人白细胞介素—2基因真核表达载体pDORIL—2的构建

构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体。方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆入表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ。结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲ     

人UROC28基因真核表达载体的构建

目的:构建人UROC28基因的真核表达载体,观察其在HEK293细胞中的表达。方法:以PUC-19-UROC28质粒为模板,扩增UROC28基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3中,酶切鉴定目的基因。重组质粒用脂质体转染HEK293细胞,Western blot观察基因表达情况。结果:PCR扩增的特异性片段长度为430bp,以此构建的重组质粒pcDNA3-UROC28,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5.4kb和430bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人UROC28cds序列一致。证明UROC28因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcD-NA3中。Western blot证实pcDNA3-UROC28转染HEK293细胞24 h后有UROC28的表达。结论:成功构建了pcD-NA3-UROC28重组真核表达载体,并在HEK293细胞中表达。     

人GRP78基因真核表达载体的构建及鉴定

目的利用PCR技术克隆人GRP78基因编码基因（约2000bp）。方法将PCR产物连接到pcDNA3.1（＋）载体上,酶切鉴定后测序分析。结果序列分析表明,扩增片段与GenBank里登陆的序列同源性为100%。并以pcDNA3.1（＋）表达载体为框架结构,尝试构建真核表达载体。结论测序分析结果表明序列同源性为100%。     

HBV全基因真核表达载体的构建及表达

目的：为诱导HBV特异性CTL，构建HBV全基因真核表达载体，并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法：以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3，回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3，T4 DNA连接酶连接HBV和pcDNA3，转化、筛选，酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞，经G418筛选，ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达，RT-PCR检测转染细胞中PreSl mRNA的表达。结果：经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV，转染HepG2后，建立了新的肝癌细胞系HepG2．02G，细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg，PreSl mRNA在转染细胞中表达。结论：经体外重组，获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体，并可在肝癌细胞中稳定表达。     

人HNF1α真核表达载体的构建及表达

目的 构建人肝细胞核因子-1α(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α)真核表达载体,在体外表达并检测.方法 提取HepG2总RNA,用RT-PCR方法制备HNF1α cDNA,进行T-A 克隆.Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切测序正确的重组质粒,回收HNF1α cDNA片段,将其亚克隆于pcDNA3.1( )载体的多克隆位点内.将构建好的真核表达质粒用脂质体法转染HepG2细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测HNF1α的表达. 结果正确构建了pcDNA3.1( )-HNF1α重组载体,并且在转染该质粒的HepG2细胞中检测出了HNF1α的高表达. 结论成功地构建了人HNF1α真核表达载体,其可以在体外表达.     

反义人PCNA基因真核表达载体pDR－PCNA的构建及鉴定

反义人ＰＣＮＡ基因真核表达载体ｐＤＲ－ＰＣＮＡ的构建及鉴定戴林，张学庸，惠宏襄，赵永同，王成济（西安西京医院消化内科西安７１００３３西安生物化学教研室）关键词ＰＣＮＡ基因；反义核酸；真核细胞；表达载体中图号Ｑ５２７．５增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）是ＤＮ...     

重组人肿瘤抑素分泌型真核表达载体的构建及其表达

目的 构建重组人肿瘤抑素分泌型真核表达载体并检测其在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达.方法 以人胚肾293细胞为材料,提取总RNA,用RT-PCR方法合成人tumstatin cDNA,将该cDNA克隆到pGEM-T载体获得重组质粒pGEM-T/tumstatin.以pGEM-T/tumstatin为模板扩增含Ⅳ型胶原信号肽sig基因的sig-tumstatin基因片段,sig-tumstatin 片段经酶切后,插入经同样酶切的pIRESneo3质粒,利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的sig-tum-statin基因片段及重组载体进行验证.将重组sig-tumstatin 真核表达载体转染到CHO-K1对其表达状况进行检测.结果 所获得的sig-tumstatin片段(822 bp)序列与报道的序列完全一致.酶切鉴定的结果表明含重组人肿瘤抑素的pIRESneo3/sig-tumstatin表达载体构建成功.转染重组pIRESneo3/sig-tumstatin的CHO-K1分泌表达了重组人tum-statin.另外,从生长曲线结果来看,转染了 pIRESneo3/sig-tumstatin真核表达载体和空载体的CHO-K1比未转染的CHO-K1细胞的生长速度要慢一些.结论 成功地构建了重组人tumstatin分泌型真核表达载体并获得能稳定表达tumstatin的CHO-K1,为开展下一步的实验奠定了基础.     

人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达

【目的】构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中,扩增出hGM-CSF基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）中,构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞,用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确;重组质粒转染Hela细胞后,检测有hGM-CSF表达。【结论】成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞中能有效表达,为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。     

人DC-STAMP真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人DC-STAMP基因的真核表达载体,并分析在293T细胞中的表达情况。方法通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人破骨细胞体外扩增DC-STAMP的cDNA片段,连接入真核表达载体pEGFP-N1-FLAG后转入293T细胞中,Western blot进行表达鉴定。结果成功扩增出人DC-STAMP全长,构建了重组质粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG,并在其转染的293T细胞检测到融合蛋白的表达。结论成功构建了DC-STAMP融合基因表达载体pEGFP-DC-STAMP-FLAG。     

mrp反义mRNA真核表达载体pcDNA-Amrp的构建

0 引言 肿瘤多药耐药(MDR)是目前临床化疗的主要障碍和失败的根本原因,是亟待解决的问题之一[1]. MDR相关蛋白(MRP)是1992年Cole等[2]在耐阿霉素的小细胞肺癌细胞系H69AR中发现的一种新的肿瘤耐药相关分子,经研究证实,这种蛋白参与体内多种肿瘤耐药的发生,在某些肿瘤组织如胃癌,食管癌和乳腺癌等中呈强阳性表达. 为进一步探讨mrp在人类肿瘤MDR中发生的意义及反义mrp逆转耐药的可能性,我们构建了反义mrp真核表达载体,以了解用其转染耐药细胞后降低细胞MRP的表达对MDR功能的影响.     

人GM-CSF基因真核表达载体构建与表达

 【目的】构建以基因佐剂hGM-CSF基因为基础的真核表达质粒pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞HeLa中表达与鉴定。【方法】采用聚合酶链反应从载体pORF-hGM-CSF中,扩增出hGM-CSF基因,克隆到双顺反子真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）中,构建pIGM-CSF真核表达载体。然后采用脂质体转染法将其转染HeLa细胞,用RT-PCR在RNA水平和ELISA在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。【结果】所克隆hGM-CSF基因片段经测序完全正确;重组质粒转染Hela细胞后,检测有hGM-CSF表达。【结论】成功构建含基因佐剂真核表达载体pIGM-CSF,并在宫颈癌细胞中能有效表达,为继续克隆目的抗原从而构建双顺反子真核表达质粒奠定了基础。     

干扰素β1a基因真核表达质粒的构建和表达

目的：构建干扰素β1a(IFN-β1a)的CHO表达体系,探讨人IFN-β1a在真核细胞中的表达效果。方法：采用全基因合成法获取重组人IFN-β1a基因,并通过点突变将IFN-β1a的17位半胱氨酸进行修饰,合成的基因经PCR扩增,连接入 pSV2-dhfr 质粒中,构建重组真核表达质粒 pSV2-dhfr-IFN-β1a。将质粒转染至 CHO-dhfr－细胞中,经 MTX 加压筛选,获得稳定生长的能够持续表达IFN-β1a的单克隆细胞株;提取细胞基因组DNA,进行PCR 鉴定。收集细胞培养上清液,采用 Wish 细胞病变抑制法检测转染细胞中 IFN-β1a的抗病毒活性。结果：重组真核表达质粒 pSV2-dhfr -IFN-β1a 经 PCR 及双酶切鉴定证明构建正确;以转染细胞基因组 DNA 为模板,可扩增出 IFN-β1a 基因;转染后重组细胞表达的 IFN-β1a具有抗病毒活性,达到3×105 IU·mL^－1。结论：IFN-β1a基因真核表达质粒构建成功,并在 CHO 细胞中成功表达了具有较高生物学活性的 IFN-β1a 蛋白。     

人白细胞介素－2基因真核表达载体pDORIL－2的构建

目的：构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆人表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ．结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆人ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲＩＬ－２．结论：用ＰＣＲ扩增目的基因片断，有快速、获得量大、可改变酶切位点等优点；ｐＤＯＲＩＬ－２的构建成功，为开展基因治疗的研究打下了基础。     

人γ-干扰素真核表达载体的构建及其体外抑制HBV的作用

目的 观察携带人γ干扰素(IFN-γ)基因的真核表达载体(pcDNA3.1-IFN-γ)体外转染hepG2.2.15细胞后抑制乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法 利用PCR技术和基因重组方法构建表达人IFN-γ的真核表达载体,体外转染hepG2.2.15细胞后收集细胞培养上清液,用ELISA法检测人IFN-γ蛋白的分泌量.并分别用荧光定量PCR和ELISA试剂盒检测细胞培养上清中病毒释放的HBV-DNA和HBeAg、HBsAg抗原含量.结果 转染pcDNA3.1-IFN-γ组细胞HBeAg含量比空载体阴性对照组和空白2.2.15细胞对照组下降了49%,而两个对照组间HBeAg含鼍无显著差异;HBsAg含量比宅载体阴性对照组下降了35%、比空白2.2.15细胞对照组下降了33%,两个对照组问HBsAg含量无显著差异.同时,转染pcDNA3.1-IFN-γ组细胞上清中HBVDNA含量比两个对照组均显著降低,而对照组间HBVDNA含量无显著差异.结论 成功构建了人IFN-γ真核表达载体并可以在体外有效抑制HBV复制,为将人IFN-γ应用于抗HBV的基因治疗奠定基础.     

人IL-18基因真核表达载体的构建

目的:通过克隆人的Interleukin-18基因,构建Interleukin-18基因的哺乳动物细胞真核表达载体。方法:把人基因组DNA通过PCR获得Interleukin-18,克隆载体pMD18-T/Interleukin-18,并将其转化到大肠杆菌里,最后进行重组真核表达载体pCDNA3.1/Interleukin-18的构建和鉴定。结果:以人总DNA为模板扩增出580 bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除两个碱基外,其余的完全一致,翻译成的氨基酸序列相同。对重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致。结论:重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18由真核载体pCDNA3.1和Interleukin-18片段组成。且插入的Interleukin-18片段与已知序列完全相同。     

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的：构建含人IL-2 cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在真核细胞中表达，以期用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的研究。方法：应用重叠延伸剪切技术(SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL-2／Fc，回收后克隆到中间pGEM—T：Easy TA克隆载体，得到合适的酶切位点后，用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3．1中，得到真核重组载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc。然后用脂质体法转染SP2／0细胞。结果：对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析，证明连接正确；经ELISA检测证实，该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在SP2／0细胞中有效表达。     

人全长PLCγ1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCγ1基因真核表达载体,以便进一步研究PLCγ1的作用及其机制。方法自行设计一对带有HindⅢ和NotⅠ酶切位点的引物,采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCγ1cDNA(3878bp),纯化后,经HindⅢ-NotⅠ酶切,插入真核表达载体pLNCX2中,构建重组质粒pLNCX2/PLCγ1。通过PCR,限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后,利用RT-PCR及Westernblotting转染后LoVo细胞中PLCγ1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经HindⅢ-NotⅠ酶切后,得到3878bp(PLCγ1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段,同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后,得到约1300bp及约8500bp两个片段,与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westernblot分析证实转染pLNCX2/PLCγ1的LoVo细胞中PLCγ1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCγ1基因真核表达载体pLNCX2/PLCγ1,为进一步研究PLCγ1的作用奠定了基础。     

人NHE-1基因反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的构建人Na -H 交换蛋白-1(Na -H exchanger-1,NHE-1)基因反义真核表达载体.方法采用分子克隆技术,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶从NHE-1cDNA pEAP切下所需目的片段,然后将该片段反向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)/Zeo的多克隆位点,最后对产生重组子进行琼脂糖凝胶电泳鉴定.结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,将目的片段成功的连接到pcDNA3.1(-)/Zeo载体上.结论成功地将NHE-1目的片段反向插入到pcDNA3.1(-)/Zeo中,构建了人NHE-1反义表达真核载体hNHE-1.