腺病毒介导的P120ctn基因对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响

目的以腺病毒介导连环蛋白P120(P120ctn)基因,转染人肝癌SMMC-7721细胞,观察其对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响。方法用腺病毒介导的P120ctn基因转染SMMC-7721细胞,用逆转录-PCR(RT-PCR)和Western Blot检测细胞中P120ctn表达水平,并测定转染后细胞侵袭能力的变化。结果腺病毒介导的P120ctn转染SMMC-7721后,P120ctn的表达水平显著上升;体外侵袭实验显示转染后SMMC-7721的侵袭能力明显下降。结论腺病毒介导的P120ctn基因能够在SMMC-7721细胞中有效表达,并显著抑制肝癌细胞的侵袭能力。     

靶向肝癌表达p16基因的腺病毒载体对裸鼠移植瘤的抗癌活性

目的:利用已构建好的在肝癌细胞中定向表达p16基因的腺病毒载体AdAFP-p16,研究腺病毒介导p16基因的表达对肝癌裸鼠移植瘤的抗癌活性.方法:培养肝癌细胞SMMC-7721,于裸鼠右侧腹部近腋下皮肤注射1×106细胞数细胞悬液,建立裸鼠肝癌移植瘤模型.成瘤后给于瘤体内AdAFP-p16病毒注射治疗,病毒总量1×109 pfu/只,观察AdAFP-p16对肝癌模型的抗肿瘤疗效以及p16基因表达引起的肝癌细胞病理变化.结果:AdAFP-p16能够介导p16基因在肝癌细胞中特异性表达,具有明显的肿瘤生长抑制作用,抑制率可达60.12%(P＜0.01),引起肝癌细胞的坏死.结论:AFP启动子控制的p16基因在肝癌细胞中定向表达,能够抑制肝癌模型的生长,对肝癌综合治疗具有重要意义.     

细菌内同源重组法制备腺病毒介导TK基因对肝癌细胞的杀伤作用

目的 探讨用细菌内同源重组法制备含TK自杀基因腺病毒对肝癌细胞的杀伤作用.方法 将TK基因自载体中切出,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成质粒pAdTrack-GFP-TK,将其PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化BJ5183菌,抽提重组体腺病毒基因组质粒DNA,PacⅠ酶切后转染293细胞包装成腺病毒颗粒,观察其对肝癌细胞的感染效率和目的 基因表达情况及肝癌细胞SMMC-7721感染含TK自杀基因腺病毒后加入丙氧鸟苷(GCV)的生存率和旁观者效应的体外观察.结果 纯化所得腺病毒滴度约为2×1012 efu/mL,当病毒感染复数(MOI)=100时,腺病毒感染SMMC-7721细胞的效率＞90%,实验证实在感染重组体腺病毒的细胞中有相应基因产物的表达,SMMC-7721/Ad-TK细胞对GCV高度敏感,半杀伤浓度(IC50)仅为0.2 μmol/L,HSV-TK/GCV系统在SMMC-7721细胞中存在明显的旁杀伤效应.结论 细菌内同源重组法制备重组腺病毒介导的HSV-TK基因能够成功地在体外整合到肝癌细胞SMMC-7721中,并能高效表达,使其对GCV高度敏感.旁观者效应极大地提高了TK基因抗肿瘤活性,使TK基因制剂实际应用于临床治疗恶性肿瘤成为可能.     

外源性p16基因导入对人原发性肝癌细胞迁移能力和VEGF及nm23表达的影响

目的 探讨外源性p16基因导入对人原发性肝癌细胞迁移能力和VEGF及nm23表达的影响。方法 细胞划痕法检测外源性p16基因导入对人肝癌细胞SMMC-7721迁移能力的影响；免疫细胞化学法分析外源性p16基因导入对VEGF表达的影响；Western blotting法分析外源性p16基因导入对nm23表达的影响。结果 外源性p16基因导入人肝癌细胞SMMC-7721后，转染组细胞迁移能力较空载体对照组和空白对照组SMMC-7721细胞明显下降。外源性p16基因导入人肝癌细胞SMMC-7721后，转染组VEGF表达较空载体对照组和空白对照组SMMC-7721细胞减弱。外源性p16基因导入人肝癌细胞SMMC-7721后，转染组nm23表达较空载体对照组和空白对照组SMMC-7721细胞增强。结论 外源性p16基因导入能降低人肝癌细胞SMMC-7721的侵袭和迁移能力。     

稳定表达外源性p16基因肝癌SMMC-7721细胞株的建立及鉴定

目的构建稳定表达外源性p16基因的肝癌SMMC-7721细胞株。方法利用脂质体介导的基因转染方法,借助真核质粒表达载体pcDNA3．1( ),将外源性p16基因转染入此基因表达下调的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中,经G418筛选,建立稳定表达的细胞株,用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)及免疫组织化学法鉴定p16基因的表达,同时对细胞株分泌蛋白进行活性检测。结果转染p16基因的SMMC-7721细胞中可以检测到p16mRNA及蛋白的表达。结论建立稳定表达P16抑癌蛋白的SMMC-7721细胞株有助于研究p16抑癌基因在肝癌发生中的作用。     

腺病毒介导的THANK基因在SMMC-7721细胞中的表达

目的:构建THANK腺病毒载体,观察腺病毒感染后THANK在SMMC-7721细胞中的表达情况.方法:把THANK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得腺病毒重组质粒,再将获取的腺病毒重组质粒转染入293细胞进行包装,获取THANK重组腺病毒,以不同感染复数(MOI)腺病毒感染SMMC-7721细胞,观察腺病毒对SMMC-7721细胞的感染情况.结果:成功地构建了THANK腺病毒,该腺病毒可高效介导THANK在SMMC-7721细胞中表达,基因转染后第5天,THANK表达高于35 ng/ml,且随时间延长增加.结论:腺病毒可诱导THANK基因在SMMC-7721细胞中高表达.     

重组腺病毒介导的p53基因对肝癌细胞生长抑制作用的研究

目的探索p53基因在肝癌基因治疗方面的可行性.方法以人肝癌细胞系SMCC-7721为实验对象,将载有人野生型p53 cDNA的重组腺病毒(Ad-p53)感染SMCC-7721细胞及肿瘤组织,体外体内实验观察Ad-p53对SMCC-7721细胞生长的影响.结果Ad-p53对SMMC-7721细胞的抑制作用与感染浓度有关,MOI值越高,抑制作用越强.当Ad-p53在100 MOI效靶比时,SMCC-7721细胞基本达到完全抑制.感染2 d后P53蛋白表达达到高峰,SMCC-7721生长受到明显的抑制.瘤内注射Ad-p53后,荷瘤裸鼠的肿瘤体积明显减小.结论Ad-p53转导野生型p53基因可能是一种有效的肝癌基因治疗途径.     

重组腺病毒ADV-TK 基因的构建及其对肝癌细胞的杀伤作用

目的 探讨含胸苷激酶(TK)自杀基因的重组腺病毒(ADV-TK)对肝癌细胞的杀伤作用.方法 采用细胞内同源重组法构建出携带TK基因的ADV-TK,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定,将ADV-TK感染人肝癌细胞株SMMC-7721,MTT法检测受感染的SMMC-7721细胞被不同浓度GCV作用后的细胞存活率情况.结果 构建的重组腺病毒中带有TK基因,用相同滴度的重组腺病毒和不同浓度的GCV作用于肝癌细胞株SMMC-7721后.MTT法检测到细胞的存活率随着GCV浓度的增加而不断降低.结论 本实验构建的携带TK基因的复制缺陷型腺病毒对肝癌细胞具有明显的杀伤作用.     

腺病毒介导的ING4基因对SMMC-7721人肝癌细胞生长的抑制效应

目的研究腺病毒介导的ING4（Ad-ING4）基因对体外SMMC-7721人肝癌细胞的生长抑制作用。方法将腺病毒空载体Ad-GFP及重组腺病毒Ad-ING4分别感染SMMC-7721细胞,采用RT-PCR法及间接免疫荧光检测ING4基因的转录和表达;荧光显微镜观察Ad-ING4对SMMC-7721细胞的细胞毒作用;MTT比色法绘制细胞生长曲线,计算生长抑制率;流式细胞术（FCM）检测Ad-ING4对细胞凋亡的影响;DAPI核荧光染色检测细胞凋亡的核形态学变化。结果 RT-PCR及间接免疫荧光显示Ad-ING4能在SMMC-7721细胞内稳定表达;Ad-ING4感染72h和96h后对细胞的生长抑制率达33.82%和50.70%;FCM检测有明显的凋亡峰,凋亡率可达46.7%;DAPI染色结果显示SMMC-7721细胞胞核呈现核深染、固缩、断裂等细胞核凋亡的形态改变。结论 Ad-ING4能够明显抑制SMMC-7721细胞的增殖,并诱导其凋亡。     

聚酯型儿茶素对人肝癌细胞生长的抑制作用及其机制

目的:探讨聚酯型儿茶素对人肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制作用及其机制。方法:应用MTT法、集落形成试验、同位素掺入试验、细胞内cAMP/cGMP浓度测定、原位杂交等方法进行检测。结果:50mg·L~(-1)聚酯型儿茶素对SMMC-7721细胞的生长、集落形成有明显的抑制作用;~3H-TdR、~3H-Leu掺入试验证明其可明显抑制细胞DNA和蛋白质合成;聚酯型儿茶素作用后,SMMC-7721细胞内cAMP及cGMP浓度明显增加,细胞的c-myc基因mRNA水平表达明显降低,而p53基因mRNA水平表达明显升高。结论:聚酯型儿茶素对肝癌SMMC-7721细胞的生长有明显的抑制作用,此作用与其抑制细胞DNA和蛋白质合成、升高细胞内cAMP浓度和抑制c-myc基因表达、增强p53基因表达有关。     

Replication-incompetent Adenovirus Vector-mediated MDA-7/IL-24 Selectively Induces Growth Suppression and Apoptosis of Hepatoma Cell Line SMMC-7721

In order to investigate the effect of replication-incompetent adenovirus vector expressing MDA-7/IL-24 on tumor growth and apoptosis of human hepatocellular carcinoma （HCC） cell line SMMC-7721 and normal liver cell line L02, the recombinant replication-incompetent Ad.mda-7 virus vector was constructed and infected into the HCC cell line SMMC-7721 and normal liver cell line L02. RT-PCR was performed to examine the expression of MDA-7 mRNA. The concentrations of MDA-7/IL-4 in culture superuatants were determined by using ELISA. MTT and Hoechst staining assay were applied to observe the inhibitory and killing effects of MDA-7 on the HCC cells. By using flow cytometry, the apoptosis, cell cycle and proliferation of SMMC-7721 and L02 cells were measured. The results showed recombinant replication-incompetent virus expressing MDA-7/IL-24 was constructed successfully, and RT-PCR revealed that it could mediate the high expression of the exogenous gene MDA-7/IL-24 in SMMC-7721 and L02 cells. The expression of MDA-7/IL-24 proteins in the culture superuatant was detectable by ELISA. Ad.mda-7 infection induced apoptosis and growth suppression in SMMC-7721 cells and an increased percentage of HCC cells in the GyM phase of the cell cycle, but not in L02 cells. It was concluded that mda-7/IL-24 gene, mediated with replication-incompetent adenovirus vector, could selectively induce growth suppression and apoptosis in HCC cell line SMMC-7721 but without any toxic side-effect on normal liver line L02.     

人血管内皮生长因子shRNA真核表达载体对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖影响

目的:使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,观察对其增殖影响。方法:使用VEGF shRNA真核表达载体转染肝癌细胞系SMMC-7721,ELISA法检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达量,检测转染前后肝癌细胞系SMMC-7721的增殖及细胞的克隆形成能力的变化。结果:VEGF shRNA真核表达载体大部分阻断肝癌细胞系SMMC-7721的VEGF蛋白表达,转染后细胞周期中,G1期细胞增多,S期细胞减少,细胞增殖能力降低;MTT法观察细胞生长速度变慢,单个细胞的克隆形成能力明显下降。结论:VEGF shRNA真核表达载体可明显抑制SMMC-7721细胞增殖能力,为将VEGF shRNA真核表达载体应用于肝癌的基因治疗提供依据。     

pEGFP-N2-ECM1重组质粒的构建及其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达

目的构建细胞外基质蛋白-1(ECM1)稳定表达的SMMC-7721肝癌细胞系。方法应用PCR和DNA重组技术构建pEGFP-N2-ECM1真核表达载体,经酶切、测序鉴定正确后,用脂质体转染SMMC-7721细胞,G418药物筛选稳定转染的细胞系。荧光显微镜检测融合蛋白表达,RT-PCR技术检测ECM1基因表达。结果构建的重组质粒经双酶切及测序分析鉴定,结果证实pEGFP-N2-ECM1构建成功;筛选获得稳定表达ECM1的SMMC-7721细胞。结论成功构建了pEGFP-N2-ECM1的真核表达载体,并在肝癌SMMC-7721细胞中稳定表达,为研究ECM1在肝癌进展中的作用奠定了实验基础。     

乙型肝炎病毒X蛋白诱导肝癌细胞上皮-间叶样表型转化的实验观察

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)能否诱导肝癌细胞发生上皮-间叶样表型转化.方法 构建含HBx基因的重组腺病毒载体并转染肝癌细胞SMMC-7721,观察转染后细胞的形态变化,并通过RT-PCR、蛋白质印迹、免疫细胞化学等方法检测其上皮标志物和间叶标志物的表达变化,通过transwell实验评价其侵袭转移能力.结果 SMMC-7721细胞被含HBx基因的重组腺病毒载体转染1周后,多角形上皮样细胞表型转化为梭形成纤维细胞样表型,其上皮标志物E-cadherin表达为(0.37±0.05)与(0.74±0.07),α-catenin mRNA表达为(0.63±0.06)与(0.78±0.07)表达较对照组显著下调(P<0.05).β-catenin表达无明显变化(0.73±0.07)与(0.78±0.07)(P>0.05);间叶标志物N-cadhefin表达(0.78±0.04)与(0.60±0.07),Vimentin表达为(0.64±0.06)与(0.32±0.05),Fibronectin表达为(0.49±0.05)与(0.24±0.03)等与比对照组比较显著上调(P<0.05),并且侵袭转移能力显著提高.结论 乙肝病毒X蛋白可以诱导肝癌细胞SMMC-7721发生上皮-间叶样表型转化,并增强其侵袭转移能力.     

Gene Therapy of HSV-TK Transferred by the EBV based Expression Vector on Experimental Hepatocellular Carcinoma

Hepatocellular carcinoma(HCC) is a commonmalignancy with increasing incidence and poor prog-nosis.Up to now,a wide array of gene therapy sys-tems for the tumor have been investigated.Herpessimplex virus thymidine kinase (HSV- TK ) genetransfer followed by gancinovir(GCV) administra-tion is one of the most well- established suicide genesystems.HSV- TK converts the protoxic nucleosideanalogue GCV into a highly toxic,phosphorylatedGCV that acts as a chain terminator of DNA synthe-sis an…     

整合蛋白β1亚基过表达上调p27抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖

目的:研究整合蛋白β1亚基过表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响及机制。方法:采用MTT及细胞流式测定观察整合蛋白β1亚基过表达对肝癌细胞SMMC-7721增殖及细胞周期的影响。蛋白质印迹及RT-PCR检测细胞中p27的蛋白及mRNA的表达,并构建p27的RNA干扰质粒,转染整合蛋白β1亚基过表达细胞,再观察p27的表达变化对细胞增殖的影响。结果:整合蛋白β1亚基过表达可以抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,并将细胞阻滞在细胞周期的G1期。整合蛋白β1亚基过表达可以在蛋白水平上调p27的表达,但并不影响p27的mRNA水平。p27的RNA干扰质粒可明显抑制p27的表达,而且p27表达的下调可以阻止整合蛋白β1亚基过表达所引起的细胞增殖抑制。结论:整合蛋白β1亚基过表达通过上调p27抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖。