绿茶多酚抑制LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖

观察绿茶多酚对低密度脂蛋白(LDL)刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖和p44/42MAPK表达的影响。体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,在LDL(100 μg/ml)刺激时,应用不同剂量的绿茶多酚作用24 h后,采用MTS/PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态。应用流式细胞术测定细胞周期,p44/42磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印迹法测定MAPK蛋白表达。与未经LDL处理的平滑肌细胞相比,LDL可以明显刺激大鼠血管平滑肌细胞的增殖,绿茶多酚对LDL刺激下的大鼠血管平滑肌细胞增殖具有明显的抑制作用(P<0.05),并呈现剂量依赖性。流式细胞术检测表明,绿茶多酚可以使LDL刺激下的大鼠血管平滑肌细胞大部分处于G0/G1期,与LDL组相比有明显差异(P<0.05)。LDL对磷酸化p44/42MAPK蛋白表达有显著的增强作用,此作用可被绿茶多酚抑制。绿茶多酚可明显抑制LDL刺激下的大鼠血管平滑肌细胞增殖和磷酸化p44/42丝裂素活化蛋白激酶的表达。     

胰岛素对NIH3T3细胞生长和Ras-MAPK信号途径的影响

目的 探讨胰岛素激活的Ras-MAPK信号途径对鼠成纤维细胞（NIH3T3细胞）生长的影响。方法 藉四唑蓝比色法（MTT法）和蛋白免疫印迹试验分别观察胰岛素对NIH3T3细胞生长和胞内丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）活性的影响。结果 胰岛素对NIH3T3细胞的促增殖作用呈时间和浓度依赖性，10mU/ml胰岛素对NIH3T3细胞的促增殖作用效果最佳，对NIH3T3细胞作用的EC50是0.2mU/ml(48h);0.14mU/ml(72h)。MAPK在10mU/ml胰岛素刺激1min后即出现酪氨酸磷酸化，10min达到高峰。胰岛素作用10min，MAPK酪氨酸磷酸化程度随浓度增高（0.1,1.0,10mU/ml)而递增。结论 胰岛素对NIH3T3细胞促增殖作用与激活Ras-MAPK信号途径相关。     

TNFα对体外培养的人脂肪细胞葡萄糖摄取和IRS-1酪氨酸磷酸化的影响

[目的]探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)对体外培养的人脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取和胰岛素受体底物1(IRS-1)酪氨酸磷酸化的影响,为多囊卵巢综合征(PCOS)的胰岛素抵抗(IR)病因学研究提供新的实验依据.[方法]脂肪细胞葡萄糖摄取的测定采用3H标脱氧右旋葡萄糖(2-[3H]DG)吸收法,IRS-1酪氨酸磷酸化的检测采用免疫沉淀、Western印迹和增强化学发光蛋白免疫印迹法及图像分析.[结果]①胰岛素(100nmol/L)作用下,TNF α刺激浓度分别为0、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL时,脂肪细胞2-[3H]DG的摄取分别为(652±203)U,(609±172)U,(511±135)U和(404±168)U,当TNFα刺激浓度达20 ng/mL时,脂肪细胞对葡萄糖摄取的降低有显著性差异(P＜0.05).②胰岛素(100nmol/L)刺激下IRS-1的酪氨酸磷酸化在TNFα(5 ng/mL)作用时(74.50%±16.86%)较无TNFα作用(94.00%±14.70%)有所降低,但无显著性差异;当TNFα刺激浓度分别为10 ng/mL(31.16%±10.44%)和20 ng/mL(27.33%±9.63%)时,胰岛素(100nmol/L)刺激后IRS-1的酪氨酸磷酸化明显降低(P＜0.001).[结论]①TNFα刺激浓度的升高可抑制体外培养的人脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取.②TNFα可抑制体外培养的人脂肪细胞胰岛素刺激的IRS-1的酪氨酸磷酸化,并存在一定的量效关系,可能阻碍了胰岛素的受体后信号传导并与IR有关.     

人类重组型酸性成纤维细胞生长因子促分裂效应及其信号转导途径的推测

[目的]通过比较野生型及重组型酸性成纤维细胞生长因子(waFGF,raFGF)对NIH3T3细胞促分裂活性的差别,推测其信号途径的异同,从而评价促分裂性;同时,通过检测肝素(HS)对这两种生长因子生物学活性的影响,评价其在模仿机体内环境中的作用.[方法]应用MTT法检测细胞的促分裂活性.应用Western blot和RT-PCR分别检测FGF1受体磷酸化和Fos基因表达.[结果]raFGF对细胞增殖的作用明显低于waFGF,在5～80mg/mL范围内最为明显(P＜0.001);HS均可促进两种因子对细胞的增殖作用,但raFGF+HS组明显低于waFGF+HS组(P＜0.05).waFGF通过核转位和MAPK两种途径发挥促分裂活性,而raFGF则只通过MAPK发挥促分裂性.[结论] raFGF的促分裂作用低于waFGF;肝素对这两种因子的促分裂性具有促进作用;waFGF通过核转位和MAPK两种途径发挥促分裂活性,而raFGF则只通过MAPK发挥促分裂性.     

cAMP对胰岛素刺激的NIH3T3细胞丝裂原激活蛋白激酶活性的抑制作用

目的 探讨cAMP-PKA信号途径对胰岛素激活的Ras-丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号途径的影响。方法 以3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)提高细胞内环腺苷酸(cAMP)浓度，藉四唑蓝比色法(MTT法)和蛋白免疫印迹试验分别观察cAMP对胰岛素刺激的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)的生长增殖和胞内丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)活性的影响。结果 IBMX(0．5mmol/L)抑制静息的和胰岛素(10mU／mL)刺激的NIH3T3细胞的增殖，作用呈时间依赖性。在胰岛素(10mU／mL)刺激的NIH3T3细胞，MAPK出现酪氨酸磷酸化；而以IBMX(0．5mmol/L)预处理细胞30min后，再以胰岛素作用10min，胰岛素刺激的MAPK的酪氨酸磷酸化受抑制。结论：cAMP可通过抑制MAPK磷酸化活化对NIH3T3细胞增殖起抑制作用。     

二烯丙基二硫化物诱导人肺癌细胞凋亡机制

目的研究大蒜提取物二烯丙基二硫化物(DADS)诱导人非小细胞性肺癌细胞H1299凋亡及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)对此过程的影响,探讨DADS抗肿瘤的可能机制。方法用MTT法检测DADS处理24 h后H1299细胞活性;用蛋白质印迹法测定H1299细胞内磷酸化-p42/44 MAPK的表达。结果与对照组相比,DADS呈浓度依赖性诱导H1299细胞凋亡;蛋白质印迹法分析显示,DADS可激活p42/44 MAPK,且磷酸化-p42/44 MAPK的表达呈浓度依赖性增加。结论DADS能诱导H1299人非小细胞性肺癌细胞发生细胞凋亡,并呈浓度依赖性诱导磷酸化-p42/44 MAPK表达。     

阿司匹林对血管内皮细胞增殖及磷酸化p44/42MAPK表达的抑制作用

目的 观察阿司匹林对体外培养的血管内皮细胞的增殖和磷酸化p44/42丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)表达的影响。方法 体外培养血管内皮细胞株ECV304,应用1、2、5、10 mmol/L的阿司匹林分别作用并设立对照进行比较,采用MTS/PES法确定ECV304细胞的增殖状态。利用p44/42磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印迹法测定磷酸化p44/42 MAPK蛋白表达。结果 各组的细胞增殖率分别为对照组1.533±0.286,阿司匹林1 mmol/L组1.253±0.225,2 mmol/L组0.953±0.149,5 mmol/L组0.708±0.125,10 mmol/L组0.459±0.107。统计分析显示低至1 mmol/L的阿司匹林仍能明显抑制ECV304细胞的增殖(P<0.05),并呈现剂量依赖性。阿司匹林对ECV304细胞的磷酸化p44/p42 MAPK表达有显著的抑制作用(P<0.05)。结论 阿司匹林对体外培养的血管内皮细胞的增殖和内皮细胞中磷酸化p44/42 MAPK的表达均有明显的抑制作用。     

骨松灵合剂对去卵巢大鼠成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原雌激素受体表达的影响

目的通过观察骨松灵合剂对去卵巢大鼠成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原、雌激素受体表达的影响,探讨骨松灵合剂对骨代谢的可能作用机制。方法不同浓度的骨松灵合剂刺激大鼠成骨细胞,采用噻唑蓝(MTT)法测定活细胞的数量,RT-PCR和免疫细胞化学染色方法来测定不同浓度的骨松灵合剂对去卵巢大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原、雌激素受体表达的影响。结果与对照组相比,30,60,120,240mg/ml的骨松灵合剂对成骨细胞均有促增殖作用(P<0.05),48h、72h后,120mg/ml的骨松灵合剂仍有此作用,其他浓度对成骨细胞促增殖作用消失(P>0.05)。120mg/ml骨松灵合剂培养成骨细胞24h、48h、72h后均可增加成骨细胞Ⅰ型胶原mRNA表达,并有时间依赖性。120mg/ml骨松灵合剂培养成骨细胞24h、48h、72h后均可增加成骨细胞ERαmRNA,ERβmRNA表达,ERαmRNA表达在培养24 h后有所增加,48h、72h较24 h无明显变化;ERβmRNA表达增加有时间依赖性。结论骨松灵合剂可以促进去卵巢大鼠成骨细胞增殖及Ⅰ型胶原、雌激素受体表达,这些可能是骨松灵合剂对骨形成的作用机制。     

姜黄素对肿瘤坏死因子-α诱导的大鼠平滑肌细胞Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

目的观察姜黄素对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的离体大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)Syndecan-4蛋白及p44/42丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)表达的影响。方法分别用20 ng/ml TNF-α、20μmol/L姜黄素、20 ng/ml TNF-α联合20μmol/L姜黄素作用于体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞24 h,MTS/PMS法检测VSMCs的增殖状态,Western blot蛋白免疫印迹法分别测定VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达。结果(1)统计分析表明,与对照组比较,TNF-α能显著刺激大鼠VSMCs的增殖(P<0.01),单独应用姜黄素对大鼠VSMCs增殖无显著作用(P>0.05)。与TNF-α组比较,姜黄素能显著抑制TNF-α所诱导的大鼠VSMCs的增殖(P<0.01);(2)统计分析表明,与对照组比较,TNF-α组能显著刺激大鼠VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达(P<0.01),TNF-α的这一作用能被姜黄素所抑制(P<0.01),单独应用姜黄素对大鼠VSMCs中Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达无显著作用(P>0.05)。结论一定剂量的姜黄素可显著抑制TNF-α诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和Syndecan-4蛋白及磷酸化p44/42MAPK的表达。     

骨灵片通过p38 MAPK信号通路影响成骨细胞功能的机制

目的 探讨骨灵片促进成骨细胞增殖、矿化以及基因表达的细胞信号通路.方法 用含有骨灵片的大鼠血清、p38MAPK抑制剂SB203580作用人成骨细胞MG-63,测定各组成骨细胞增殖率、矿化结节数量.采用Western-blotting及Real time RT-PCR方法观察各组成骨细胞护骨素(OPG)、护骨素配体(RANKL)以及巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)基因表达和磷酸化p38含量.结果 经含骨灵片药液的大鼠血清作用后,MG-63细胞的增殖和矿化结节形成数明显增加,OPG基因表达增加,RANKL基因表达减少,OPG/RANKL比值显著增加,M-CSF有下降趋势,但没有显著性差异,同时刺激p38磷酸化.结论 骨灵片可能通过p38MAPK通路促进成骨细胞增殖以及矿化结节形成,调控OPG、RANKL以及M-CSF的表达,达到治疗骨质疏松症的作用.     

尼可地尔在抑制内皮素诱导的血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的：探讨丝裂素活化的蛋白激酶（ＭＡＰＫ）,在ＡＴＰ敏感钾通道开放剂尼可地尔抑制内皮素（ＥＴ－１）诱导的培养大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用。方法：将１０~（－７）～１０~（－５）ｍｏｌ／Ｌ的尼可地尔导于培养血管平滑肌细胞,ＥＴ－１诱导培养大鼠血管平滑肌细胞增殖。用Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ法测定磷酸化 ＭＡＰＫ蛋白表达。［~３ Ｈ］胸腺嘧啶核苷酸掺入测定平滑肌细胞 ＤＮＡ合成。结果：ＡＴＰ敏感钾通道开放剂尼可地尔抑制ＥＴ－１诱导的培养大鼠血管平滑肌细胞［~３Ｈ］胸腺嘧啶核苷酸掺入并同时剂量依赖性下调 ＭＡＰＫ蛋白表达。结论： ＡＴＰ敏感钾通道开放剂尼可地尔可通过下调ＭＡＰＫ的表达从而抑制ＥＴ－１诱导的培养大鼠血管平滑肌细胞增殖。     

粘着斑激酶和丝裂原活化蛋白激酶对纤粘连蛋白诱导平滑肌细胞迁移和增殖的影响

目的　研究粘着斑激酶和丝裂原活化蛋白激酶在细胞外基质成分诱导血管平滑肌细胞迁移和增殖中的作用。方法　通过纤粘连蛋白 (FN)诱导培养的平滑肌细胞迁移和增殖 ,以免疫沉淀和Western印迹法检测粘着斑激酶 (FAK)和丝裂原活化蛋白激酶 (p4 2 / 4 4MAPK)及其磷酸化的表达量。将FAK反义寡核苷酸 (ODN)经脂质体转染细胞 ,观察其对FAK和p4 2 / 4 4MAPK磷酸化、细胞迁移以及增殖的影响。结果　不同浓度FN(5、10、2 0、4 0、6 0 μg/ml)在有效诱导平滑肌细胞迁移和增殖时FAK和p4 2 / 4 4MAPK也呈明显表达 ,2 0 μg/mlFN可使其磷酸化处于较高的表达量。脂质体可有效地介导ODN转染 ,转染效率为 86 7%± 4 5 %。转染后FAK以及p4 2 / 4 4MAPK磷酸化表达量明显减少 ,10、2 0、4 0和 6 0 μg/mlFN组迁移细胞数也分别显著减少 (2 3 2 6 %、2 1 6 3%、19 31%、17 88% ,P <0 0 5 ) ,5～ 6 0 μg/ml不同浓度的FN组 ,细胞增殖减少 2 7 6 7%～ 4 6 6 7% (P <0 0 5 )。 结论　活化的FAK和p4 2 / 4 4MAPK是细胞外基质诱导平滑肌细胞迁移和增殖的重要信号分子 ,二者之间存在着密切的联系 ,由其介导的信号转导促进了这一过程 ,反义FAKODN可有效地对此进行抑制     

姜黄素通过抑制ERK1/2磷酸化减弱ET-1诱导的大鼠VSMCs增殖

目的观察姜黄素（curcumin）对内皮素-1（ET-1）诱导培养的离体大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖及p44/42丝裂原活化蛋白激酶（p44/42 MAPK,ERK1/2）表达的影响。方法组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs。分别以ET-110-8 mol/L,ET-110-8 mol/L联合浓度为10-6 mol/L、10-5 mol/L、10-4 mol/L的姜黄素作用于体外培养的VSMCs 24 h,采用细胞计数检测VSMCs的增殖,3H-胸腺密啶掺入（3H-TdR）法测定VSMCs的DNA合成,western bolt法检测VSMCs磷酸化ERK1/2的表达。结果与对照组比较,ET-1能显著刺激VSMCs增殖,姜黄素能显著抑制ET-1诱导的VSMCs增殖,且呈剂量依赖关系;ET-1能显著刺激VSMCs磷酸化ERK1/2的表达,该作用可被姜黄素所抑制。结论姜黄素能抑制ET-1刺激的VSMCs的增殖,其作用可能与抑制磷酸化ERK1/2的表达相关。     

阿司匹林对血管内皮细胞增殖及磷酸化p44／42 MAPK表达的抑制作用

OBJECTIVE: To observe the effects of aspirin on vascular endothelial cell proliferation in vitro and on the activity of p44/p42 mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphorylation. METHODS: ECV 304 cells cultured in vitro were treated with aspirin (1, 2, 5, and 10 mmol/L, respectively) and observed for their proliferation in comparison with the control group. The ratio of cell proliferation was determined by non-radioactive MTS/PES assay. The expression of phosphorylated p44/42 MAPK protein was evaluated by the immunoblotting technique using anti-p44/42 phospho-MAPK antibody. RESULTS: The proliferation rate of the endothelial cell was 1.533+/-0.286 in the control group, and 0.459+/-0.107, 0.708+/-0.125, 0.953+/-0.149 and 1.253+/-0.225 in aspirin-treated groups corresponding to aspirin concentrations of 10, 5, 2 and 1 mmol/L, respectively. It was shown that aspirin significantly inhibited the vascular endothelial cell proliferation at the concentration above 1 mmol/L (P<0.05), in a dose-dependent manner as compared with the control group (P<0.05). The expression of phosphorylated p44/42 MAPK protein was significantly inhibited by aspirin. CONCLUSIONS: Aspirin decreases vascular endothelial cell proliferation, and arrest of endothelial cell proliferation may be an important mechanism by which aspirin produces protective effect against acute coronary disease.     

p38MAPK在低能ESW和间歇rhPTH1-34促进ROB成骨的信号转导中的作用

[目的]探讨低能体外冲击波(ESW)和间歇人重组甲状旁腺素(rhPTH1-34)刺激引起的体外培养大鼠成骨细胞(ROB)成骨的细胞内信号转导中p38MAPK的作用.[方法]分别用有效的低能ESW刺激和间歇rhPTH1-34作用于ROB,并设立加入p38MAPK抑制剂SB203580组,来观察ROB增殖、成骨指标及Wes...     

The signal transduction pathway in the proliferation of airway smooth muscle cells induced by urotensin Ⅱ

Background Human urotensin Ⅱ (UⅡ) is the most potent mammalian vasoconstrictor identified so far. Our previous study showed that UⅡ is a potent mitogen of airway smooth muscle cells (ASMC) inducing ASMC proliferation in a dose-dependent manner. The signal transduction pathway of UⅡ mitogenic effect remains to be clarified. This study was conducted to investigate the signal transduction pathway in the proliferation of ASMC induced by UⅡ. Methods In primary cultures of rat ASMCs, activities of protein kinase C (PKC), mitogen-activated protein kinase (MAPK) and calcineurin (CaN) induced by UⅡ were measured. The effect of CaN on PKC and MAPK was studied by adding cyclosporin A (CsA), a specific inhibitor of CaN. Using H7 and PD98059, inhibitors of PKC and MAPK, respectively, to study the effect of PKC and MAPK on CaN. The cytosolic free calcium concentration induced by UⅡ was measured using Fura-2/AM. Results UⅡ 10-7 mol/L stimulated ASMC PKC and MAPK activities by 44% and 24% (P&lt;0.01), respectively, after incubating for 20 minutes. It increased CaN activity in a time-dependent manner, being 1.68 times as that of control for 24 hours (P&lt;0.01). It promoted the cytosolic free calcium concentration increase of 18% (P&lt;0.01). CsA 10-6 mol/L and H7 50 μmol/L inhibited UⅡ-stimulated CaN activity by 45% (P&lt;0.01) and 21% (P&lt;0.05), respectively, while PD98059 50 μmol/L had no effect on CaN activity (P&gt;0.05). CsA 10-6 mol/L inhibited UⅡ-stimulated PKC activity by 14% (P&lt;0.05), while having no effect on MAPK activity (P&gt;0.05). Conclusions UⅡ increases cytosolic free calcium concentration and activates PKC, MAPK and CaN. The signal transduction pathway between PKC and CaN has cross-talk.     

胰岛素、地塞米松、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对3T3-L1脂肪细胞脂肪水孔蛋白表达的调节作用

目的通过细胞培养研究胰岛素样生长因子-1(IGF鄄1)、地塞米松对成熟脂肪细胞水孔蛋白(Aquaporinadipose,AQPap)基因表达的影响,并与胰岛素的作用相比较,以此了解AQPap基因表达的影响因素,探讨其在肥胖及糖尿病发病中所起作用。方法用不同浓度(10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)的胰岛素、IGF鄄1(10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)及地塞米松刺激液(10-6、10-7、10-8mol/L)刺激诱导分化第9天的3T3鄄L1细胞6h;提取细胞RNA,运用半定量RT鄄PCR技术,检测AQPapmRNA表达量的变化。结果与对照组相比,10-9mol/L胰岛素刺激细胞6h可使AQPap基因表达下降16%,10-6mol/L胰岛素使之下降超过50%。IGF鄄1也降低AQPap的基因表达,但相同浓度(10-7mol/L)刺激下,IGF鄄1的作用要弱于胰岛素(P<0.05)。地塞米松对AQPapmRNA的表达量无明显影响,不过,同时给予10-6mol/L的地塞米松和胰岛素与单用10-6mol/L胰岛素相比,AQPapmRNA的表达量有所上升(P<0.05)。结论胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap的表达起抑制作用,并呈剂量及时间依赖性。IGF鄄1也有抑制作用,但较胰岛素弱。地塞米松能够拮抗胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap基因表达的下调作用。