Vα12、Vα14、Vα15、Vα16、Vα19、Vα21和Vα23中发现克隆性生长T细胞。结论 CML病人外周血T细胞的TCR Vα亚家族选用呈现明显的选择性并出现克隆性T细胞，这可能与机体对白血病相关抗原产生特异性免疫有关，且克隆性增殖Vα亚家族分布以个体特异性为主。     

弥漫大B细胞淋巴瘤患者外周血TCR Vα亚家族T细胞分布和克隆性增生特点

目的 探讨弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBL)患者外周血TCR Vα基因谱系及其克隆性增生情况.方法 用RT-PCR法扩增6例DLBL患者外周血单个核细胞中29个TCRα基因的互补决定区3(CDR3),经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度,确定T细胞的克隆性.结果 6例DLBL患者分别表达20～23个TCRVα亚家族.均存在1个或多个Vα亚家族的克隆增生T细胞,增生形式包括寡克隆、寡克隆增生趋势及双克隆.Vα6和Vα23、亚家族出现克隆增生性T细胞的频率较高(66.7%).结论TCRVα亚家族T细胞出现限制性选用和克隆性增生,可能是机体对淋巴瘤相关抗原产生的特异性免疫反应.     

基因扫描分析CML病人外周血的T细胞克隆性

 应用RT-PCR方法扩增12例CML病人外周血单个核细胞的T细胞受体(CR)Vβ24个亚家族基因的互补决定区3(CDR3), 了解VβT细胞的分布情况, 8例正常人和T细胞株K37作为对照。 PCR产物进一步经基因扫描分析确定T细胞克隆性。 结果发现12例CML外周血中分别表达3－21Vβ亚家族T细胞, 8例正常人则表达除Vβ20外的全部VβT细胞, K37细胞仅表达Vβ9。基因扫描分析显示12例CML中8例病人的部分Vβ亚家族PCR产物至一主峰图象, 提示为克隆性生长的T细胞。 推测这是宿主对白血病细胞相关抗原的一种直接反应。 该方法有可能作为白血病特异性免疫治疗的临床研究的一种新的分子生物学研究方法。     

利用TCRVβ家族CDR3长度分析检测HCL和c-ALL的克隆性增殖T细胞

目的推介检测分析Ｔ细胞克隆性增殖的新方法,探讨判别恶性肿瘤免疫状态的新途经。方法应用ＲＴ－ＰＣＲ检测Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）Ｖβ２４个亚家族的互补决定区３（ＣＤＲ３）长度,并经基因扫描（ｇｅｎｅｓｃａｎ）分析检测３例多毛细胞白血病（ＨＣＬ）和１例普通型急性淋巴细胞白血病（ｃ－ＡＬＬ）病人外周血的Ｔ细胞克隆性。结果４例病人的部分Ｖβ家族的扩增产物出现单峰（单克隆）或—主峰（寡克隆）图像,而正常对照的全部ＰＣＲ产物呈多峰（多克隆）图像。结论ＨＣＬ和ｃ－ＡＬＬ病人外周血中存在克隆性生殖Ｔ细胞,可能是宿主对白血病抗原的一种直接反应。该特点可作为微小残留病变（ＭＤＲ）的检测指标     

利用TCRVβ家族CDR3长度分析检测HCL和c—ALL的克隆性增殖T细胞

推介检测分析Ｔ细胞克隆性增殖的新方法,探讨判别恶性肿瘤免疫状态的新途径。方法应用ＲＴ－ＰＣＲ检测Ｔ细胞受体Ｖβ２４个亚家族的互补决定区３长度,并经基因扫描分析检测３例多毛细胞白血病和１例普通型急性淋巴细胞白血病病人外周血的Ｔ细胞克隆性。     

MiR-374a通过PTEN/AKT信号通路调节乳腺癌细胞的增殖和凋亡

摘 要：［目的］ 探讨miR-374a在乳腺癌细胞增殖和凋亡中的作用,并进一步探讨其机制。［方法］ 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测人乳腺癌细胞MCF-7及正常人乳腺细胞Hs 578Bst的miR-374a及PTEN mRNA转录水平,Western blot法测定MCF-7、Hs 578Bst组细胞及对照、 miR-374a抑制剂组细胞的PTEN、p-AKT蛋白表达变化,用CCK-8法及Tunel法分别观察对照组和miR-374a抑制剂组细胞的增殖和凋亡,并用Western blot法检测两组细胞的凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9表达。［结果］ 与人正常乳腺Hs 578Bst细胞相比,乳腺癌MCF-7细胞的miR-374a表达水平显著性增高（P<0.001）,PTEN mRNA及蛋白的表达水平显著性降低（P<0.001）,而p-AKT蛋白表达水平明显升高（P<0.001）。miR-374a抑制剂可抑制乳腺癌细胞的增殖（P<0.001）,并促进其凋亡的发生（P<0.001）,降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平（P<0.001）的同时活化凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9（P<0.001）。miR-374a 通过靶点PTEN影响AKT通路,miR-374a组细胞PTEN mRNA表达水平显著性降低（P<0.001）,而miR-374a抑制剂处理后,PTEN蛋白水平显著性升高（P<0.001）,p-AKT表达降低（P<0.001）。［结论］ miR-374a在乳腺癌细胞高表达,并通过调节PTEN/AKT信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖,促进凋亡的发生。miR-374a/PTEN/AKT信号通路有望成为乳腺癌的新治疗靶点。     

重组人干扰素α2a和GFE-1多肽融合基因的克隆、表达及活性测定

目的:构建IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因表达载体,获得高质量生物产品。方法:应用聚合酶链式反应技术(PCR)对干扰素(IFN)α2a3'端酶切位点进行改造,人工合成编码能特异性高效结合肺组织的GFE-1寡核苷酸片段,二者连接后克隆入pGEM3Zf质粒,进行序列分析,将融合蛋白基因克隆入pBV220表达载体,在大肠杆菌中表达,对IFN-α2a-GFE-1表达产物纯化、鉴定及体外活性检测。结果:利用PCR的方法成功地改造了IFN-α2a3'端酶切位点,成功的将GFE-1多肽与IFN-α2a3'端连接,构建了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白的基因克隆载体pGEM3Zf-GFE-1,DNA测序完全正确。构建了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因原核表达载体pBV220-IFN-α2a-GFE-1,经温度诱导在大肠杆菌中有效表达。纯化了IFN-α2a-GFE-1融合蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度大95%,比活性达5.8×109U/mg。结论:IFN-α2a-GFE-1融合蛋白基因的成功克隆、表达、纯化和活性测定,为研制一种具有导向性治疗肺癌、肺纤维化等疾病的有效药品奠定基础。     

肿瘤患者T细胞受体多样性和克隆性的高通量测序分析

目的：探讨肺癌和食管癌患者外周血T细胞受体(T cell receptor,TCR)多样性和克隆分布,以及食管癌外周血和肿瘤浸润淋巴细胞中T细胞TCR的差异情况。方法：收集自2019年4月至2021年5月郑州大学第一附属医院未行放、化疗,并排除严重感染性疾病、自身免疫性疾病以及近期使用免疫抑制剂治疗史的8例食管癌、8例肺癌患者的外周血标本,选取其中1例食管癌患者肿瘤组织标本进行TCR测序。17例健康人外周血标本作为对照组。分析肿瘤患者与健康人之间以及早期、晚期肿瘤患者之间TCR多样性指数(D₅₀)、VJ基因使用频率以及CDR3序列克隆型频率的差异。结果：食管癌、肺癌患者外周血TCR CDR3序列的D₅₀值[分别为(0.031±0.028)和(0.077±0.034)],均低于健康人[(0.145±0.057),P<0.000 1和P=0.005 3]。食管癌、肺癌外周血TCR CDR3最大克隆比例[分别为(10.640±7.640)%和(8.334±5.575)%],均高于健康人[(4.070±2.341)%, P=0.003 1和P=...     

miR-26a通过调控E2F7、Myc抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖和迁移能力

目的:研究miR-26a对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和迁移能力的影响,并分析miR-26a 调控增殖与迁移的可能机制。方法:应用实时荧光定量PCR法(QPCR)检测乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞中miR-26a的表达水平,并检测三阴型乳腺癌组织及相应正常乳腺组织中miR-26a与E2F7 mRNA的表达水平。应用脂质体介导的方法,以miR-26a mimics与E2F7 siRNA瞬时转染MDA-MB-231细胞,实时荧光定量PCR法检测miR-26a表达水平,Western blot法检测E2F7、Myc蛋白的表达水平。MTT法检测MDA-MB-231细胞的增殖能力,划痕实验检测MDA-MB-231细胞迁移能力。结果:乳腺癌细胞中miR-26a的表达水平均低于正常乳腺细胞MCF-10A,且三阴型乳腺癌细胞表达水平降低最明显。三阴型乳腺癌组织中miR-26a相对于正常乳腺组织表达减低,而E2F7 mRNA表达则显著升高。miR-26a mimics转染后miR-26a表达水平显著升高,miR-26a过表达可抑制E2F7、Myc蛋白的表达;E2F7 siRNA转染后E2F7表达水平减低,Myc蛋白表达亦减低。MTT实验结果示miR-26a过表达可抑制MDA-MB-231细胞增殖,划痕实验示miR-26a过表达可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力。结论:miR-26a可能通过抑制E2F7、Myc调控乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖与迁移能力。