幽门螺杆菌Mr26000外膜蛋白真核载体的构建及表达蛋白的鉴定

目的　构建含人幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,H pylori) 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因的真核重组载体 ,并在COS- 7细胞中表达 ,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法　从原核表达质粒 pET32a(+) / 5 94中 ,酶切H pylori 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因片段 ,将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pcDNA3 1进行连接 ,而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pcDNA3 1/ 5 94 ,并在COS - 7细胞中表达 ,以RT -PCR ,Dotblot法检测其表达产物。 结果　经酶切证实插入的基因片段为H pylori 2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因 ;采用RT -PCR方法 ,能够从转染COS - 7细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段 ;同时Dotblot法等检测显示 ,该重组质粒能够在COS - 7细胞中表达目的蛋白。结论　成功地构建了真核重组载体 pcDNA3 1/ 5 94 ,并在COS - 7细胞中表达 ,为H pylori核酸疫苗的研制奠定了良好的基础。     

幽门螺杆菌27kDa外膜蛋白的基因克隆和特性鉴定

背景：幽门螺杆菌（H.pylori)是全球人群中感染范围最广的致病菌，现已被公认为慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病因子，并与胃腺癌和胃淋巴瘤的形成密切相关。而H.pylori疫苗可能成为控制这一全球范围感染的有效措施。其研制和开发已成为目前研究热点。目的：探索研制H.pylori疫苗的新途径，对H.pylori27kDa外膜蛋白（OMP27）进行基因克隆和特性鉴定。方法：培养和收集H.pylori菌株NCTC11637，采用酚；氯仿抽提和纯化基因组DNA。分别设计引物P1和P2，并以该基因组DNA为模板，以聚合酶链反应（PCR）方法扩增OMP27基因片段。构建pQE30-OMP27重组表达载体时，pQE30质粒载体和纯化的PCR产物均用限制性内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切，再用T4DNA连接酶将双酶切后的目的基因片段OMP27重组于pQE30的相应酶切位点之间，连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue。挑选转化克隆，提取质粒，并进行KpnⅠ和HindⅢ双酶切和PCR方法鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳观察酶切和PCR扩增结果，经测序分析确认后，筛选出插入目的基因的阳性克隆，命名为pQE30-OMP27，挑取单个含重组质粒pQE30-OMP27的工程菌（XL1-Blue)阳性克隆，进行培养和IPTG诱导表达后，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和Western blot进行蛋白表达和抗原性鉴定。结果：该目的基因的PCR产物全长723bp。编码241个氨基酸残基组成的多肽（约27kDa)。SDS-PAGE和Western blot检测表明，电泳图谱上显示出1条相对分子量约27kDa的新生蛋白带，占细菌总蛋白的5%，并能与H.pylori感染小鼠血清发生特异性反应，表明重组H.pyloriOMP27具有良好的抗原性。结论：H.pyloriOMP27有望成为新的H.pylori疫苗候选分子，并可作为抗原用于H.pylori感染患者血清膜蛋白抗体的检测。     

幽门螺杆菌CagV蛋白的克隆表达及初步分析

目的构建幽门螺杆菌（Helicobacte rpylori）IV型分泌系统cagV（hp0530）基因的原核表达系统,表达并纯化CagV蛋白,初步分析其结构和抗原性,为进一步研究幽门螺杆菌的致病机制和治疗药物的筛选奠定基础。方法以H．Py—loriATCC700392株基因组为模板,采用聚合酶链反应（PCR）扩增获得目的片段,将其插入表达载体pET28a后转化大肠杆菌BL21（DE3）,表达纯化后利用蛋白质印迹（Westernblot）分析CagV蛋白的抗原性。结果双酶切鉴定结果证实cagV基因重组表达载体构建成功;重组表达蛋白经飞行质谱鉴定为幽门螺杆菌CagV蛋白;Westernblot检测结果显示CagV蛋白具有特异抗原性。结论所克隆表达的CagV蛋白具有较好的抗原性,对后续的的H．pylori致病性和检测、分析研究有比较重要的意义。     

人幽门螺杆菌VacA与HspA双价候选疫苗抗原的克隆表达及鉴定

目的　构建含人幽门螺杆菌 (Hp)热休克蛋白A(HspA)和细胞空泡毒素 (VacA)编码基因的重组载体 ,进行核苷酸序列分析 ,并在E coliBL2 1中表达 ,研究其抗原性 ,为疫苗的开发奠定基础。方法　利用分子克隆技术从HpDNA染色体中 ,扩增HspA、VacA编码基因片段 ,将目的基因HspA、VacA与载体 pET32a(+)分别进行双酶切后 ,连接、测序 ;同时将重组载体 pET32a(+) /HspA和 pET32a(+) /VacA分别经Xhol、BamHⅠ双酶切 ,通过凝胶电泳回收 pET32a(+) /HspA和VacADNA片段 ,经T4连接酶将HspA和VacA编码基因通过酶切粘端进行连接 ,而后转化并筛选含有两种目的基因的重组载体 ,并在大肠杆菌BL2 1中表达 ,表达产物经纯化后 ,以Westernblot法检测其抗原性。结果　经酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为HpHspA和VacA编码基因 ,由 10 80bp组成 ,与GenBank报道的相比较 ,本实验克隆的基因有 3 4 0 %的碱基发生变异 ,导致 1 10 %的氨基酸残基改变 ;经SDS -PAGE分析发现 ,融合基因表达的蛋白Mr为 5 9× 10 3 ,其中pET32a(+)表达的蛋白Mr约为 2 0× 10 3 ,可溶性表达产物占全菌总蛋白的 18 96 % ;重组蛋白经Ni2 + -NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达95 %以上 ;用Westernblot法检测显示 ,该重组蛋白可被Hp阳性患者的血清所识别 ,具有良     

幽门螺杆菌融合蛋白UreB-Omp11在大肠杆菌中的表达与纯化

近年来,研究者发现了多种Hp的有效保护性抗原成分,UreB、Omp、Hsp、NAP等,其中尿素酶、外膜蛋白等是人们研究的焦点。但它们单独免疫动物时,获得的免疫保护效果均不理想,为克服单一抗原分子诱导的免疫保护水平偏低的问题,本研究用重叠延伸PCR法将H.pylori郑州分离株MELHP27的ur     

幽门螺杆菌VacA蛋白的纯化

目的对幽门螺杆菌(Hp)相对分子质量(Mv)95×10~2的VacA蛋白进行分离纯化。为进一步研究VaGA的作用机制奠定基础.方法采用经硫酸铵沉淀及透析后得到的Hp ccUG17874菌株浓缩上清,应用吸附层析、疏水层析、阴离子交换层析及凝胶过滤等液相层析方法进行VacA蛋白的纯化.每步层析后得到的样品均检测蛋白浓度及空泡毒素活性并行SDS-PAGE电泳检测蛋白成分.结果纯化蛋白的Mr为95×10~3,电泳纯,具有明显的空泡毒性,比活力达20480,与上清原液相比纯化倍数提高了4550倍,产率约为5μg/L.结论采用吸附层析、疏水层析、离子交换层析及凝胶过滤的纯化流程,可以成功分离纯化Hp液体培养上清液中的VacA,纯化的VacA蛋白可用于Hp致病机理的研究.     

幽门螺杆菌lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达与纯化

目的 研究幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H．pylori)lpp20基因与麦芽糖结合蛋白基因的融合表达产物的纯化方法，为幽门螺杆菌基因工程疫苗的制备建立基础。方法 采用本研究室分离的HpMEL-HP27菌株提取染色体DNA，用PCR方法从HP染色体DNA上扩增出lpp20基因片段，将目的基因插人到表达载体pMAL-c2X中，用重组质粒转化大肠杆菌(E．coil TB1)。采用IPTG进行诱导表达。用多糖树脂(amylose resin)作为填充料，制备层析柱，将可溶性菌体蛋白进行亲和层析。应用SDS-PAGE方法对纯化产物进行分析。结果 融合蛋白的分子量约为60kDa，融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的34％；纯化后的融合蛋白纯度达90％以上。结论 与麦芽糖结合蛋白基因融合的lpp20基因在E．coli TB1中能够高效表达；用多糖树脂作为填充料，进行亲和层析的方法，具有良好的纯化效果。     

幽门螺杆菌基因hpaA克隆、融合表达和鉴定

目的克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA,构建幽门螺杆菌hpaA基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据。方法利用PCR技术从H.pylori郑州分离株MEL-HP27染色体DNA上扩增出hpaA基因,序列分析后,将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coliTB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性。结果用PCR方法扩增的hpaA基因长度为783bp,编码260个氨基酸,经酶切鉴定和测序,插入到克隆载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为29kDa,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%。结论本研究成功构建了hpaA基因与麦芽糖结合蛋白基因融合原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础。     

幽门螺杆菌GGT基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆幽门螺杆菌( H pylori)γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)基因,实现GGT基因在大肠杆菌中的表达.方法: 从胃癌患者胃黏膜组织中分离培养获得H pylori,提取其基因组DNA,对GGT基因进行PCR扩增,克隆进pMD18-T载体,酶切和测序验证,构建原核表达载体pET-28a(+)-GGT,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析检测表达产物.结果: 成功克隆了GGT基因,经酶切和测序验证正确,成功构建了pET-28a(+)-GGT质粒,高效表达出了68 kDa的融合蛋白.结论: 在大肠杆菌中成功表达了GGT重组融合蛋白,为进一步研究GGT与线粒体介导的细胞凋亡之间的关系奠定了基础.     

幽门螺杆菌iceA基因亚型的表达与鉴定

目的克隆幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)26695、J99菌株中粘膜接触诱导因子(induced by contactwith epithelium,iceA)等位基因的iceA1、iceA2基因片段,并将其转入大肠埃希菌中,用IPTG诱导表达目标蛋白,为Hp相关感染菌型诊断奠定基础。方法根据标准菌株Hp 26695、Hp J99的iceA不同基因亚型的开放阅读框设计引物,用PCR方法分别从Hp 26695、Hp J99菌株的基因组DNA中扩增iceA1、iceA2基因片段,分别插入表达载体pET28a和pGEX-4t-1,构建重组表达载体pET28a/iceA1和pGEX-4t-1/iceA2,经序列测定鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组质表达目标蛋白。表达蛋白经SDS-PAGE、飞行时间质谱鉴定。结果成功构建了重组表达载体pET28a/iceA1和pGEX-4t-1/iceA2,转入大肠埃希菌中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和飞行时间质谱鉴定证实,表达目标蛋白量分别占细菌总蛋白的16.1%和14.2%。结论成功构建了可高效表达IceA1和IceA2蛋白的重组表达载体,为进一步开展相关疾病的诊断研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌NCTC 11637 cagT基因的克隆及序列分析

目的:克隆幽门螺杆菌(H pylori)NCTC 11637 cag T(HP0532)的编码基因,并分析其核苷酸序列.方法:应用PCR技术从H pylori基因组DNA中扩增cag T编码基因片段,克隆至pGEM-T载体后,再将其定向插入pQE30载体中,双酶切鉴定筛选阳性克隆,并进行序列分析.结果:NCTC 11637 cag T基因全长843 bp(GenBank登录号为EF114758),编码280个氨基酸,与GenBank公布的其他H pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为97%-99%.结论:成功克隆了cag T基因,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

幽门螺杆菌临床株粘附素HapA基因的克隆表达及在诊断中的价值

目的　构建表达幽门螺杆菌临床株粘附素 (HpaA)的重组质粒 ,在大肠杆菌中表达获得重组蛋白 ,探讨重组蛋白作为Hp抗原在感染诊断中的价值。 方法　用PCR方法从幽门螺杆菌临床株DNA中扩增HpaA基因片段。克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达 ,表达产物经纯化和Westernblot鉴定后 ,作为Hp抗原 ,ELISA法对 10 0例临床标本进行相应抗体检测 ,并与细菌培养、组织学染色和快速尿素酶试验比较来评价其应用的可行性。结果　经酶切、测序分析插入的基因片段全长 783bp ,与基因文库中的粘附素基因同源性达 98 87%。表达蛋白经SDS -PAGE分析 ,相对分子量 (Mr)约为 300 0 0 ,可溶性表达占全菌的 4 1 6 7%以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 90 %以上的重组蛋白。Westernblot证实了其免疫反应性。通过对临床病例的检测结果显示细菌培养、组织学染色、快速尿素酶试验和HpaA抗体检测的敏感性、特异性和准确性分别为 10 0 0 %和 80 9% ;10 0 0 % ;和 90 5 % ;90 5 %和 85 8% ;93 3%和 85 9% ,相差不多。结论　HpaA能在大肠杆菌中高效表达 ,具有较强的免疫反应性 ,作为检测试剂敏感性和特异性均较好 ,有望成为Hp新的非侵入性的检测方法。     

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆与重组基因的表达

目的：获得大量纯化的尿素酶Ｂ蛋白,为下一步的幽门螺杆菌疫苗研制作准备。方法：采用ＰＣＲ方法克隆尿素酶Ｂ基因,利用基因工程技术进行基因重组,构建表达工程菌。结果：通过对载体、培养条件的优化选择,实现了尿素酶Ｂ编码基因在大肠杆菌中的高效表达。结论：克隆到的尿素酶Ｂ编码基因和表达的蛋白,其氨基酸序列与文献报道一致。     

幽门螺杆菌1pp20基因的克隆与表达

目的 克隆及表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori)lpp20基因，为探索高效的防治幽门螺杆菌感染的疫苗抗原和诊断抗原奠定基础。方法 用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出lpp20基因片段，将目的基因插入的表达载体pMAL-C2X中，用重组质粒转化大肠杆菌（E.coli TB1），并在E.coli TB1中进行表达。用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析。结果 用PCR方法扩增的lpp20基因长度约为540bp；经酶切、PCR和测序分析，插入到载体的基因片段与文献报道的基因序列一致；SDS-PAGE的结果显示，目的基因表达产物的相对分子质量为18kDa，融合蛋白的表达量占全菌总蛋白的34%。结论 本研究中构建的pAML-C2X与lpp20基因重组质粒在E.coli TB1中能够高效表达目的基因。该重组子的构建为幽门螺杆菌lpp20基因的研究建立了重要的基础。     

幽门螺杆菌中国株cagA全长基因克隆及其分子特征分析

目的克隆幽门螺杆菌中国株MEL-Hp 27cagA全长基因,并进行分子特征分析。方法参考Hp26695基因组序列,分别针对cagA基因编码区保守序列和位于cagA基因上、下游的基因序列设计两对PCR引物,交叉分段扩增包括cagA基因编码区、5′、3′非编码区在内的全长基因序列,并对cagA基因调控序列、编码序列及源自中国的CagA分子EPIYA基序分布特点进行分析。结果Hp27cagA基因编码区长3510bp,编码1169个氨基酸。5′端非编码区长649bp,-10区、-35区分别位于起始密码子ATG上游89bp和154bp处,3′端非编码区长476bp。Hp27cagA基因编码区核苷酸序列与东亚菌株同源性为96%,与西方菌株的同源性仅为86%左右。Hp27CagA分子存在典型的EPIYA基序,属于ABD型,与国际参考株NCTC11637的AB-CCC型不同。比较源自中国的HpCagA序列的EPIYA基序分布特点,未发现中国Hp分离株之间存在CagAEPIYA基序与疾病结局(胃癌、慢性胃炎和十二指肠溃疡)的聚类关系。结论成功克隆幽门螺杆菌全长ca-gA基因;cagA基因编码区及非编码区序列存在东西方差异;未发现中国Hp分离株之间存在CagA EPIYA基序与疾病结局的聚类关系。     

幽门螺杆菌黏附素基因alpA的克隆及序列分析

目的　获取幽门螺杆菌黏附素基因alpA ,并将它克隆到质粒 pET - 2 2b(+)中进行核苷酸序列分析。 方法　利用PCR技术扩增alpA ,并将其定向插入pET - 2 2b(+)载体中通过DNA序列分析仪进行核苷酸分析。 结果　DNA序列分析表明 ,所克隆的alpA基因序列与GenBank公布的基本一致。 结论　本研究获得了序列正确的alpA基因 ,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础。     

幽门螺杆菌疫苗研究的现状和展望

幽门螺杆菌感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌及胃粘膜相关性淋巴瘤有关。疫苗是防治幽门螺杆菌感染切实可行的方法。近年来新的防治和根除幽门螺杆菌感染的疫苗正在开发并取得了很大的进展。本文对新近研制的蛋白组分疫苗、活菌疫苗、DNA疫苗、缓释微球疫苗及表位疫苗等幽门螺杆菌疫苗的进展作一综述。     

幽门螺杆菌脂蛋白基因的克隆和生物信息学分析

目的完成幽门螺杆菌(Hp)郑州分离株MEL-HP27脂蛋白(lipoprotein)基因lpp20的克隆和测序;分析该基因序列的变异性和表达蛋白的化学及免疫学特征,为Hp疫苗抗原的筛选奠定基础。方法用PCR方法从MEL-HP27的染色体DNA中扩增lpp20基因片段,将其与载体pNEB193连接后,用于转化大肠杆菌JM109,通过酶切和测序鉴定重组质粒。应用生物信息学软件Omiga2.0、GeneDoc2.3和GenBank、Swiss-port数据库对7个Hp菌株(MEL-HP27、60190、Chongqing、CH-CTX1、J99、17874、26695)的lpp20基因序列进行同源性比较,并对该基因编码蛋白的主要化学特征和抗原结构域进行分析。结果Hplpp20基因的核苷酸序列长度为528bp,不同菌株间的同源性为96.0%~98.1%。lpp20基因编码的氨基酸序列长度为175aa,不同菌株间的同源性为98.3%~100%。MEL-HP27lpp20表达蛋白的分子量为19.122kDa,等电点为9.950,具有2个抗原性结构域。结论Hplpp20基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列均具有较高的保守性,但保守性低于100%,采用该基因表达蛋白作为疫苗和诊断抗原时,有必要考虑人群感染的优势菌株的遗传特征,以提高免疫保护的覆盖率和免疫诊断的敏感性。Hplpp20基因编码的蛋白具有典型抗原分子的结构特征,有望成为Hp疫苗候选抗原。