水杨酸盐诱发大鼠听皮层中TNF-α和GluA1表达的改变

目的通过检测水杨酸盐诱导耳鸣大鼠听皮层中TNF-α和AMPA受体亚基(GluA1)蛋白的表达,研究耳鸣大鼠听皮层是否出现炎症因子和膜受体表达的改变,探讨TNF-α在耳鸣中的作用机制。方法 24只SD大鼠,随机等分成4组:对照组、慢性注射7天组、慢性注射14天组、停药后恢复14天组。前脉冲抑制实验评估动物是否发生耳鸣样行为。Western Blot检测听皮层中TNF-α和GluA1蛋白表达。结果⑴长期注射水杨酸盐后,大鼠的前脉冲抑制率增加,差异有统计学意义(P<0.05)。⑵在慢性注射7天组,TNF-α和GluA1蛋白表达水平较对照组升高,差异有统计学意义(P=0.036,P=0.019,P<0.05);在慢性注射14天组,TNF-α和GluA1蛋白表达水平较对照组、停药后恢复14天组升高,差异有统计学意义(P=0.003,P=0.002,P<0.01)。⑶TNF-α和GluA1蛋白表达具有显著正相关(P=0.000,P<0.001)。结论耳鸣模型大鼠听皮层中TNF-α和GluA1蛋白表达均上调且两者变化有显著正相关性,推测TNF-α可能通过调节GluA1的表达导致大鼠耳鸣。     

长期注射水杨酸钠对大鼠听皮层酪氨酸受体激酶B及c－fos基因表达的影响

目的通过观察长期注射水杨酸钠后大鼠听皮层中酪氨酸受体激酶B(TrkB)及c-fos基因的表达,探讨其在水杨酸钠耳毒性机制中的作用。方法健康成年Wistar大鼠36只,分为正常组(不做任何处理)、慢性组(肌肉注射水杨酸钠175mg/kg,2次/天,时间间隔8小时,连续注射14天)、慢性恢复组(前期处理同慢性组,停药后恢复28天),每组12只。造模结束后各组大鼠均行听性脑干反应(ABR)检测,然后断头处死并迅速取出听皮层,运用实时荧光定量PCR技术及Western-blot技术分别检测三组大鼠听皮层中TrkB及c-fos的表达。结果正常组ABR反应阈为36±2.23dB SPL,慢性组反应阈升高为41.3±3.31dB SPL,与正常组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01);慢性恢复组ABR反应阈为38.6±5.51dB SPL,与正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。慢性组听皮层c-fos mRNA表达为1.24±0.09,蛋白的表达为0.70±0.12,慢性恢复组听皮层c-fos mRNA的表达为1.23±0.04,蛋白的表达为0.68±0.08,两组均高于正常组(分别为1.12±0.05、0.50±0.04),差异有统计学意义(P<0.01)。慢性组听皮层TrkB mRNA表达为1.26±0.10,蛋白的表达为1.85±0.17,慢性恢复组听皮层TrkB mRNA表达为1.23±0.07,蛋白的表达为1.80±0.08,均高于正常组(分别为1.11±0.03,1.53±0.16),差异有统计学意义(P<0.05)。结论长期注射水杨酸钠后大鼠听皮层c-fos基因表达升高,可能与听觉中枢神经活动增强有关;长期注射水杨酸钠可能通过上调大鼠听皮层TrkB的表达,增强听皮层神经营养因子的功能促进听皮层功能重塑。     

水杨酸盐对大鼠听觉中枢超微结构影响的初步研究

目的　腹腔长期注射水杨酸盐后,检测大鼠听皮层和下丘的突触超微结构改变。方法　大鼠分为正常对照组、急性注射组、慢性注射组和慢性恢复组共4个组,取材行透射电镜检测听皮层、下丘和小脑的突触超微结构变化,观察各组间的差异。结果　与正常对照组比较,慢性注射组出现突触前囊泡增多（t 下丘=-4.61,t 听皮层=-7.00,P 均＜0.01）、突触后致密区增厚（t 下丘=-4.72,P＜0.01;t 听皮层=-3.15,P＜0.05）、突触曲率上升（t 下丘=-2.32,t 听皮层=-3.17,P 均＜0.05）以及突触活性区长度增加（t 下丘=- 4.89,t 听皮层=-3.48,P 均＜0.01）,急性注射组仅出现突触前囊泡的大量释放（t 下丘=-10.57,t 听皮层=-8.34,t 小脑=-9.18,P 均＜0.01）。慢性恢复组与正常对照组比较未出现显著性差异（P＞0.05）。结论　慢性腹腔注射水杨酸后,大鼠下丘和听皮层出现突触神经递质释放增多和传递效率上升的改变。在中枢可塑性的调控下,长期应用水杨酸盐使听觉中枢不断发生结构和功能变化。     

c-fos及NR2A在耳鸣大鼠听皮层中的表达

目的通过检测神经元功能可塑性标记物快反应基因c-fos和N-甲基-D-天门冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR）亚型NR2A在耳鸣大鼠听皮层中的表达探讨听皮层的可塑性变化及其在耳鸣产生中所起的作用.方法将30只白色Wistar大鼠随机分为3组,耳鸣模型组（12只）、生理盐水组（12只）和空白对照组（6只）.注射水杨酸钠造模并用行为学方法证实动物感受到耳鸣后,利用免疫组化技术检测动物听皮层中c-fos和NR2A的表达,并用数字图像分析系统进行分析.结果12只注射水杨酸钠的耳鸣模型组大鼠全部造模成功.c-fos基因的表达产物FOS蛋白主要存在于皮层神经元的胞核,其阳性细胞的数量及所占面积的百分比在耳鸣组显著高于对照组（P值均＜0.01）;NR2A受体主要表达在锥形细胞的胞膜上,其阳性细胞的数量、染色强度和面积百分比均显著强于对照组（P值均＜0.01）.结论耳鸣大鼠听皮层中c-fos和NR2A的表达明显增多,一方面表明神经递质及受体可能参与了耳鸣的发生;另一方面提示耳鸣大鼠听皮层中发生了功能可塑性改变,这种改变可能在耳鸣的发生发展中起重要作用.     

耳鸣模型大鼠听皮层生长相关蛋白-43和细胞骨架活性调节蛋白的表达

目的检测神经元功能可塑性基因生长相关蛋白-43（growth associated protein,GAP-43）和细胞骨架活性调节蛋白（activity regulated cytoskeleton associated protein,ARC）在水杨酸诱导耳鸣大鼠听皮层中的表达,探讨其在耳鸣产生中的作用。方法将24只白色Wistar大鼠随机分为3组：水杨酸钠组（8只）、生理盐水组（8只）和空白对照组（8只）。前两组从条件反射建立前开始于每次条件反射训练前2小时分别腹腔注射10%水杨酸钠溶液（350mg/kg）和同体积生理盐水,至实验结束,空白对照组不做任何处理。通过行为学方法证实水杨酸钠组动物感受到耳鸣后,利用荧光定量PCR检测动物听皮层中GAP-43和ARC的表达。结果水杨酸钠组大鼠听皮层中GAP-43和ARC蛋白阳性神经元的表达（分别为2.17&#177;0.72、4.90&#177;2.13）明显高于生理盐水组（分别为1.05&#177;0.20、1.13&#177;0.42）和空白对照组（分别为0.96&#177;0.97、1.07&#177;0.70）（P〈0.01）,而生理盐水组和空白对照比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论耳鸣大鼠听皮层中神经元功能可塑性基因GAP-43和ARC蛋白阳性神经元的表达增加,推测它们可能在耳鸣的发生发展中起重要作用。     

早期耳鸣和持续耳鸣对大鼠听觉中枢GAP43和egr-1基因表达的影响及变化

目的 通过检测早期耳鸣与持续耳鸣大鼠听觉通路中GAP43和egr-1基因的表达情况来探讨耳鸣发生的中枢源性机制.方法 将48只大鼠随机分为6组,每组均8只:水杨酸钠组分为早期组与持续组,每次训练前2小时腹腔注射10%水杨酸钠溶液(400mg/kg),其中持续组在耳鸣模型建立成功后,继续每天同一时间腹腔注射相同剂量水杨酸钠溶液10天;盐水1组与盐水2组,每次训练前2/h时腹腔注射与水杨酸钠组相同体积生理盐水,其中盐水2组在造模成功后,继续每天同一时间腹腔注射同体积生理盐水10天;空白对照组也分为空白1组与空白2组.早期组、盐水1组、空白1组同时断头取标本,而盐水2组、空白2组与持续组一同断头取标本.再利用实时荧光(sybgreena染料法)相对定量PCR检测GAP43和egr-1的mRNA在听觉通路四个核团中的表达情况.结果 空白组与生理盐水组相比较,听皮层GAP43与egr-1的mRNA表达水平明显提高(P<0.01).耳蜗核中GAP43的mRNA随着水杨酸钠注射次数的增加先下降(P<0.01),后又逐渐回升(P<0.01);egr-1mRNA明显下降(P<0.01).下丘GAP43、egr-1的mRNA表达水平均有明显提高.上撇榄核中,仅持续组GAP43的mRNA有明显降低(P<0.01);两组水杨酸钠组的egr-1的mRNA随着水杨酸钠注射次数的增多而逐渐降低(P<0.05).结论 GAP43和egr-1基因表达水平的改变不但证实了由水杨酸钠诱导的耳鸣大鼠的听觉通路中听觉神经元发生了可塑性改变,并且能够维持这种可塑性改变,从而使大鼠耳鸣症状得以长期持续.     

强脉冲噪声暴露后大鼠听皮层蛋白质差异表达的研究

目的 运用蛋白质组学技术检测强脉冲噪声暴露后不同时间点大鼠听皮层蛋白质表达谱的差异.方法 健康成年SD大鼠分为三组:正常对照组、急性脉冲噪声暴露组及噪声暴露后恢复组.脉冲噪声平均压力峰值(声压级)为156 dB,脉宽为0.25 ms,暴露50次.听性脑干反应(ABR)评价大鼠听功能;运用二维凝胶电泳+质谱分析法对各组大鼠听皮层蛋白质表达谱进行检测,比较其差异,并对表达变化较大的蛋白进行质谱鉴定.结果 与对照组相比,急性暴露组及恢复组在ABR各频率(2、4、8、16、32 kHz)阈值均明显提高(P值均＜0.05);噪声暴露即刻,ABR各频率听阈均有40 ～60 dB的上升;暴露后第7天,各频率ABR阈值有所恢复,第14天时趋于稳定.噪声暴露前后听皮层组织中的差异蛋白有64个,选取变化倍数大的50个点进行酶切质谱鉴定.其中有14个点不可信,剩余36个点所代表的27种蛋白被鉴定出来.所鉴定的差异蛋白主要包括:细胞骨架相关蛋白,线粒体及能量代谢相关蛋白,与突触重塑、神经递质释放及神经元兴奋性相关的蛋白等.结论 强脉冲噪声暴露可引起大鼠听皮层中多种蛋白质表达的变化,这些差异蛋白可能参与强噪声听力损伤的修复过程,以及听觉中枢的可塑性变化及功能重组.     

长期注射水杨酸钠大鼠下丘EphA4的表达

目的：通过观察长期水杨酸钠作用后大鼠ABR及下丘EphA4mRNA表达变化,探讨下丘EphA4表达在水杨酸钠耳毒性中的作用。方法将30只健康成年雄性SD大鼠随机分为5组,每组6只：正常对照组（不予任何处理）,肌注7天组（肌肉注射水杨酸钠175 mg／kg,每天2次,间隔8小时,连续7天）,肌注14天组（水杨酸钠用法同前,持续14天）,恢复14天组（肌注水杨酸钠14天后,停药恢复14天）,恢复28天组（肌注水杨酸钠14天后,停药恢复28天）。对各组大鼠分别于相应时间点进行 ABR 检测后处死并迅速分离下丘,采用实时荧光定量PCR（real－time PCR）的方法检测各组大鼠下丘中EphA4mRNA表达。结果①肌注7、14天组大鼠的ABR反应阈分别为38．33±3．73、44．16±1．86 dB SPL,较对照组（30．83±1．86 dB SPL）明显升高（P＜0．05）;恢复28天组大鼠的ABR反应阈（32．50±2．50 dB SPL）与对照组（30．83±1．86 dB SPL）相比,差异无明显统计学意义（P＞0．05）;②肌注7天组和恢复14天组大鼠下丘 EphA4mRNA 表达（分别为：0．69±0．11、0．67±0．09）均低于对照组大鼠（0．99±0．01）（均为P＜0．05）;恢复28天组大鼠下丘EphA4mRNA表达（0．88±0．04）与对照组大鼠比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论长期注射水杨酸钠后大鼠下丘的 EphA4表达呈可逆性下降,且与水杨酸钠注射后大鼠听功能损伤的变化一致,推测下丘神经元轴突中EphA4参与了水杨酸钠耳毒性的机制。