Pokemon表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建Pokemon表达慢病毒载体。方法通过PCR扩增Pokemon cDNA,将Pokemon cDNA连接于GV165载体,经测序确认后,将GV165/Pokemon与pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染至293T细胞中,收获病毒,通过Real time PCR测定滴度;将Pokemon表达慢病毒载体侵染293T细胞通过免疫荧光和Western blot检测Pokemon表达慢病毒载体的转染效率和Pokemon的表达能力。结果在感染Pokemon慢病毒载体293T细胞中能检查到Pokemon-GFP融合蛋白的表达。结论成功构建表达Pokemon的慢病毒载体。     

携带人Sox2和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW.方法 Xho Ⅰ线性化pLentiEF1a-SOx2-IRES-EGFP,回收片段并补平Xho Ⅰ切口,接着BamH Ⅰ酶切该片段,回收2.356 kb片段而获连接用Sox2-IRES-EGFP;EcoR Ⅰ线性化pFUGW,回收并补平EcoR Ⅰ切口,然后BamH Ⅰ酶切该片段,回收9.174 kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用Sox2-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定.所构建载体命名为pFUSGW.获pFUSGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Sox2和EGFP基因的慢病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、人胚肺成纤维细胞(HLFs)和人神经胶质瘤细胞(U87)以建立相应病毒感染体系.结果 酶切证实成功构建了pFUSGW,按标准程序生产的携带SOx2和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染MEFs、HLFs及U87.结论 成功构建携带人Sox2和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUSGW,为相关后续的研究打下了良好的基础.     

携带人Oct4和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW.方法 Sac Ⅱ线性化pLentiEF1a-Oct4-IRES-EGFP,回收片段并补平Sac Ⅱ切口,接着BamH Ⅰ酶切该片段,回收2.565 kb片段而获连接用Oct4-IRES-EGFP;EcoR Ⅰ线性化pFUGW,回收并补平EcoR Ⅰ切口,然后BamH Ⅰ酶切该片段,回收9.174 kb片段获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用Oct4-IRES-EGFP连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定.所构建载体命名为pFUOGW.获pFUOGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带Oct4和EGFP基因的慢病毒感染293FF细胞和鼻咽癌细胞株C666-1、CNEI和6-10B以建立相应病毒感染体系.结果 酶切鉴定证实成功构建了pFUOGW,按标准程序生产的携带Oct4和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和6-10B.结论 成功构建携带人Oct4和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUOGW,为相关后续的研究打下良好的基础.     

FDFT1基因重组慢病毒表达载体的构建及其表达测定

目的 构建法尼基二磷酸法尼基转移酶1(farnesyl diphosphate farnesyl transferase 1,FDFT1)基因重组质粒并在人胚肾上皮细胞(293T)验证质粒表达.方法 设计FDFT1基因引物并经两次PCR扩增获取FDFT1目的基因;用相应的限制性内切酶将pCDH-CMV-MCS-EF1-...     

靶向miR-126慢病毒表达载体的构建及意义

目的：检测微小RNA-126（microRNA-126,miR-126）在CD4＋CD25＋调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）中的表达水平,同时构建基于慢病毒的miR-126反义寡核苷酸序列（antisense oligonucleotides,ASOs）表达载体。方法：实时定量PCR特异性探针法检测miR-126在Tregs中的表达水平;针对miR-126序列,设计合成其ASOs序列,退火后连接至经AgeI酶和EcoRI酶双酶切的pGCsil—LV—GFP载体上,连接产物转化DH5α感受态细胞,对经PCR鉴定为阳性的载体（命名为pGCsil—miR-126-ASOs）进行测序分析;将构建成功的pGCsil—miR-126-ASOs表达质粒和pHelper1．0、pHelper2．0质粒共转染293T细胞,浓缩病毒颗粒并测定所获病毒滴度;将制备好的病毒颗粒感染经TGF—B体外诱导培养的小鼠CD4＋CD62L＋初始T细胞,72h后用流式细胞仪检测其Foxp3的表达变化。结果：实时定量PCR结果显示miR-126在CD4＋CD25＋Tregs中的表达明显高于CD4＋CD25-T细胞（P〈0．01）;测序结果证明成功构建pGCsil-miR-126-ASOs重组质粒载体,包装并获得高浓度的慢病毒颗粒,病毒滴度为9×10^8TU／mL;重组的病毒能明显抑制Tregs的外周诱导（P〈0．05）。结论：成功构建miR-126ASOs的慢病毒表达载体,并获得高浓度的病毒颗粒。     

携带人c-Myc和EGFP基因慢病毒表达载体的构建

目的 构建携带人c-Myc和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUMGW.方法 Xho I线性化plenti-EFla-c-Myc-IRES-EGFP,回收片段并补平Xho I,接着BamH I酶切该片段,回收2722 bp片段而获连接用c-Myc-IRES-EGFP;EcoR I线性化pFUGW,回收并补平EcoR I...     

BLU基因慢病毒表达载体的构建

目的:构建BLU基因慢病毒表达载体。方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出BLU基因,将其接入慢病毒载体(pSL6-IRES-EGFP)中,经菌落PCR、酶切和测序鉴定,然后转染293T细胞观察表达情况。结果:PCR、酶切和测序鉴定克隆了重组子(pSL6-BLU-IRES-EGFP),并在293T细胞中成功表达BLU基因。结论:成功地克隆了含有BLU基因的慢病毒表达载体。     

携带人miR302和EGFP基因慢病毒表达载体构建

目的 构建携带人miR302和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体pFUM3GW.方法 Nhe Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pmiR302ApE以释放miR302,接着补平酶切位点而获连接用miR302:BamH Ⅰ酶切携带EGFP的慢病毒载体pFUGW,接着补平酶切产物.并去磷酸化而获连接用载体片段,最后使用DNA连接试剂盒(TaKaRa)中的Solution Ⅰ将其与连接用miR302连接,连接产物转化,次日挑选单菌落,PCR筛选正向阳性克隆,随后将选定的含有阳性克隆的单菌落摇菌,提取质粒并行酶切鉴定及对插入的miR302测序.所构建载体命名为pFUM3GW.获pFUM3GW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR302和EGFP基因的慢病毒感染鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F以建立相应病毒感染体系.结果 PCR、酶切和测序证实成功构建了pFUM3GW,按标准程序生产的携带miR302和EGFP基冈的慢病毒上清高效率感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)及鼻咽癌细胞株C666-1、CNE1和5-8F.结论 成功构建携带人miR302和EGFP基因的慢病毒表达载体pFUM3GW,为相关后续研究打下了良好基础.     

miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞（HEK）293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法：以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040 Vector和FV040 miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48 h后收集慢病毒,以FV040 Vector慢病毒作为对照组,FV040 miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48 h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果：测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组（0.8387±0.1456）比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平（12.6400±0.7884）明显升高（t=14.72,P<0.01）,约为对照组的15.07倍。结论：成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。     

重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建重组表达人吲哚胺2,3-过氧化酶（IDO）基因的慢病毒载体。方法:设计相应引物,从含有人IDO基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应（PCR）方法钓取人IDO基因的全长编码区片段。将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU进行定向的连接,将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况;采用Wester blot 检测IDO-GFP融合蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。结果:成功获取人IDO基因编码区序列,人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确;293T细胞中产生慢病毒颗粒;IDO基因在细胞内稳定表达;人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2×108 TU/ml。结论:成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体,为下一步转染目的细胞奠定了实验基础。     

Foxp3与自身免疫

调节性T细胞是机体维持自身耐受的重要组成部分,在免疫耐受、自身免疫病、移植、肿瘤等方面均有极其重要的作用。在很多自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮中调节性T细胞的数量和(或)功能存在显著异常。最近的研究发现,叉状头/翅膀螺旋转录因子(Foxp3)对于调节性T细胞的发育具有重要的作用,是调节性T细胞发育的一个关键转录因子。因此,Foxp3可能是自身免疫性疾病发病机制中的一个重要因子。     

再生障碍性贫血小鼠Foxp3的表达及意义

目的 探讨再生障碍性贫血(简称再障)小鼠外周血单个核细胞调节T细胞转录因子Foxp3的表达及其意义.方法 ①采用免疫介导(γ射线照射和淋巴细胞输入)的方法 建立再障小鼠模型.②RT-PCR方法 检测再障小鼠外周血单个核细胞Foxp3 mRNA的表达.③免疫组织化学方法 检测再障小鼠脾脏组织Foxp3蛋白水平的表达.结果 ①再障小鼠外周血单个核细胞Foxp3 mRNA的表达较正常小鼠降低(18.90±2.45 vs 57.27±5.71,P＜0.05).②Foxp3蛋白表达水平在再障小鼠脾脏中较正常小鼠低(19.2±10.0 vs 51.4±38.8,P＜0.05).结论 Foxp3在再障小鼠外周血中及脾脏组织中表达明显减少,提示Foxp3的表达降低可能参与再生障碍性贫血的免疫发病机制.     

Foxp3、CD3在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

目的探讨Foxp3、CD3在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达及其与肺癌临床病理特征和预后的关系。方法选取62例NSCLC患者术后的肺癌组织标本（NSCLC组）及27例正常肺组织（距离肿块边缘5cm以上正常肺组织或另一叶肺组织）作为正常对照组。采用免疫组化方法分别检测两组组织中Foxp3、CD3表达的表达情况,并分析其与肺癌临床病理特征（年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小、分化程度、pTNM分期、淋巴结转移与否）的关系。结果NSCLC组Foxp3、CD3阳性细胞数均显著多于正常对照组（P〈0．01）。两者显著相关（P〈001）。Foxp3阳性表达仅在不同分化程度间存在明显差异,低分化者Foxp3阳性细胞浸润量高于高、中分化者（P〈0．05）;CD3阳性表达仅在不同术后pTNM分期间存在明显差异,ⅢB期、Ⅳ期NSCLC组织中CD3阳性细胞数明显减少（P〈0.05）。Foxp3表达与患者术后生存时间无关（P〉0.05）,CD3阳性细胞数与NSCLC患者术后生存时间呈线性正相关（P〈0．01）,Foxp3阳性细胞数与CD3阳性细胞数比值（Foxp3／CD3）与患者生存时间呈线性负相关（P〈0.05）。pTNM分期、CD3阳性细胞绝对数有统计学意义,可作为NSCLC患者的独立预后因素。结论NSCLC组织中CD3阳性细胞数低、Foxp3／CD3大者T细胞肿瘤免疫作用抑制,影响患者术后生存时间。联合检测术后肺癌组织中Foxp3、CD3,并结合患者术后病理分期可以更好地评估NSCLC患者手术预后。     

Foxp3酵母双杂交诱饵表达载体的构建、鉴定和其毒性及自激活效应检测

目的利用酵母双杂交系统,构建人Foxp3酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其进行鉴定.方法获得正常人外周血 PBMC,抽提mRNA,通过巢式 RT-PCR 在人外周血PBMC中获得Foxp3基因片断,纯化后连接至 pMD18-T 载体,测序正确,EcoRⅠ、SalⅠ双酶切pMD18-T-Foxp3和酵母表达载体 pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为 pGBKT7-Foxp3,测序正确,用醋酸锂法将重组质粒转化酶母菌 AH109,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-Foxp3 在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能.结果 RT-PCR 扩增出的DNA 片段约1 203 bp,大小正确,与pMD18-T载体连接,测序正确.构建的诱饵载体pGBKT7-Foxp3,测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确.pGBKT7-Foxp3转化酵母感受态AH109,在SD/-Trp 板上生长良好,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落,在SD/-His/-Trp/X-α-Gal、SD/-Ade /-Trp/X-α-Gal平板上不能生长,说明AH109[pGBKT7-Foxp3]转化成功,对酵母菌株AH109不具有毒性且不具自主激活报告基因的功能.结论成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-Foxp3,可作为酵母双杂合系统中的"诱饵", 为下一步利用酵母双杂交系统筛选Foxp3相互作用蛋白创造了条件.     

GPC3基因重组慢病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建含有GPC3的shRNA序列慢病毒表达载体并转染肝癌细胞,观察其转染效率及在肝癌细胞中的表达.方法 应用重组DNA技术,将设计好的GPC3基因特异性siRNA序列构建至慢病毒表达载体pGLV3-GFP上,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定.采用RT-PCR及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染HepG2细胞后GPC3基因的表达情况.结果 慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×108TU/mL,转染后,GPC3基因表达明显降低.结论 成功构建GPC3基因的shRNA慢病毒载体,所介导的RNAi能有效抑制靶细胞中GPC3基因的表达.     

补肾通络中药对类风湿性关节炎Foxp3表达的影响

目的:观察补肾通络中药对类风湿性关节炎患者Foxp3表达的影响。方法:随机选择来我院健康体检者30例为对照组,同时选择我院门诊类风湿性关节炎患者50例为治疗组。治疗组患者(初治/或经过两周的清除期)内服补肾通络方3个月后,提取所有受试者外周血总RNA,逆转录为cDNA后采用实时荧光定量PCR法检测对照组和治疗组治疗前后Foxp3mRNA的含量。结果:治疗组治疗前后外周血Foxp3表达水平均明显低于对照组(P<0.01),治疗组治疗后外周血Foxp3表达水平亦明显高于治疗前(P<0.01)。结论:类风湿性关节炎患者存在表达Foxp3的调节性T细胞数量减少和/或功能降低,这种调节性T细胞亚群的异常可能参与了类风湿性关节炎的发病和病变进展,补肾通络中药治疗类风湿性关节炎可能是通过上调Foxp3表达而发挥作用。     

重症肌无力胸腺Foxp3基因转录表达水平及其临床意义

目的 探讨抑制性转录调节因子Foxp3在重症肌无力(myasthenia gravis, MG)胸腺内表达及其临床意义.方法 收集本科2003年1月至2006年6月手术切除的MG胸腺组织50例,采用免疫组织化学、Western blot以及RT-PCR技术,检测Foxp3在胸腺内组织定位,蛋白及mRNA转录表达水平以及与MG胸腺病理、临床特征间关系.结果 Foxp3阳性细胞主要位于胸腺内髓质及血管周围间质,少量见于皮质区;MG胸腺组织中Foxp3显著低于对照胸腺组织;其中胸腺瘤组织中仅有少量表达,与增生胸腺差异显著;Foxp3表达水平与MG临床分型负相关.结论 MG胸腺Foxp3基因转录与表达异常,可能参与MG自身免疫的发生.     

凋亡诱导因子AIF基因真核表达载体的构建及表达

目的 利用TA克隆法构建凋亡诱导因子(AIF)的真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),并研究其在人肺腺癌A549细胞中的表达.方法 根据GenBank上AIF的mRNA序列设计特异性引物,以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增AIF基因.并用TA克隆法,将AIF目的基因连接到pUC-T载体,行双酶切和DNA测序鉴定;回收目的片段并将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒AIF-pcDNA3.1(+).最后,将A IF-pcDNA3.1(+)转染A549细胞,RT-PCR和Western blot检测转染细胞AIF基因的表达.结果 成功扩增617 bp的AIF目的基因片段并连接pUC-T载体,测序后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,DNA序列分析显示,连接在真核表达载体上的基因片段与GenBank中的AIF序列完全吻合.RT-PCR和Western blot检测结果显示,转染了AIF-pcDNA3.1(+)的A549细胞AIF mRNA和蛋白表达水平均高于未转染细胞(P＜0.05).结论 成功构建了真核表达载体AIF-pcDNA3.1(+),转染后能够在A549细胞中表达.     

转录因子Foxp_3在免疫调节中的研究进展

Foxp3是forkhead/winged-helix家族转录因子中的一员,最近的研究表明其组成性表达于机体的CD4+CD2+5T调节细胞(CD4+CD2+5 Treg cell),是调节性T细胞的特征性标志,介导T调节细胞在胸腺的发育、外周表达及功能维持。Foxp3对于维持机体免疫耐受和免疫应答稳态具有非常重要的作用,对其进行深入研究,在X连锁的遗传性疾病(IPEX)、自身免疫性疾病、肿瘤和艾滋病的治疗以及移植耐受的诱导等方面具有广泛的应用前景。