不同浓度雌二醇对骨髓基质细胞分化过程中Cbfa1和PPAR-γ2 mRNA表达的影响

背量：绝经后骨质疏松的病理生理机制尚未完全阐明，研究表明骨丢失与雌激素缺乏相关，后者可导致多种细胞因子生成增加，继而引起成骨细胞和破骨细胞生成增多。骨吸收增强。雌二醇能否改变骨髓基质细胞分化过程中Cbfa1和PPAR-γ2 mRNA的表达进而影响其向成骨细胞分化尚不清楚。目的：研究骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的介质中，17β-雌二醇对其核结合因子a1(Cbfa1)及过氧化物酶增殖活化受体γ2(PPAR-γ2)mRNA表达的影响，探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用。设计：非随机对照研究。地点和对象：所有实验均在成都军区总医院检验科和成都百奥生物技术有限公司完成，分离骨髓基质细胞所需大鼠由成都中医药大学实验动物研究中心提供。干预：1，25(OH)2D3和地塞米松诱导大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化，用不同浓度[(O-1)&;#215;10^-6mol／L]雌二醇对细胞分化过程进行干预。主要观察指标：应用半定量RT-PCR及Northern blot技术，观察不同浓度雌二醇对骨髓基质细胞分化过程中Cbfa1及PPAR-γ2 mRNA表达的影响。结果：雌二醇能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中Cbfa1 mRNA的表达，雌二醇浓度为[(O-1)&;#215;10^-6mol／L]时，Cbfa1 mRNA的表达量从(25．0&;#177;3．3)％降至(19．8&;#177;2．2)％(t=2．62，P&;lt;0．05)，(14．5&;#177;1．3)％(t=5．92,P&;lt;0．01)和(6．5&;#177;1．9)％(t=9．72，P&;lt;0．01)；雌二醇能明显促进骨髓基质细胞在分化介质中PPAR-γ2 mRNA的表达，在上述雌二醇浓度时。PPAR-γ2 mRNA的表达从(1．75&;#177;0．5)％增至(9．5&;#177;2．1)％(t=7．18，P&;lt;0．01)和(19．3&;#177;3．0)％(t=11．5，P&;lt;0．01)；Northern blot结果显示随着雌二醇浓度的增加，Cbfa1 mRNA的表达量从4．42&;#177;0．39降至1．88&;#177;0．16(t=12．0，P&;lt;0．01)和1．19&;#177;0．11(t=15．8，P&;lt;0．01)；PPAR-γ2 mRNA的表达量从1．31&;#177;0．12增至2．81&;#177;0．22(t=10．5,P&;lt;0．01)和4．02&;#177;0．36(t=14．2，P&;lt;0．01)。细胞ALP活性明显受雌二醇的抑制，在上述雌二醇浓度时ALP的活性从(42．6&;#177;2．5)降至(3．6&;#177;0．7)U／g蛋白(t=29，P&;lt;0．01)。Ⅰ型胶原含量均随雌二醇浓度增加而降低。结论：雌二醇抑制体外培养的骨髓基质细胞向成骨细胞分化而促进其向脂肪细胞分化。     

雌二醇对骨髓基质细胞核结合因子α1基因及成骨细胞生成的影响

目的研究骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的条件培养体系中, 17β-雌二醇( E2)对其核结合因子α 1 (Cbfα 1 )基因表达的影响,探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用.方法取自 1只 3月龄雌性 SD大鼠骨髓基质细胞在生长培养基中传代后,用 1,25(OH)2D3和地塞米松( DEX)诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化.应用半定量 RT- PCR技术,观察不同浓度 E2对骨髓基质细胞分化过程中核结合因子α 1mRNA表达的影响,以α-磷酸奈酚为底物,测定细胞碱性磷酸酶的活性, Van Gieson染色法显示Ⅰ型胶原的含量.结果 E2能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中 Cbfα 1 mRNA的表达,且呈剂量依赖性.E2浓度为 0,1× 10- 10, 1× 10- 8和 1× 10- 6mmol/L时, Cbfα 1 mRNA的表达量分别为 23.4%± 1.8%, 21.8%± 2.0%, 15.8%± 1.5% ( t=6.3, P< 0.01)和 5.8%± 0.8%( t=17.8, P< 0.01).Northern blot 结果显示 Cbfα 1 mRNA的表达量分别为 4.22± 0.11, 2.51± 0.12( t=21, P< 0.01), 1.88± 0.10( t=31, P< 0.01)和 1.17± 0.09( t=41, P< 0.01).ALP活性随 E2浓度增加而降低,在上述 E2浓度时, ALP活性分别为 (42.6± 2.5)U/g,(17.9± 2.0)U/g( t=15, P< 0.01) ,(10.8± 1.5) U/g( t=21, P< 0.01)和 (3.6± 0.7)U/g( t=29, P< 0.01).细胞Ⅰ型胶原的含量随 E2浓度增加而降低.结论 E2能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中 Cbfα 1mRNA的表达,减少成骨细胞的生成.     

雌二醇对骨髓基质细胞核结合因子α1基因及成骨细胞生成的影响

目的 研究骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的条件培养体系中，17β-雌二醇（Ea）对其核结合因子α1(Chfα1）基因表达影响，探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用。方法 取自1只3月龄雌性SD大鼠骨髓基质细胞在生长培养基中传代后，用1，25（OH）2D3和地塞米松（DEX）诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化。应用半定量RT-PCR技术，观察不同浓度Ea对骨髓基质细胞分化过程中核结合因子α1mRNA表达的影响，以α-磷酸套酚为底物，测定细胞碱性磷酸酶的活性，Van Gieson染色法显示Ⅰ型胶原的含量。结果 Ea能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中Ghfα1 mRNA的表达，且呈剂量依赖性。Ea浓度为0,1&;#215;10^-10，1&;#215;10^-8和1&;#215;10^-6mmol/L时，Cbα1 mRNA表达量分别为23.4%&;#177;1.8%（t=17.8,P&;lt;0.01）。Northern blot结果显示Cbfα1 mRNA的表达量分别为4.22&;#177;0.11,2.51&;#177;0.12(t=21,P&;lt;0.01),1.88&;#177;0.10(t=31,P&;lt;0.01)和1.17&;#177;0.09(t=41,P&;lt;0.01)。ALP活性随Ea浓度增加而降低，在上述Ea浓度时，ALP活性分别为（42.6&;#177;2.5)U/g。（17.9&;#177;2.0)U/g(t=15,P&;lt;0.01),(10.8&;#177;1.5)U/g(t=21,P&;lt;0.01）和（3.6&;#177;0.7)U/g(t=29,P&;lt;0.01）。细胞Ⅰ型胶原的含量随Ea浓度增加而降低。结论 Ea能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中Chfα1 mRNA的表达，减少成骨细胞的生成。     

雌二醇对骨形态发生蛋白受体表达的影响

目的研究骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中,雌二醇对其骨形态发生蛋白受体 (BMPR)Ⅰ A,Ⅰ B mRNA表达的影响,探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用,试阐明绝经后高转换骨代谢始动环节的可能机制. 方法SD大鼠骨髓基质细胞在生长培养基中传代培养后,用 1,25(OH)2D3和地塞米松( DEX)诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化, 17β-雌二醇( E2)处理培养细胞,观察 E2对骨髓基质细胞分化过程中骨形态发生蛋白受体Ⅰ A、Ⅰ B mRNA、碱性磷酸酶 (ALP)活性和Ⅰ型胶原合成的影响,β- actin作内对照半定量 RT- PCR分析骨形态发生蛋白受体Ⅰ A,Ⅰ B mRNA的表达,以α-磷酸奈酚为底物,测定细胞碱性磷酸酶的活性, Van Gieson染色法显示Ⅰ型胶原的含量. 结果E2能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中 BMPR-Ⅰ A mRNA的表达,且呈剂量依赖性,随 E2浓度增加( 0～ 1× 103 nmol/L) BMPR-Ⅰ A mRNA从 (27.0± 3.4)%降至 (17.0± 1.8)% ( t=5.2,P< 0.01)和 (9.3± 1.6)% (t=9.2,P< 0.01); BMPR-Ⅰ B mRNA随 E2浓度增加而增加,从 (2.0± 0.8)%增至 (4.8± 1.5)% ( t=3.3,P< 0.05)和 (17.2± 2.2)% (t=13,P< 0.01). Northern blot 结果显示在上述 E2浓度时 BMPR-Ⅰ A mRNA的表达从 4.21± 0.36降至 1.24± 0.10( t=18.2,P< 0.01); BMPR-Ⅰ B mRNA的表达从 1.72± 0.11增至 3.73± 0.31( t=12.2,P< 0.01). ALP活性随 E2浓度增加而降低,从 (42.6± 2.5)U/g蛋白降至 (17.9± 2.0)U/g蛋白 ( t=15,P< 0.01) ,(10.8± 1.5)U/g蛋白( t=22,P< 0.01)和 (3.6± 0.7)U/g蛋白( t=30,P< 0.01);细胞Ⅰ型胶原的含量随 E2浓度增加而减少, Van Gieson染色由鲜红、淡红到黄色,红色越深,表明胶原越多. 结论E2能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中 BMPR-Ⅰ A mRNA的表达,降低 ALP的活性和Ⅰ型胶原含量,增加 BMPR-Ⅰ B mRNA的表达).     

白血病骨髓基质细胞中GATA-1和GATA-2基因的表达特点

为了解转录因子GATA-1和GATA-2基因在白血病和正常骨髓基质细胞(BMSC)中表达的情况,采集了42例白血病患者的骨髓标本及34例正常骨髓标本并分离骨髓单个核细胞,在体外扩增培养后收集悬浮细胞(骨髓细胞)和扩增后的贴壁细胞(BMSC),应用RT-PCR-ELISA方法分别检测GATA-1和GATA-2基因的表达情况,并对其相对表达水平进行半定量分析.结果发现,GATA-1和GATA-2基因在正常和白血病的BMSC和骨髓细胞中均有一定的表达.在BMSC中急性淋巴细胞白血病(ALL)组的GATA-1基因表达率(857%)与正常组(882%)相近,而急性髓性白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)组的GATA-1表达率(55.6%和41.2%)均比正常组低(P=0.008,0.000),且ALL的BMSC中GATA-1基因表达水平＞AML＞正常＞CML(P均＜0.05);而各白血病组BMSC中GATA-2的表达率和表达水平与正常组相比均无显著性差异(P均＞0.05).骨髓细胞中AML组的GATA-1基因表达水平＞正常＞ALL＞CML,AML组的GATA-2基因表达水平＞CML＞ALL＞正常(P均＜0.05).AML、CML和正常组的BMSC和骨髓细胞中均以GATA-2的表达占优势.可以推论,转录因子GATA-1和GATA-2基因在正常和白血病BMSC的表达可能影响骨髓微环境的造血调控作用.是否对白血病的发生发展有一定的影响也值得进一步探索.     

雌二醇对骨形态发生蛋白受体表达的影响

目的：研究骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中，雌二醇对其骨形态发生蛋白受体(BMPR)IA，IB mRNA表达的影响，探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用，试阐明绝经后高转换骨代谢始动环节的可能机制。方法：SD大鼠骨髓基质细胞在生长培养基中传代培养后，用1，25(OH)2D3和地塞米松(DEX)诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化，17β-雌二醇(E2)处理培养细胞，观察E2对骨髓基质细胞分化过程中骨形态发生蛋白受体IA、IB mRNA、碱性磷酸酶(ALP)活性和Ⅰ型胶原合成的影响，β-actin作内对照半定量RT-PCR分析骨形态发生蛋白受体IA，IB mRNA的表达，以α-磷酸奈酚为底物，测定细胞碱性磷酸酶的活性，Van Gieson染色法显示Ⅰ型腔原的含量。结果：E2能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中BMPR-IA mRNA的表达，且呈剂量依赖性，随E2浓度增加(0～1&;#215;10^3nmol／L)BMPR-IA mRNA从(27．0&;#177;3．4)％降至(17．0&;#177;1．8)％(t=5．2，P&;lt;0．01)和(9．3&;#177;1．6)％(t=9．2，P&;lt;0．01)；BMPR-IB mRNA随E2浓度增加而增加，从(2．0&;#177;0．8)％增至(4．8&;#177;1．5)％(t=3．3，P&;lt;0．05)和(17．2&;#177;2．2)％(t=13，P&;lt;0．01)。Northernblot结果显示在上述E2浓度时BMPR-IA mRNA的表达从4．21&;#177;0．36降至1．24&;#177;0．10(t=18．2，P&;lt;0．01)；BMPR-IB mRNA的表达从1．72&;#177;0．11增至3．73&;#177;0．31(t=12．2，P&;lt;0．01)。ALP活性随E2浓度增加而降低，从(42．6&;#177;2．5)U／g蛋白降至(17．9&;#177;2．0)U／g蛋白(t=15，P&;lt;0．01)，(10．8&;#177;1．5)U／g蛋白（t=22，P&;lt;0．01)和(3．6&;#177;0．7)U原蛋白(t=30，P&;lt;0．01)；细胞I型胶原的含量随E2浓度增加而减少。VanGieson染色由鲜红、淡红到黄色，红色越深，表明胶原越多。绪论：E2能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中BMPR-IA mRNA的表达，降低ALP的活性和Ⅰ型胶原含量，增加BMPR-IB mRNA的表达)。     

雌二醇对大鼠骨髓基质细胞过氧化物酶增殖活化受体γ2基因表达的影响

背景:雌二醇能否改变骨髓基质细胞分化过程中过氧化物酶增殖活化受体γ2-mRNA的表达进而影响其向成骨细胞分化有待研究。目的:观察骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的介质中,17β-雌二醇对其过氧化物酶增殖活化受体γ2mRNA及蛋白表达的影响。设计:对比观察实验。单位:成都军区总医院中心实验室,德阳市人民医院检验科,成都百奥生物技术有限公司。材料:选用1只雌性SD大鼠,3月龄,清洁级,体质量(200±20)g,由成都中医药大学实验动物研究中心提供(动物许可证号码11)。DMEM培养液购自Hyclone,1,25一双羟维生素D3、地塞米松和雌二醇购自Sigma公司,引物用Jellyfish软件设计,由大连宝生物技术有限公司合成。RT-PCR试剂盒和RNA提取试剂盒均由大连宝生物提供。兔抗山羊多抗(北京中山生物技术有限公司),山羊抗鼠PPARγ2抗体和Western Blotting增强化学发光试剂均购自Santa Cruz公司。方法:实验于2001-04/2002-07在成都军区总医院中心实验室和成都百奥生物技术有限公司完成。①无菌条件下分离大鼠骨髓基质细胞,1,25一双羟维生素D3和地塞米松诱导大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化,观察细胞生长情况。②用0,0.1,10和1000nmol/L不同浓度雌二醇对细胞分化过程进行干预3d。培养细胞用Tris-Triton X-100缓冲液加超声粉碎裂解细胞,在Beckman CX-7生化分析仪上测定碱性磷酸酶的活性,观察不同浓度雌二醇条件下细胞产生碱性磷酸酶的情况。③100g/L中性甲醛固定培养于24孔板的骨髓基质细胞,Weigert苏木素染液染色10min,自来水冲洗,5g/L盐酸乙醇分化,Van Gieson染色,体积分数为0.95乙醇分化脱水,二甲苯透明,显微镜下观察并照相,观察细胞胶原合成情况。④应用半定量RT-PCR及Northern blot、Western blot技术,观察不同浓度雌二醇对骨髓基质细胞分化过程中PPAR-γ2mRNA及蛋白表达的影响。主要观察指标:①骨髓基质细胞生长情况、细胞胶原合成情况。②不同浓度雌二醇条件下细胞产生碱性磷酸酶的情况。③不同浓度雌二醇对骨髓基质细胞分化过程中PPAR-γ2mRNA及蛋白表达的影响。结果:①骨髓基质细胞接种后4h开始贴壁,24～72h可见贴壁细胞明显增大且分裂增殖,细胞呈三角形,多角形或梭形。3d后首次换液,贴壁细胞体积增大,呈集落生长,10d左右融合成遍。多次传代的骨髓基质细胞呈有序的成纤维细胞样分布。②随着雌二醇浓度的增加,胞浆染色越淡,由鲜红、淡红到黄色。胞浆呈红色说明有胶原合成,红色越深,表明胶原越多。③不同浓度雌二醇条件下细胞均能产生碱性磷酸酶,其活性随雌二醇浓度增加而降低,雌二醇浓度从0nmol/L增加到1000nmol/L时,碱性磷酸酶从(710.1±41.7)nkat/g降至(60.0±11.7)nkat/g(t=29.0,P<0.01)。④雌二醇浓度为0.1,10和1000nmol/L时,PPAR-γ2mRNA的表达量均明显高于雌二醇0mol/L组(t=6.1,7.2,11.5,P<0.01),Northern blot结果显示雌二醇浓度为0.1,10和1000nmol/L时PPAR-γ2mRNA表达量分别为(4.0±0.4)%,(1.7±0.2)%,(2.8±0.2)%,明显高于雌二醇0mol/L组[(1.5±0.1)%,t=5.4,105.0,14.2,P<0.01]。⑤Western Blot检测结果显示雌二醇能明显增加骨髓基质细胞PPAR-γ2蛋白的表达。雌二醇浓度为0.1,10和1000nmol/L时,PPAR-γ2蛋白的表达量分别为(2.2±0.2)%,(2.6±0.2)%,(4.1±0.2)%,明显高于雌二醇0mol/L组[(1.2±0.10)%,t=6.6,8.5,13.2,P<0.01]。结论:雌二醇能明显抑制体外培养的骨髓基质细胞碱性磷酸酶的表达,同时促进骨髓基质细胞内过氧化物酶增殖活化受体γ2mRNA和蛋白的表达。     

骨髓基质细胞向成肌细胞分化中吲哚美辛的作用

目的：探讨吲哚美辛对骨髓基质细胞(marrow stroma cells，MSCs)分化的影响，为合理利用细胞工程解决肌损伤修复提供理论及实验基础。方法：实验动物为6～8周龄Balb／c雄性小鼠80只。单用吲哚美辛、5氮杂胞苷以及联用吲哚美辛／5氮杂胞苷诱导MSCs分化，分别在诱导前及诱导后1，3，5，12，24h应用反转录-聚合酶链反应检测MSCs中PPARγ及MyoD的mRNA表达，免疫组化检测myosin及PPARγ表达。结果：联用吲哚美辛／5氮杂胞苷诱导MSCs分化后，MSCs不向成肌细胞分化而向脂肪细胞分化。PPARγ在诱导后3h开始表达(0．162&;#177;0.033)，与3h相比，诱导后24h明显增强(0．195&;#177;0．056，P&;lt;0．05)，MyoD表达明显受到抑制。结论：吲哚美辛能抑制MSCs向成肌细胞分化，促进其向脂肪细胞分化，这种作用可能是通过PPARγ途径而起作用的。     

普伐他汀对激素诱导骨髓基质细胞分化的影响

背景:普伐他汀最初作为降血脂药物广泛应用于临床,但随着人们对此类药物研究的深入,显示其对骨形成有一定影响,普伐他汀是否能抑制激素诱导骨髓基质细胞分化成脂肪细胞尚不清楚.目的:激素诱导骨髓基质细胞分化成脂肪细胞的条件下,观察普伐他汀对这一过程的影响,并探讨其预防和治疗激素性股骨头坏死的可能机制.方法:取幼兔双侧股骨骨髓,通过细胞贴壁,分离获取骨髓基质细胞,以地塞米松作为脂肪细胞分化的诱导剂,同时加入不同质量浓度的普伐他汀进行干预.培养21 d后,取培养细胞染色,光镜下观察脂肪细胞并采用病理图像分析仪计数;培养12 d后,取培养细胞进行免疫组化染色,观察细胞的碱性磷酸酶活性.结果与结论:培养21 d后,各组脂肪细胞数目随普伐他汀剂量增大而减少,有剂量依赖性.另外,以地塞米松及不同质量浓度普伐他汀处理细胞12 d后,通过免疫组化方法染色确定其碱性磷酸酶活性明显增高.结果表明地塞米松能够诱导骨髓基质细胞分化成脂肪细胞,使成骨分化减少,而普伐他汀可以抑制骨髓基质细胞分化成脂肪细胞,促进成骨.     

骨髓基质细胞分化状态对腺病毒介导骨形态发生蛋白2表达效应的影响

目的:利用骨形态发生蛋白2腺病毒转染向成骨细胞分化的骨髓基质细胞,在体外观察骨形态发生蛋白2的表达量和反应成骨细胞特性的指标变化。方法:实验于2002-04/12在北京大学第三医院中心实验室进行。6周龄雄性BALB/c小鼠60只用于骨髓基质细胞提取,小鼠骨髓基质细胞分别用Dulbecco改良的Eagle培养基液和骨诱导培养基(含地塞米松10-8mol/L、L-抗坏血酸50mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/LDulbecco改良的Eagle培养基液)培养。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞的碱性磷酸酶比活性的比较:取原代培养的骨髓基质细胞,分别加入转染指数25,50,100,200骨形态发生蛋白2腺病毒,以不加骨形态发生蛋白2腺病毒的骨髓基质细胞作为对照。6d后收集细胞,测定碱性磷酸酶活性。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较:实验分5组:骨髓基质细胞组,用Dulbecco改良的Eagle培养基培养9d;骨诱导培养3d组,骨诱导培养3d改用Dulbecco改良的Eagle培养基培养6d;骨诱导培养9d组,骨诱导培养9d;骨诱导培养3d+骨形态发生蛋白2腺病毒组,骨诱导培养3d,加入转染指数50的骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d;骨形态发生蛋白2腺病毒组,用Dulbecco改良的Eagle培养基培养3d,加入同量骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d。收集细胞,测定碱性磷酸酶比活性。③骨形态发生蛋白2与骨桥蛋白检测:采用免疫组织化学染色与蛋白印迹方法。实验采用拉丁方设计。结果:应用骨诱导培养基或转染骨形态发生蛋白2腺病毒均使细胞碱性磷酸酶比活性明显增加(P<0.05)。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞碱性磷酸酶比活性的比较:骨形态发生蛋白2腺病毒(转染指数=50)组碱性磷酸酶比活性显著高于骨髓基质细胞组和骨形态发生蛋白2腺病毒(转染指数=25,100,200)组犤(7658.53±1600.32)比(1932.89±665.30),(4311.53±1108.89),(5360.90±1374.61),划内(2661.86±653.46)nkat/(g·L),P<0.01犦。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较:骨诱导培养3d+骨形态发生蛋白2腺病毒(转染指数=50)组与骨形态发生蛋白2腺病毒(转染指数=50)组差异无显著性(P>0.05),显著高于骨诱导培养3d组和骨诱导培养9d组(P<0.05)。③骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白检测结果:骨诱导培养3d+骨形态发生蛋白2腺病毒组两指标表达量均最高。结论:单纯用诱导Dulbecco改良的Eagle培养基以及先诱导培养再加入骨形态发生蛋白2腺病毒均可促进骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化,但是骨髓基质细胞用骨诱导培养基作用3d再加入骨形态发生蛋白2腺病毒能分泌表达更多的骨形态发生蛋白2,从而提高了目的基因表达的效应。     

流体剪切应力对骨肉瘤成骨样细胞核结合因子α1基因的表达作用

背景:机械应力在成骨细胞功能调控中的作用是近年骨组织生物力学研究的一个重点。流体剪切应力是否可以诱导成骨细胞内核结合因子α1的表达,其规律如何?目前少见报道。目的:观察流体剪切应力对骨肉瘤成骨样细胞(MG-63)核结合因子α1基因表达的作用。设计:对比观察实验。单位:解放军第四军医大学航空航天医学系航空航天生物动力学教研室完成。材料:MG-63人源骨肉瘤成骨样细胞。方法:实验于2004-11/2005-04在解放军第四军医大学航空航天医学系航空航天生物动力学教研室完成。①对MG-63细胞进行培养,传代60h后,将细胞置于流室系统中进行刺激实验。流体剪切应力分别为0.5Pa(0.5Pa应力刺激组)和1.5Pa(1.5Pa应力刺激组),作用时间分别为15,30和60min。同时取盖玻片置于含培养基的培养皿中,作为流体剪切应力刺激组的即时对照(对照组)。②提取细胞总RNA,进行反转录聚合酶链反应,检测细胞内核结合因子α1mRNA的表达,并计算与内参照GAPDHmRNA的比值。主要观察指标:不同流体剪切应力及不同作用时间核结合因子α1mRNA的表达值。结果:①与对照组相比,流体剪切应力刺激组的核结合因子α1mRNA的表达在作用30min和60min均显著增强,且在一定的时间范围内(15～60min),核结合因子α1mRNA的表达水平随着作用时间的延长、应力水平的增加而增强。②1.5Pa应力刺激组在作用30min和60min核结合因子α1mRNA的表达比0.5Pa应力刺激组均显著增强(P<0.01)。结论:流体剪切应力可以促进成骨细胞内核结合因子α1的表达。     

流体剪切应力对骨肉瘤成骨样细胞核结合因子α1基因的表达作用

背景：机械应力在成骨细胞功能调控中的作用是近年骨组织生物力学研究的一个重点。流体剪切应力是否可以诱导成骨细胞内核结合因子α1的表达，其规律如何？目前少见报道。 目的：观察流体剪切应力对骨肉瘤成骨样细胞（MG-63）核结合因子α1基因表达的作用. 设计：对比观察实验 单位：解放军第四军医大学航空航天医学系航空航天生物动力学教研室完成. 材料：MG-63人源骨肉瘤成骨样细胞。 方法：实验于2004-11／2005—04在解放军第四军医大学航空航天医学系航空航天生物动力学教研室完成。①对MG-63细胞进行培养，传代60h后，将细胞置于流室系统中进行刺激实验。流体剪切应力分别为0．5Pa（0．5Pa应力刺激组）和1．5Pa（1．5Pa应力刺激组），作用时间分别为15，30和60min。同时取盖玻片置于含培养基的培养皿中，作为流体剪切应力刺激组的即时对照（对照组）．②提取细胞总RNA，进行反转录聚合酶链反应，检测细胞内核结合因子α1mRNA的表达，并计算与内参照GAPDH mRNA的比值. 主要观察指标：不同流体剪切应力及不同作用时间核结合因子α1mRNA的表达值. 结果：①与对照组相比，流体剪切应力刺激组的核结合因子α1mRNA的表达在作用30min和60min均显著增强，且在一定的时间范围内（15-60min），核结合因子α1mRNA的表达水平随着作用时间的延长、应力水平的增加而增强．②1．5Pa应力刺激组在作用30min和60min核结合因子α1mRNA的表达比0．5Pa应力刺激组均显著增强（P〈0．01） 结论：流体剪切应力可以促进成骨细胞内核结合因子α1的表达。     

缺氧诱导因子1α小干扰RNA对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响

背景:缺氧可以影响骨髓间充质干细胞分泌细胞因子,其机制可能是通过缺氧诱导因子1α起作用的.目的:观察缺氧诱导因子1α RNA干扰对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响.方法:贴壁法培养骨髓间充质干细胞,取第3～5代细胞用于实验,倒置显微镜下观察细胞形态,并用流式细胞仪检测其表面标志物CD34、CD44、CD90表达.将骨髓间充质干细胞分四组:常氧对照组(无干预因素)、缺氧组(缺氧24 h)、脂质体对照组(转染空载脂质体后缺氧24 h)、RNA干扰组(转染脂质体介导的RNA干扰序列后缺氧24 h).RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞的缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子mRNA表达水平,ELISA检测骨髓间允质干细胞培养上清缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达水平.结果与结论:同常氧对照组比较,缺氧组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达增高(P<0.05);同脂质体对照组比较,RNA干扰组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达降低(P<0.05).证实了缺氧条件可以使骨髓间充质干细胞血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达增加,抑制缺氧诱导因子1α的表达可以使血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达减少,缺氧诱导因子1α很可能是干细胞移植细胞因子分泌的调控因素.     

Desferrioxamine-driven upregulation of angiogenic factor expression by human bone marrow stromal cells

Bone marrow stromal cells (BMSCs) are the subject of intense research because of their biological properties and potential use for the repair of damaged tissues. Success of BMSC-based therapies, however, relies on a number of methodological improvements, including the establishment of a vascular network providing nutrients and oxygen to the transplanted cells and ensuring their immediate survival and long-term functionality. We described a method to enhance the autocrine expression of angiogenic factors by BMSCs. For this purpose, human BMSCs were treated with desferrioxamine (DFX). No PDGF-BB, VEGF-R1 or -R2 mRNA expression was detected under any of the conditions tested. mRNA and protein expression levels of TGFbeta1 were similar in BMSCs, whether they were exposed to DFX (50 microM) or to control conditions under normoxia for 48 h. In comparison with the results obtained with control conditions under normoxia, exposure of BMSCs to DFX for 48 h resulted in upregulation of bFGF at the protein (26-fold) but not at the mRNA levels and VEGF at both the mRNA (1.5-fold) and protein levels (4.5-fold). In comparison with the results obtained with control conditions under hypoxia, DFX induced a 50% increase in VEGF secretion but led to the same level of hypoxia inducible factor-1alpha protein expression (a transduction factor involved in angiogenic factor expression and known to be activated by DFX). Exposure of BMSCs to DFX resulted in oversecretion of angiogenic factors, suggesting that DFX-treated BMSCs could be used to supply angiogenic factors.     

2型糖尿病大鼠骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1mRNA表达与骨折的愈合

背景:骨髓间充质干细胞成骨分化与成脂分化方向对骨再生和修复的影响足目前的研究热点,过氧化物酶体增殖物激活受体γ特别是过氧化物酶体增殖物激活受体γ 2和核心结合因了α 1对骨髓间充质干细胞分化方向有调控作用.目的:分析2型糖尿病大鼠骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α 1的表达变化与骨折愈合障碍的关系.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-08/12在中南大学第二附属医院中心实验室完成.材料:选用雄性SD大鼠30只,按随机数字表法分为2组,对照组10只,实验组20只,分别给予普通饲料、高糖高脂饲料喂养.方法:大鼠喂养8周后断尾法取血,实验组腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg,对照组沣射等量枸橼酸盐缓冲液.注射2周后断尾法取血,建立大鼠左胫骨牵引成骨模型.行左胫骨中上段骨干横行截骨,安置特制延长外固定架,牵引14 d.主要观察指标:行X射线摄片比较2组大鼠牵引间隙内骨痂的形成;在组织学水平观察牵引骨痂内微骨柱及初始基质前沿形成及骨折两端髓腔内脂肪细胞形成,并计算骨折两端髓腔内脂肪细胞与骨髓腔面积百分比;以反转录-聚合酶链反应法检测双侧股骨骨髓腔内过氧化物晦体增殖物激活受体γ和核心结合因子α 1 mRNA的表达.结果:实验组大鼠高糖高脂饲料喂养8周后,总胆固醇、三酰甘油及窄腹胰岛素浓度均高于对照组(P<0.05～0.01);实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素2周后:空腹血糖、总胆周醇及三酰甘油浓度高于对照组(P<0.05-0.01),说咧2型糖尿病建立成功.X射线摄片显示,实验组大鼠骨折断端之间牵引骨痂形成明显减少,骨痂组织学检查表现为微骨柱基质排列紊乱,初始基质前沿浅染.组织学检查显示,实验组大鼠骨折两端髓腔内脂肪细胞及脂肪细胞占骨髓腔面积百分比高于对照组(P<0.01).反转录一聚合酶链反应法检测显示,实验组大鼠双侧股骨骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ mRNA表达上调(P<0.05),核心结合因子α 1 mRNA表达下调(P<0.05).结论:2型糖尿病大鼠骨折愈合障碍可能与2型糖尿病条件下骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ mRNA表达增加及核心结合因子α 1mRNA的表达受抑制有关.     

骨髓间充质干细胞中突变型人低氧诱导因子1α真核表达载体的表达

背景:转基因小鼠体内实验证实,重组的低氧诱导因子1α可以促进皮肤形态功能正常的血管新生.目的:构建能够在常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和绿色荧光蛋白报告分子的新型腺病毒真核表达载体,并转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,检测该基因在细胞中的表达情况.方法:利用Lipofectamine 2000介导将构建成功的重组腺病毒真核表达载体pAd-HIF1αmu- IRES-hrGFP-1转染HEK293A细胞,包装病毒,以最佳感染指数=50将重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞,并设3个对照组,即阳性对照组:转染Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP-1;阴性对照组:转染Ad-CMV-IRES-hrGFP-1组;空白组:未转染病毒.结果与结论:①腺病毒载体成功转染HEK293A细胞,包装成功,细胞内有大量绿色荧光表达.②转染突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体的细胞在常氧条件下蛋白表达量明显高于转其他3组,3个对照组间差异无显著性意义(P > 0.05).提示突变型腺病毒真核表达载体Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-1在HEK293A内成功包装;突变后低氧诱导因子1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达.     

骨髓间充质干细胞中突变型人低氧诱导因子1α真核表达载体的表达

背景：转基因小鼠体内实验证实,重组的低氧诱导因子1α可以促进皮肤形态功能正常的血管新生。目的：构建能够在常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和绿色荧光蛋白报告分子的新型腺病毒真核表达载体,并转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,检测该基因在细胞中的表达情况。方法：利用Lipofectamine2000介导将构建成功的重组腺病毒真核表达载体pAd-HIF1αmu-IRES-hrGFP-1转染HEK293A细胞,包装病毒,以最佳感染指数=50将重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞,并设3个对照组,即阳性对照组：转染Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP-1;阴性对照组：转染Ad-CMV-IRES-hrGFP-1组;空白组：未转染病毒。结果与结论：①腺病毒载体成功转染HEK293A细胞,包装成功,细胞内有大量绿色荧光表达。②转染突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体的细胞在常氧条件下蛋白表达量明显高于转其他3组,3个对照组间差异无显著性意义（P〉0.05）。提示突变型腺病毒真核表达载体Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-1在HEK293A内成功包装;突变后低氧诱导因子1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达。     

Effect of stromal cells of the bone marrow on hematopoiesis in culture

The authors studied the effect of medullary fibroblasts on granulomonocytopoiesis in a semi-solid agar gel. Seventy-three untreated patients with the blood system diseases and 18 hematologically healthy subjects were entered into the study. The medium conditioned with fibroblasts and fibroblasts themselves are capable of stimulating granulomonocytopoiesis. In addition, fibroblasts can exert an inhibitory effect on granulomonocytopoiesis, with the degree of this effect being dependent on the agar layer thickness. Patients with chronic lympholeukemia and acute lymphoblastic leukemia showed a decrease in the stimulating activity of fibroblasts, whereas in patients with chronic myeloleukemia, that activity was elevated. In patients with neutropenic conditions, the stimulating activity of fibroblasts depended on a factor that produced neutropenia. The role of the alterations in question in the pathogenesis of the blood system diseases and other possible influences of fibroblasts on myelopoiesis are discussed.