AML-M2a诱导TCR Vβ T细胞的克隆性增殖和细胞毒作用

目的:了解急性髓性白血病(AML)M2a细胞诱导的体外增殖T细胞的特异性杀伤作用和克隆性增殖情况.方法:利用肿瘤细胞-T淋巴细胞混合培养方法(MLTC),分别收集3例经AML-M2a细胞体外诱导不同扩增时间的健康人T细胞,利用LDH释放方法分析其特异性细胞毒作用,同时利用RT-PCR和基因扫描方法分析经AML-M2a细胞诱导前后T细胞的24个TCR Vβ亚家族基因的表达和克隆性情况.结果:在培养第12天和第21天时,1例AML-M2a细胞诱导的3例健康人T细胞对该诱导细胞的平均杀伤率分别为39.88±7.79%和62.14±9.79%,而对AML-M2a患者和健康人外周血T细胞均无杀伤作用.TCR Vβ谱系分析发现诱导后3例健康人T细胞均出现Vβ16的克隆性增殖.结论:AML-M2a细胞可诱导健康人T细胞成为具有克隆性增殖的特异性CTL,并以Vβ16的克隆性增殖为主.     

AML-M_5细胞诱导TCR Vβ T细胞克隆性增殖研究

 目的　了解急性髓细胞白血病 (AML)M5亚型细胞诱导T细胞的TCRVβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况。方法　采用混合淋巴细胞 /肿瘤细胞培养 (MLTC)方法 ,用AML M5细胞体外诱导供者外周血和脐血的T细胞增殖 ,用RT PCR扩增经MLTC前后获得细胞的 2 4个TCRVβ亚家族基因的互补决定区 (CDR3) ,了解病人各Vβ亚家族的利用情况。并经基因扫描分析确定M5细胞诱导的T细胞克隆性特点。结果　脐血和供者外周血分别表达 13和 5个TCRVβ亚家族T细胞 ,经MLTC培养初期 ,则表达全部 2 4个Vβ亚家族 ,随着诱导时间的增加 ,诱导T细胞所表达的Vβ亚家族逐渐减少。基因扫描显示AML M5细胞诱导后的T细胞出现寡克隆和双克隆增殖改变 ,主要为Vβ2 1的克隆性增殖T细胞。结论　AML M5细胞可诱导TCRVβT细胞克隆性增殖 ,这可能是对AML M5细胞相关抗原的特异细胞免疫应答的结果。     

AML-M_5细胞诱导TCR Vβ T细胞克隆性增殖研究

目的　了解急性髓细胞白血病 (AML)M5亚型细胞诱导T细胞的TCRVβ亚家族限制性利用和克隆性增殖情况。方法　采用混合淋巴细胞 /肿瘤细胞培养 (MLTC)方法 ,用AML M5细胞体外诱导供者外周血和脐血的T细胞增殖 ,用RT PCR扩增经MLTC前后获得细胞的 2 4个TCRVβ亚家族基因的互补决定区 (CDR3) ,了解病人各Vβ亚家族的利用情况。并经基因扫描分析确定M5细胞诱导的T细胞克隆性特点。结果　脐血和供者外周血分别表达 13和 5个TCRVβ亚家族T细胞 ,经MLTC培养初期 ,则表达全部 2 4个Vβ亚家族 ,随着诱导时间的增加 ,诱导T细胞所表达的Vβ亚家族逐渐减少。基因扫描显示AML M5细胞诱导后的T细胞出现寡克隆和双克隆增殖改变 ,主要为Vβ2 1的克隆性增殖T细胞。结论　AML M5细胞可诱导TCRVβT细胞克隆性增殖 ,这可能是对AML M5细胞相关抗原的特异细胞免疫应答的结果。     

PML-RARα多肽诱导脐血TCR Vβ T细胞增殖研究

 目的 了解PMLRARd多肽诱导脐血T细胞的T细胞受体（TCR）V8谱系表达和克隆性情况。方法 以不同浓度（16．7μg／mL，33．3μg／mL或50μg／mL）的PML-RARα多肽联合IL-2、抗CD3单抗以及抗CD28单抗诱导脐血T细胞增殖，利用RT-PCR-基因扫描技术分析诱导后第3、6、9、12天后的脐血TCRV8亚家族的利用和克隆性增殖的特点。结果 限制性表达和克隆性增殖TCR Vβ亚家族T细胞可见于PML-RARα多肽诱导后脐血T细胞。结论 PML-RARα多肽可在体外诱导脐血T细胞呈克隆性增殖，此优势增殖的克隆性T细胞可能具有特异性细胞毒作用。     

CML细胞和K562细胞诱导TCR Vβ亚家族T细胞克隆性增殖和杀伤性的研究

目的：了解CML细胞和K562细胞体外诱导CML细胞特异性T细胞的TCRVβ亚家族利用、克隆性培殖和杀伤性情况。方法：采用混合淋巴细胞／白血病细胞培养法(MLTC)体外将CML细胞和K562细胞与脐血和成人外周血MNC混合培养和扩增，运用RT—PCR—基因扫描技术分析其TCRVβ亚家族的利用和克隆性特点，以及应用间接荧光单抗标记技术和LDH法分析诱导增殖的T细胞免疫表型和杀伤性。结果：CML细胞和K562细胞可以诱导出呈寡克隆或寡克隆趋势生长的Vβ亚家族T细胞，并具有识别和杀伤CML细胞的功能。结论：CML细胞和K562细胞可在体外诱导出异体CML细胞特异性CTL，该CTL可能为优势表达的Vβ亚家族克隆性T细胞。     

B-ALL病人TCR Vβ基因谱系和克隆性分析

 目的　了解B ALL病人外周血T细胞的TCRVβ基因谱系及其克隆性增殖情况。 方法　利用RT PCR方法扩增 13例初发未治B ALL病人外周血单个核细胞中 2 4个TCRVβ基因的互补决定区 3(CDR3) ,PCR产物进一步经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度而确定T细胞的克隆性。结果　 13例B ALL病人分别表达 2～ 18个Vβ亚家族。 13例病人均存在 1个或多个Vβ亚家族的克隆增殖T细胞 ,增殖形式包括寡克隆及寡克隆增殖趋势、双克隆和单克隆。Vβ2 1和Vβ2 3亚家族出现克隆增殖性T细胞的频率较高。结论　B ALL病人外周血T细胞的TCRVβ谱系呈现优势利用的特点 ,并存在克隆性增殖的T细胞 ,这可能是机体对白血病相关抗原产生的特异性免疫反应 ;Vβ2 1和Vβ2 3亚家族T细胞发生克隆增殖改变的趋向性比较明显 ,可能与B ALL相关抗原刺激有关     

APL患者外周血TCR VβT细胞克隆性增生特点

目的了解急性早幼粒细胞白血病（APL）患者TCR Vβ亚家族T细胞的分布及其克隆性。方法利用RT—PCR和基因扫描技术分析21例APL患者外周血单个核细胞的TCR Vβ24个亚家族基因的CDR3长度,10例正常人作为对照。结果21例患者外周血T细胞所表达的Vβ亚家族数量差别很大,2～21个Vβ家族不等,其中,以Vβ2（71．4％）,Vβ15（61．9％）和Vβ5（57．1％）出现频率较高,而Vβ10,和Vβ14出现频率最低（14．3％）。除2例外,患者外周血均可检测到某些Vβ亚家族的克隆性T细胞,主要为Vβ12,Vβ21和Vβ23克隆性T细胞。结论APL患者外周血Vβ亚家族T细胞的倾斜性分布特点,并存在克隆性增生的T细胞,这可能是机体T细胞受白血病细胞相关抗原的刺激作用而引起机体产生相应的特异性免疫反应。     

NY-ESO-1致敏树突状细胞诱导的CTL对肝癌细胞株的特异性杀伤作用

目的：探讨肿瘤睾丸抗原NYESO1（New Yorkesophageal1）致敏树突状细胞体外诱导特异性CTL对肝癌细胞株的杀伤作用。方法：重组质粒pGEXESO1经原核诱导表达并纯化GSTESO1融合蛋白肽。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF）和白细胞介素4（rhIL4）诱导培养人外周血来源的树突状细胞（dendritic cells, DCs）,经GSTESO1融合蛋白肽致敏后诱导特异性CTL增殖。以此CTL为效应细胞,分别以NYESO1阳性表达的肝癌细胞株HepG2和不表达NYESO1的肝癌细胞株H2P为靶细胞,MTT法检测CTL对肝癌细胞株的杀伤作用。结果：重组质粒pGEXESO1经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达相对分子质量约36 000的GSTESO1融合蛋白肽,纯化后的质量浓度为50 μg/ml;经rhGMCSF和rhIL4联合诱导成功培养人外周血DCs,其表型分子HLADR为91.4%、CD86为70.5%、CD83为71.2%、CD80为55.3%。NYESO1致敏的DCs能明显诱导CTL增殖,此CTL对肝癌细胞株HepG2的杀伤率显著高于GST刺激组、未致敏DC组和无DC刺激组(均P<0.05),效靶比为50∶1时杀伤效应达到最高峰\[(53.23±3.78)%,P<0.01\];相同条件下CTL对H2P细胞无特异性杀伤作用。结论： NYESO1抗原致敏的DCs在体外可诱导同种CTL产生和增殖,后者对NYESO1阳性肝癌细胞株具有特异性杀伤效应,该方法为肝癌免疫治疗提供了一条新思路。     

CML相关TCRVα亚家族T细胞的克隆性分布特点

 目的 了解慢性粒细胞白血病（CML）患者外周血TCR Vα亚家族T细胞的克隆性分布特点。方法 采用RT-PCR扩增10例CML患者外周血的单个核细胞的TCR Vα29个亚家族基因，分析其TCR Vα亚家族的利用情况。PCR产物进一步经基因扫描分析，了解其CDR3长度以判断T细胞的克隆性。结果 不同病人外周血中所能检测出的Vα亚家族数量不等（1～21个），以Vα3、Vα4、Vα8、Vα10和Vα14为常见，并在Vα1、Vα2、Vα3、Vα4、Vα5、Vα8、Vα10、Vα12、Vα14、Vα15、Vα16、Vα19、Vα21和Vα23中发现克隆性生长T细胞。结论 CML病人外周血T细胞的TCR Vα亚家族选用呈现明显的选择性并出现克隆性T细胞，这可能与机体对白血病相关抗原产生特异性免疫有关，且克隆性增殖Vα亚家族分布以个体特异性为主。     

B细胞非霍奇金淋巴瘤TCR基因重排及CDR3谱型分析

 目的　分析B细胞淋巴瘤穿刺标本中T细胞受体（TCR）β链克隆性基因重排及互补决定区3（CDR3）谱型。方法　应用RT-PCR扩增TCR Vβ24个亚家族的CDR3区基因,并经基因扫描确定T细胞克隆性,对提示单克隆或寡克隆增生亚家族的PCR产物进行测序。结果　3例淋巴瘤患者TCR存在限制性取用,仅表达2～5个Vβ亚家族。所有患者均存在克隆性增生T细胞,增生形式包括寡克隆及寡克隆增生趋势。CDR3区序列分析证实增生的T细胞克隆具有不同的氨基酸序列。结论　B细胞淋巴瘤患者存在T细胞克隆性增生,其TCR Vβ呈限制性取用,不同克隆T细胞的CDR3序列不同。     

乳腺癌患者T细胞受体基因重排及CDR3区序列分析

 目的　分析乳腺癌转移淋巴结穿刺标本中T细胞受体（TCR）β链克隆性基因重排及互补决定区3（CDR3）区序列。方法　应用RT-PCR扩增2例反应性增生淋巴结及3例乳腺癌转移淋巴结T细胞24个TCR Vβ亚家族的CDR3基因,并经基因扫描确定T细胞克隆性,对提示单克隆或寡克隆增生亚家族的PCR产物进行测序。结果　乳腺癌转移淋巴结T细胞中TCR存在限制性取用,仅表达3～5个Vβ亚家族。增生的T细胞存在克隆性特点,增生形式包括寡克隆及多克隆。CDR3区序列分析证实增生的T细胞克隆具有不同的氨基酸序列。结论　乳腺癌转移淋巴结中存在T细胞克隆性增生,其TCR Vβ呈限制性取用,不同T细胞克隆的CDR3序列不同。     

骨髓间充质干细胞治疗慢性移植物抗宿主病后患者外周血T细胞受体Vβ亚家族谱系变化研究

 目的　研究输注骨髓间充质干细胞（MSC）治疗慢性移植物抗宿主病（cGVHD）后患者外周血T细胞受体（TCR）Vβ基因谱系变化及克隆性增殖情况。方法　1例经异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后发生cGVHD的患者接受MSC治疗,分别于第1次输注MSC后第1、5天及第2次输注MSC后第1、10、20天采集外周血,同时将输注的MSC作为对照,利用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法扩增单个核细胞中24个TCR Vβ基因的互补决定区3（CDR3）,PCR 产物经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度,从而确定T细胞的克隆性。结果　患者输注的MSC不表达全部TCR Vβ亚家族,第1次输注MSC后第1天也未发现TCR Vβ亚家族的表达,随后的时间点分别出现了3、10、14、10个Vβ亚家族的克隆增殖T细胞,增殖形式以寡克隆、多克隆为主;临床判断cGVHD表现减轻。结论　MSC对allo-HSCT后患者免疫功能的恢复有一定作用,并能减轻cGVHD效应;TCR Vβ亚家族谱系分析提示有部分优势表达。     

肿瘤患者T细胞克隆性增殖与预后的分析

 目的　通过分析肿瘤患者肿瘤浸润性淋巴细胞 (tumor infiltratinglymphocyte ,TIL)和外周血淋巴细胞 ( peripheralbloodlymphocytes,PBL)中克隆性增殖T细胞的TCRβ基因谱型的分子特征 ,研究T细胞免疫在肿瘤预后中的作用。方法　采用RT PCR及变性聚丙烯酰胺测序凝胶电泳方法扩增并分离TCRβ基因V J重排片断。通过PCR产物直接测序的方法 ,判断T细胞克隆的特征 ,得到CDR3区氨基酸序列。结果　在结直肠癌、肺癌TIL和术前PBL中均发现TCRβ基因的寡克隆性扩增 ,它们在术后的PBL中均消失。具有术前PBL的克隆性增殖T细胞的患者还可能影响肿瘤的预后。结论　肿瘤患者的肿瘤组织和术前外周血中都存在肿瘤肽特异性激活的T细胞克隆 ,T细胞免疫系统的激活在肿瘤的预后中可能起着重要作用     

外周T细胞淋巴瘤TCR基因重排及CDR3谱型分析

 目的　分析外周T细胞淋巴瘤穿刺标本中T细胞受体（TCR）β链克隆性基因重排及互补决定区3（CDR3）谱型。方法　应用RT-PCR扩增TCR Vβ24个亚家族的CDR3基因,并经基因扫描确定T细胞克隆性,对提示单克隆或寡克隆增生亚家族的PCR产物测序分析其CDR3序列。结果　4例淋巴瘤患者TCR表达受到明显抑制,仅表达1～4个Vβ亚家族。所有患者均存在1个或多个Vβ亚家族的克隆增生T细胞,增生形式包括单克隆、双克隆及寡克隆增生趋势。CDR3区序列分析证实增生的T细胞克隆具有不同的氨基酸序列。结论　外周T细胞淋巴瘤患者存在T细胞克隆性增生,其TCR Vβ呈限制性取用,不同克隆T细胞具有不同的CDR3谱型。     

IL-18基因增强肿瘤抗原致敏DC诱导的CTL特异性杀伤肝癌细胞

目的:探讨腺病毒介导的白细胞介素18(IL18）基因转染能否使肿瘤抗原冲击的树突状细胞(dentritic cell,DC) 在体外诱导出更强的抗肝癌免疫反应。方法：携IL18 的重组腺病毒载体感染经肝癌细胞株HepG2冻融抗原致敏的DC(AdIL18HepG2/DC), FACS分析AdIL18HepG2/DC表面分子的表达, ELISA法检测IL18的分泌水平, 3HTdR掺入法检测T淋巴细胞增殖能力, MTT法检测细胞毒性T 淋巴细胞杀伤效应。结果： AdIL18HepG2/DC较未转染DC能高水平地表达CD1a、CD11c、CD80、CD86以及HLADR;较未经IL18转染的DC分泌较高水平的IL18。AdIL18HepG2/DC 能非常有效地刺激自体T 细胞增殖(CPM 值为228 018±1 079),其刺激强度显著强于AdIL18DC、HepG2/DC、AdlzcZ/DC及DC（均P＜0.05）。当靶细胞为HepG2时,AdIL18HepG2/DC诱导的CTL杀伤活性显著高于其他各组（均P＜0.05）,并且其杀伤能力与效应细胞数量成正比。结论： IL18 基因转染且肝癌抗原致敏的DC可以显著增强DC的特异性抗肝癌效应。     

AML-M6患者外周血TCR Vβ亚家族T细胞限制性增殖情况

 引言多数肿瘤和白血病患者存在细胞免疫缺陷情况 ,通过T细胞受体基因分析各家族基因的表达情况 ,可以进一步明确患者外周血中所缺失的T细胞亚家族的情况 ,而通过T细胞克隆性分析 ,可以了解患者体内是否存在白血病抗原相关的克隆性增殖T细胞 ,从而为白血病特异性免疫治疗提供依据。1　材料与方法1.1　样本　收集经细胞形态学和组织化学按FAB诊断标准确诊的急性髓性白血病M 6型 (AML M 6 )病人 3例 (编号C1 C3) ,10例正常人作为对照。外周血单个核细胞的分离 ,RNA提取和cDNA合成均按常规方法进行。1.2　RT PCR和T细胞克隆性分析　按我们以往研究报道的方法进行操作[1] 。首先利用 2 4个Vβ引物和一Cβ引物分别进行 2 4个PCR反应 ,了解样本中各TCRVβ亚家族的表达情况 ,然后利用 5’端荧光素标记的Cβ fam引物标记PCR产物 ,并进一步经 6 %聚丙酰胺凝胶中电泳 ,经 377ADNA序列仪 (ABI ,PerkinElmer)的基因扫描 6 72分析软件分析产物的长度和荧光素强度 ,从而了解所扩增PCR产物的特点 ,而确定所属Vβ亚家族T细胞的克隆性[1] 。2　结果R...     

结直肠癌T细胞克隆TCRβ基因CDR3区氨基酸序列的初步分析

 目的　通过建立结直肠癌肿瘤浸润性淋巴细胞 (tumorinfiltratinglymphocytes ,TIL)和术前外周血 (peripheralbloodlymphocytes ,PBL)中抗肿瘤T细胞克隆的TCRβ基因谱型 ,确定抗肿瘤T细胞克隆的分子特征。方法　采用RT PCR方法扩增结直肠癌TIL和PBL的TCRβ基因的 2 4个不同V家族基因片段 ,经过测序凝胶分离和特殊银染色 ,结合测序结果确定TCRβ基因谱型。 结果　结直肠癌患者具有TIL和 /或PBL中T淋巴细胞的克隆性增殖。有些T细胞克隆表达相同的CDR3区氨基酸基序。CDR3区不同位点具有特征性的疏水性和极性氨基酸以及甘氨酸的分布。结论　通过分析结直肠癌抗肿瘤T细胞克隆特征性的CDR3区氨基酸序列 ,将有益于发现新的抗肿瘤免疫治疗方法。     

双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统的构建及体外效应研究

目的：构建高靶向性基因转移及表达系统，并研究其介导HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法： 通过重组技术分别构建antiTfR ScFvGAL4融合蛋白表达载体ScFvGAL4pET28a及含AFP启动子、GAL4特异性识别序列（GAL4rec）的HSVtk真核表达载体pEBAF/tkGAL4rec。IPTG诱导后，利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tkGAL4rec质粒转染表面均高表达TfR的人肿瘤细胞株HepG2，SMMC7721及A549。潮霉素筛选后，MTT法检测GCV对它们的杀伤作用。结果：双酶切鉴定、SDSPAGE电泳及测序分别证明antiTfR ScFvGAL4融合蛋白及重组pEBAF/tkGAL4rec真核表达质粒构建成功。体外杀伤实验中，高分泌AFP(845 ng/ml) 的HepG2/tk细胞对GCV很敏感，且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关；而低分泌AFP(2 ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感；不分泌AFP 的A549/tk细胞则不敏感。结论：双靶向组织特异性HSVtk/GCV抗瘤系统构建成功，并显示出很好的靶向性。     

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因对肝癌细胞SK-Hep-1黏附和侵袭的影响

摘 要 目的: 肝细胞癌中高表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3基因(glypican3,GPC3)，而在非肿瘤肝组织、肝细胞腺瘤、胆管癌、肝内胆管细胞癌、胆囊癌等细胞中低表达甚至不表达；本研究利用携带GPC3重组真核表达载体，探讨GPC3基因对SKHep1肝癌细胞增殖、黏附和侵袭能力的影响。方法：将pEGFP-N2-GPC3通过脂质体方法转染人肝癌细胞SKHep1。RT-PCR检测GPC3SKHep1细胞中GPC3 mRNA的表达；MTT法检测SK-Hep-1细胞的增殖并计算黏附率；Transwell小室实验检测SK-Hep-1肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力。结果：pEGFPN2GPC3成功转染SKHep1细胞，转染后GPC3-Hep-1细胞明显表达GPC3mRNA。GPC3转染能显著抑制肝癌细胞SK-Hep-1的增殖（P<0.01）；GPC3转染细胞的黏附能力较对照细胞显著下降[（10.21±0.62）% vs (15.51±095)%,P<0.01];GPC3转染细胞的迁徙和侵袭能力较对照细胞明显增强[（131.7±7.44）vs（69.6±5.25），P<0.01;(220±12.8) vs （130±8.2），P< 0.01]。结论：GPC3基因显著抑制肝癌细胞的增殖和黏附能力，但显著增强后者的迁移和侵袭能力。     

APL患者外周血TCR Vα亚家族T细胞分布和增殖特点

目的:了解急性早幼粒细胞白血病(APL)患者外周血TCRVα亚家族T细胞的分布及其克隆性。方法:利用RT-PCR扩增9例APL患者和10例正常人外周血单个核细胞中29个TCRVα亚家族基因的互补决定区3(CDR3),了解TCRVα亚家族T细胞的分布;阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度,从而了解其克隆性。结果:9例患者外周血T细胞所能检测到的Vα亚家族T细胞分别为1~9个亚家族,以Vα3和Vα19出现频率较高;克隆性增殖T细胞可在8例患者中检测到,以Vα3、Vα26和Vα27出现克隆性T细胞频率较高(3/8)。正常人外周血T细胞中表达绝大多数Vα亚家族,呈多克隆性增殖特点。结论:APL患者外周血Vα亚家族T细胞存在明显的倾斜性分布和克隆性增殖特点,后者可能是对APL细胞抗原的反应性增殖,是否具有特异性杀伤作用,有待进一步检测。