耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的基因型及同源性分析

目的探讨耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药性、基因型和同源性。方法收集临床采集的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌23株,检测其药物敏感性和ESBLs表型,改良Hodge试验确证碳青霉烯酶表型,PCR、DNA测序和BLAST证实基因型,脉冲场电泳(PFGE)分析产酶菌株同源性。结果 23株肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素完全耐药,其中47.8%来源于痰液标本,主要分布在神经外科重症监护室(NCU)。23株菌ESBLs和改良Hodge试验阳性率分别为21.7%、82.6%,检出SHV-11(22株)、KPC-2(14株)、NDM-1(6株)、VEB(2株)、IMP(1株)、OXA-1(2株)和OXA-10(2株)耐药基因。PFGE将23株菌基因分成A~G 7个带型,其中以A型为主(69.6%,16/23)。结论碳青霉烯酶基因型以KPC-2型及NDM-1型为主,院内存在克隆株流行。     

产KPC-2 肺炎克雷伯菌的MLST 和wzi 分型分析

目的探讨产KPC-2肺炎克雷伯菌的多位点序列分型(MLST)并确定其wzi分型。方法收集南京鼓楼医院2012—2014年分离的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌108株,采用改良Hodge试验筛选产碳青霉烯酶菌株,PCR和DNA测序技术鉴定KPC-2编码基因。对产KPC-2菌株,用MLST技术分析其遗传相关性,并用PCR技术对其进行wzi分型。结果 108株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中,72株产KPC-2。72株产KPC-2菌株经MLST分型分为9个不同克隆型,其中ST11(61/72,84.7%)最为流行,其次为ST15(4/72,5.6%);72株产KPC-2细菌有7种wzi分型,wzi209(K47荚膜型)最为流行(58/72,80.6%),其次为wzi64(K64荚膜型)(6/72,8.3%)。结论产KPC-2肺炎克雷伯菌ST11型在我院存在克隆播散,大多为wzi209,荚膜型为K47,需加强感染控制措施。     

一株对3种碳青霉烯类抗菌药物均耐药的肺炎克雷伯菌耐药机制研究

目的研究临床分离的一株肺炎克雷伯菌(K30)对碳青霉烯类抗菌药物耐药的机制。方法采用琼脂稀释法测定肺炎克雷伯菌K30对13种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC);用改良Hodge试验检测碳青霉烯酶;聚合酶链反应(PCR)检测A类碳青霉烯酶(KPC)、B类碳青霉烯酶(NDM、IMP、VIM、SIM)、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs,CTX、TEM、SHV)、头孢菌素酶(AmpC,FOX、EBC、ACC、DHA、CIT、MOX)基因和Ⅰ类整合子;实时荧光定量PCR分析肺炎克雷伯菌膜孔蛋白基因ompK35、ompK36的mRNA表达;利用质粒接合试验研究肺炎克雷伯菌K30耐药基因的水平传播能力。结果药物敏感性试验显示,肺炎克雷伯菌K30对包括碳青霉烯类抗菌药物在内的11种抗菌药物均耐药,仅对头孢西丁钠中介,对阿米卡星敏感。肺炎克雷伯菌K30的改良Hodge试验为阳性。PCR扩增A类碳青霉烯酶基因KPC和2种ESBLs基因CTX、SHV为阳性,其PCR产物经测序后同GenBank数据库比对证实分别为KPC-2、CTX-M3和SHV-38。其余耐药基因和Ⅰ类整合子扩增均为阴性。与肺炎克雷伯菌(ATCC 700603)相比,膜孔蛋白基因ompK35、ompK36的表达没有降低。质粒接合试验未成功获取结合子。结论临床分离的一株对碳青霉烯类抗菌药物耐药的肺炎克雷伯菌主要耐药机制与产A类碳青霉烯酶KPC-2合并产ESBLs有关,且KPC-2可能不由质粒介导。     

多重耐药肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶的检测和分析

目的研究多重耐药肺炎克雷伯菌临床分离株的碳青霉烯酶的流行情况。方法收集该院从2007年1月至2012年12月临床分离的151株多重耐药肺炎克雷伯菌,并对其药敏结果进行归纳整理,用碳青霉烯酶表型试验进行检测,再用聚合酶链反应(PCR)检测已知的碳青霉烯酶基因,并对扩增产物进行DNA测序,确定其基因型。结果在151株多重耐药肺炎克雷伯菌中,通过改良Hodge试验筛选出12株可能产碳青霉烯酶的菌株,其中有1株的金属酶试验为阳性,该12株菌经PCR扩增及测序确定产碳青霉烯酶菌株有5株,金属酶阳性株为IMP-4型金属酶,另外4株产碳青霉烯酶菌株为KPC-2型。结论近年来该院多重耐药肺炎克雷伯菌出现了产碳青霉烯酶菌株,临床应根据药敏结果合理选用碳青霉烯类药物,以减少耐药菌株的产生。     

亚胺培南不敏感大肠埃希菌碳青霉烯酶基因的检测

目的 了解碳青霉烯酶基因在亚胺培南不敏感大肠埃希菌中的分布情况.方法 收集亚胺培南不敏感的大肠埃希菌25株,K-B纸片法测定菌株对药物的敏感性;采用EDTA协同试验及改良Hodge试验进行碳青霉烯酶表型检测;PCR法扩增碳青霉烯酶基因并进行序列分析.结果 25株大肠埃希菌呈现泛耐药现象,其中亚胺培南耐药15株,中度敏感10株;改良Hodge试验阳性1 5株,金属酶表型试验全部阴性;15株菌株检出KPC-2酶基因,未检出其它碳青霉烯酶基因.结论 产KPC-2酶是造成该院大肠埃希菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要原因.     

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中KPC基因分布

目的检测碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中KPC基因分布情况,为此类菌感染的预防与控制提供理论依据。方法改良Hodge试验检测医院临床分离肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶表型;PCR法检测KPC基因的携带率。结果 642株碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌中,Hodge试验阳性率为96.6%。KPC基因的携带率为50.9%,均为KPC-2型。结论该医院临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌中KPC基因主要为KPC-2基因。     

携带NDM-1基因ST571型肺炎克雷伯菌引起新生儿医院感染暴发的研究

目的调查某医院儿科分离的6株对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因型和相互间的同源性,为控制医院感染提供依据。方法采用梅里埃Vitek-2Compact对6株肺炎克雷伯菌进行鉴定及药敏试验。改良Hodge试验和金属酶E条检测菌株是否产碳青霉烯酶。聚合酶链式反应扩增菌株是否携带碳青霉烯酶、超广谱β-内酰胺酶和Ampc等耐药基因,并测序确定其基因型。多位点序列(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)验证菌株之间的同源性。结果 6株肺炎克雷伯菌表现为多重耐药性,对临床常用的抗生素耐药。所有菌株改良Hodge和金属酶E条试验均阳性,且携带多个耐药基因。其中5株菌,分别携带NDM-1、SHV-11、DHA-1、oqxA和fosA3基因。另外1株ST11型肺炎克雷伯菌携带KPC-2、CTX-M-65、TEM-1和OXA-1基因。5株携带NDM-1基因的肺炎克雷伯菌中,有4株的PFGE带型相同,且都为ST571型,另一株为ST76型,带型与前4株不同。结论新生儿病房中存在携带NDM-1、SHV-11、DHA-1、oqxA和fosA3基因的ST571型肺炎克雷伯菌引起的医院感染暴发。     

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药机制研究

目的探讨2014年该院收集的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(CRKP)的耐药机制。方法采用纸片扩散法或者Vitek 2Compact全自动药敏分析系统初筛亚胺培南非敏感菌株,琼脂稀释法确证亚胺培南非敏感肺炎克雷伯菌;通过Carba NP确证试验检测碳青霉烯酶表型;通过PCR扩增及测序检测碳青霉烯酶基因、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因、质粒携带的AmpC基因在菌株中携带情况;外膜蛋白SDS-PAGE分析菌株外膜蛋白的改变;外排泵抑制剂羰酰氰氯苯腙(CCCP)抑制试验检测不产碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌中是否存在针对碳青霉烯类抗菌药物的外排泵。结果琼脂稀释法验证30株为碳青霉烯非敏感菌株,其中19株为Carba NP表型试验阳性,其中18株产KPC-2,1株产NDM-1。11株Carba NP表型试验阴性的不产碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌的ESBLs、AmpC酶的携带率为blaCTX-M 72.7%,blaSHV 27.3%,blaTEM 72.7%,blaDHA 27.3%。SDS-PAGE结果显示编号2368、2875、3050的菌株OmpK36缺失,其余菌株未发现外膜蛋白缺失。CCCP存在时,11株不产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南和厄他培南的最小抑菌浓度值均明显降低。结论碳青霉烯酶产生,尤其是产KPC-2是该院CRKP的主要耐药机制,外排泵的高表达,外膜蛋白的缺失合并产AmpC酶也发挥了重要作用。     

肝脓肿相关肺炎克雷伯菌毒力基因检测及同源性分析

目的探讨肝脓肿相关肺炎克雷伯菌高毒力荚膜血清型及主要毒力基因分布情况,并分析菌株的同源性。方法收集无锡市第二人民医院2016年1月至2017年8月肝脓肿相关肺炎克雷伯菌分离株12株;所有菌株进行黏液丝试验,PCR方法检测高毒力相关荚膜血清型及主要毒力基因;采用多位点序列分型(MLST)技术和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源性。结果 12株肝脓肿相关肺炎克雷伯菌黏液丝试验阳性率为75%;检出K1(6株)、K54(1株)和K57(5株)3种高毒力荚膜血清型。毒力基因wca G、rmp A、ure A、fim H、mrk D、uge、Aer和iro NB检出率均为100%;iuc B检出率为83.3%;未检出cf29a基因;mag A、all S和kfu BC基因仅在K1血清型菌株中检出。MLST发现ST23(4株)和ST25(3株)为主要检出型,其次为ST412(2株)以及ST1660、ST1049和ST11各1株;PFGE结果显示12株肺炎克雷伯菌分为8个型,其中3株K1型菌株属于同一克隆型。结论分离的肝脓肿相关肺炎克雷伯菌均为高毒力菌株,ST23和ST25为主要检出ST型别,ST1049型为首次报道。PFGE结果呈现出遗传多样性,K1型肺炎克雷伯菌存在一定的流行。     

对亚胺培南不敏感的肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类药物的机制研究

目的研究31株对亚胺培南不敏感的肺炎克雷伯菌的耐药基因及外膜蛋白的改变。方法纸片扩散法筛选对亚胺培南不敏感的肺炎克雷伯菌,进行金属酶表型初筛试验、常见耐药基因PCR及测序、外膜蛋白分析,研究其耐药基因及外膜蛋白改变。结果 31株肺炎克雷伯菌中,22株产KPC-2酶,1株产IMP-4酶,产碳青霉烯酶菌株外膜蛋白均有改变。结论 KPC型碳青霉烯酶仍为肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素不敏感的主要原因,但金属酶IMP的出现,提示应加强对金属酶的检测。     

KPC酶在肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药中的研究

目的运用RNA干扰技术探讨blaKPC表达与碳青霉烯类耐药的关系。方法用电转移法将双链小RNA（SiRNA）转入到2株产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶-2（KPC-2）的肺炎克雷伯菌中,检测RNA干扰前后菌株blaKPC的RNA水平和亚胺培南、厄他培南的最低抑菌浓度（MIC）值的变化。结果菌株在RNA干扰前后blaKPC-2的RNA水平有差异,但干扰前后亚胺培南和厄他培南的MIC值没有变化。结论 SiRNA虽然能在RNA水平上抑制blaKPC的表达,但对产KPC-2菌株碳青霉烯类耐药的影响不明显,证明革兰阴性杆菌对碳青霉烯类耐药由多种因素共同引起。     

肺炎克雷伯菌介导碳青霉烯类耐药的基因型检测

目的对临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌进行耐药基因型分析。方法采用琼脂稀释法检测菌株最低抑菌浓度(MIC),用聚合酶链反应(PCR)、DNA测序、脉冲场琼脂糖凝胶电泳(PFGE)、等电点聚焦电泳(IEF)和质粒分子杂交等技术对实验菌株进行基因组DNA同源性、介导耐药的基因型、耐药酶pI和耐药基因携带状态等研究。结果12株肺炎克雷伯菌的亚胺培南和美罗培南M IC值分别为16~64μg/m l和8~256μg/m l;对其他被测的β-内酰胺类和喹诺酮类药物广泛耐药,氨基糖苷类耐药型不定。12株菌均扩增出编码碳青霉烯类抗生素耐药的blaKPC-2和编码β-内酰胺酶的blaSHV基因;部分菌株扩增出blaTEM或/和blaCTX-M基因。IEF和分子杂交揭示KPC-2的等电点为6.8,编码基因被携带在一个约56 kb大小的质粒上;PFGE结果显示12株细菌可分为2个克隆型。结论产KPC-2型碳青霉烯酶是本院肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类药物的主要原因,垂直传播以及通过质粒传递耐药基因可能是其在本医院流行的主要方式。     

产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌基因型研究

目的：研究医院感染超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）肺炎克雷伯菌的基因型。方法：收集分离鉴定菌株，通过K—B法药敏实验初筛以确认产ESBLs菌株，并对ESBLs基因进行初步分型。结果：17株肺炎克雷伯菌产生的ESBLs以CTX-M-3、CTX-M-15、CTX-M-22为主要基因型，其中8株为CTX—M-3型；6株为CTX-M-22型；1株为CTX-M-15型；1株同时产CTX-M-3、CTX-M-22；1株同时产CTX-M-15、CTX-M-22型。结论：我院肺炎克雷伯菌临床分离株中的ESBLs基因型以CTX-M型酶为主。     

肺炎克雷伯菌Ⅱ类整合子的分布及结构分析

目的 研究肺炎克雷伯菌中Ⅱ类整合子携带率,分析Ⅱ类整合子基因盒结构.方法 采用PCR法检测98株临床分离肺炎克雷伯菌中的Ⅱ类整合酶基因,检测Ⅱ类整合酶基因阳性菌株中的intI1、sat、ereA、aadA1、orfX、dfrA1、tnsE、tnsD、tnsC、tnsB、tnsA基因.结果 在1株肺炎克雷伯菌中检出Ⅱ类整合酶基因,阳性率为1%;该菌株同时携带intI1、sat、aadA1、orfX、dfrA1、tnsE、tnsD、tnsC、tnsB、tnsA基因;Ⅱ类整合子的结构与公布的AY639870.1、DQ176869.1、DQ275532.1、DQ268533.1序列中的Ⅱ类整合子结构完全相同.结论 肺炎克雷伯菌中Ⅱ类整合子的携带率较低,Ⅱ类整合子结构无新的变化.     

KPC酶在肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药中的研究

目的运用RNA干扰技术探讨blaKPC表达与碳青霉烯类耐药的关系。方法用电转移法将双链小RNA(SiRNA)转入到2株产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶-2(KPC-2)的肺炎克雷伯菌中,检测RNA干扰前后菌株blaKPC的RNA水平和亚胺培南、厄他培南的最低抑菌浓度(MIC)值的变化。结果菌株在RNA干扰前后blaKPC-2的RNA水平有差异,但干扰前后亚胺培南和厄他培南的MIC值没有变化。结论 SiRNA虽然能在RNA水平上抑制blaKPC的表达,但对产KPC-2菌株碳青霉烯类耐药的影响不明显,证明革兰阴性杆菌对碳青霉烯类耐药由多种因素共同引起。     

产KPC型碳青霉烯类耐药肠杆菌对头孢他啶-阿维巴坦的体外敏感性变化的机制分析

目的检测未接受过头孢他啶-阿维巴坦(ceftazidime-avibactam,CAZ-AVI)治疗的产KPC型碳青霉烯类耐药肠杆菌(KPC-producing carbapenem-resistant Enterobacteriacea,KPC-CRE)对CAZ-AVI的体外敏感性;研究产KPC型肺炎克雷伯菌(KPC-producing Klebsiella pneumoniae,KPC-KP)对CAZ-AVI敏感性降低机制。方法收集2016年10月—2018年6月苏州大学附属第二医院非重复CRE临床菌株70株;全自动微生物分析仪进行菌种鉴定,并用16S rRNA PCR扩增及测序进行验证;革兰阴性菌药敏板及微量肉汤稀释法进行药敏分析;改良碳青霉烯酶灭活试验(mCIM)对CRE菌株进行产碳青霉烯酶表型检测;PCR结合Sanger测序检测耐药相关基因;多位点序列分型分析KPC-CRE的序列分型(ST);以CAZ-AVI最低抑菌浓度(MIC)≤2/4 mg/L的KPC-KP为对照组,以CAZ-AVI MIC为4/4 mg/L的KPC-KP为实验组,采用qRT-PCR检测bla_(KPC)相对拷贝数及表达量。结果 70株CRE菌株中49株(70.0%)为产碳青霉烯酶阳性,其中26株携带bla_(KPC);25株KPC-KP中23株为ST11;26株KPC-CRE对CAZ-AVI敏感率为100%,其中1株CAZ-AVI敏感性降低KPC-KP,MIC为4/4 mg/L;CAZ-AVI敏感性降低KPC-KP携带野生型bla_(KPC-2)以及2种ESBLs基因bla_(CTX-M-65)和bla_(TEM-1),外膜蛋白OmpK35缺失,OmpK36功能缺陷;其bla_(KPC)相对拷贝数及表达量均高于对照组。结论 CAZ-AVI对未接受过CAZ-AVI治疗的KPC-CRE具有很强的体外抑制作用;bla_(KPC)拷贝数和/或表达量增加合并ESBLs以及外膜蛋白缺失和功能缺陷可能会导致KPC-KP对CAZ-AVI敏感性降低。     

全球产KPC肺炎克雷伯菌的KPC分布与序列分型分析

目的分析全球产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)的肺炎克雷伯菌的序列分型数据,探讨KPC-2、KPC-3与主要流行克隆之间的关系。方法从NCBI中下载全球肺炎克雷伯菌的基因组,分析KPC的分布情况。对产KPC肺炎克雷伯菌基因组进行多位点序列分析,确定其序列分型(sequence type, ST)。分析KPC在不同克隆菌株中的分布情况,以及在主要流行克隆ST11、ST258及ST512中KPC变异体KPC-2和KPC-3的流行率差异。结果全球肺炎克雷伯菌的基因组中产KPC 1 943株,有KPC变异体14种,以KPC-2(959/1 943,49.4%)和KPC-3(952/1 943,49.0%)为主;有115种ST型,以ST258(996/1 943,51.3%)、ST11(285/1 943,14.7%)和ST512(259/1 943,13.3%)为主。959株KPC-2菌株分布在87种ST中,以ST258(413/959,43.1%)和ST11(274/959,28.6%)为主;952株KPC-3菌株分布在45种ST中,以ST258(570/952,59.9%)和ST512 (259/952,27.2%)为主。KPC-2在ST11菌株中的流行率(274/285,96.1%)显著高于在ST258中的流行率(414/996,41.6%),差异有统计学意义(χ~2=43.819,P=0.000);KPC-3在ST512中的流行率(259/259,100%)显著高于在ST258中的流行率(570/996,57.2%),差异有统计学意义(χ~2=206.645,P=0.000)。结论从全球范围来看,KPC的流行以KPC-2和KPC-3为主,KPC-2的流行克隆菌株以ST11和ST258为主,KPC-3的流行克隆菌株以ST258和ST512为主,加强该类细菌的监测对于预防院内感染控制具有重要作用。     

1株泛耐药肺炎克雷伯菌耐药机制的研究

目的研究1株泛耐药肺炎克雷伯菌(Kpn)的耐药机制。方法用Vitek-2系统进行细菌鉴定,纸片扩散法和肉汤稀释法进行药敏试验;PCR和DNA测序检测β-内酰胺酶基因和7个管家基因,多位点序列分型(MLST)进行7个管家基因的序列分析;改良Hodge试验、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)确证试验、利用抑制剂的双纸片增效试验和改良ESBLs确证试验检测β-内酰胺酶表型。结果该菌株呈泛耐药性,携带KPC-2和CTX-M-15基因,MLST显示ST11型;改良Hodge试验检出碳青霉烯酶;ESBLs确证试验呈假阴性结果,改良ESBLs确证试验呈阳性结果;用3-氨基-苯酚硼酸(APBA)的双纸片增效试验呈阳性结果,显示产KPC型A类碳青霉烯酶。结论该菌株的泛耐药性可能是由于产KPC酶,利用抑制剂的表型试验能简便准确地检出KPC和ESBL。     

两种方法检测替加环素对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌体外药敏结果的分析

目的比较两种方法检测替加环素对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌体外药敏结果的差异。方法分别采用纸片扩散法和MIC测试条fMTS）法检测替加环素对23株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的体外敏感性。结果MTS法敏感率为100％;而纸片扩散法敏感率为95．7％,出现4．3％的中介菌株。若以MTS法为标准,纸片扩散法检测的次要误差率为4.3％,无重要误差和严重误差。结论纸片扩散法和MTS法检测替加环素对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的体外敏感性时,其结果存在差异。关键词：碳青霉烯酶;肺炎克雷伯菌;替加环素     

肺炎克雷伯菌肺炎亚种的耐药性分析

目的：探讨我院肺炎克雷伯菌肺炎亚种的耐药情况,以指导临床合理用药。方法：收集本院2013年3月--2014年4月临床标本分离出的108株肺炎克雷伯菌肺炎亚种,使用法国生物-梅里埃ATB Expression半自动细菌鉴定仪及鉴定板条鉴定细菌,使用K-B法检测其对常用的16种抗生素的药敏,用纸片协同试验检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）,用改良Hoge试验检测产碳青霉烯酶（KPC）。结果：肺炎克雷伯菌肺炎亚种标本主要分布在呼吸系统,对多种常用抗菌药物耐药率高,但对亚胺培南、丁胺卡那、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和米诺环素耐药率低,可作为经验用药。108株肺炎克雷伯菌肺炎亚种中,产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）34例（31.5%）,12株耐亚胺培南的肺炎克雷伯菌肺炎亚种中,KPC阳性9例（75%）。结论：肺炎克雷伯菌肺炎亚种耐药率高,加强耐药检测,根据药敏实验结果用药对临床有重要作用。