人骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞

目的：探讨人骨髓基质干细胞体外定向诱导成骨细胞的培养方法，为应用人骨髓基质干细胞进行骨科细胞治疗提供依据。方法：抽取人骨髓组织，梯度离心后置于含100ml／L小牛血清的DMEM培养液中，培养24h换液，待细胞完全贴壁融合长满瓶底后，胰酶消化，传代，换诱导培养基继续培养、扩增。倒置显微镜观察细胞的形态，结合细胞化学染色、免疫组织化学染色进行细胞鉴定，以及采用细胞增殖法（MTT比色试验）分别于1、2、4、6、8、d测细胞OD值，绘制细胞生长曲线。结果：传代细胞4～5d即可传代，在诱导培养基中2周形成多层结构，并聚集成黑色结节。培养细胞ALP染色强阳性，Ⅰ型胶原免疫组化染色呈黄褐色，细胞在接种后3～6d增殖最快。结论：本实验方法应用骨髓基质干细胞体外定向诱导所培养的细胞符合成骨细胞的形态特征和生物学特性。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞的实验研究

目的:研究大鼠骨髓基质干细胞体外培养的生长特点和诱导条件下的成骨能力.方法:通过密度梯度离心和贴壁培养法分离大鼠骨髓基质干细胞,应用含地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠的诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并检测碱性磷酸酶活性及细胞矿化作用.结果:骨髓基质干细胞呈成纤维细胞样生长,增殖能力强,生长迅速.诱导条件下细胞的碱性磷酸酶活性明显增高,并且出现矿化结节.结论:骨髓基质干细胞易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨能力肯定,适合作为骨组织工程的种子细胞.     

骨髓基质干细胞定向诱导分化成骨的研究进展

近几十年来，骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）因其具有多方向分化的潜能而进行深人研究。上世纪80年代，Owen和Piersma等,通过实验使BMSCs分化为成骨细胞和脂肪细胞。2000年Woodbury等、Sanchez等也通过实验的方法证明BMSCs还可以分化为神经细胞。     

骨髓基质干细胞体外软骨定向诱导方法的研究进展

种子细胞来源一直是限制软骨组织工程发展的瓶颈,骨髓基质干细胞(BMSCs)具有取材创伤小、增殖能力强及具多向分化潜能等优点,已逐渐成为软骨构建种子细胞的研究热点。其关键问题是如何获得大量纯化的BMSCs并在体外定向诱导为软骨表型的细胞。该文就BMSCs体外软骨定向诱导方法的研究进展进行综述,以期为应用BMSCs构建软骨组织提供参考。     

骨髓基质干细胞体外软骨定向诱导方法的研究进展

种子细胞来源一直是限制软骨组织工程发展的瓶颈,骨髓基质干细胞(BMSCs)具有取材创伤小、增殖能力强及具多向分化潜能等优点,已逐渐成为软骨构建种子细胞的研究热点.其关键问题是如何获得大量纯化的BMSCs并在体外定向诱导为软骨表型的细胞.该文就BMSCs体外软骨定向诱导方法的研究进展进行综述,以期为应用BMSCs构建软骨组织提供参考.     

骨髓基质干细胞体外诱导成骨细胞的研究进展?

大量科学研究表明,来源于中胚层的未分化的间充质细胞是骨髓非造血干细胞中的一类,这类细胞体外扩增程度高、可多个向分化、容易进行移植、可支持造血等,其独特之处为该细胞可向诸如成骨细胞、软骨细胞、脂细胞、肌细胞、神经细胞、内皮细胞、肝细胞等多种细胞分化,所以其又被称为骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)。BMSCs 是获取目标细胞、目标组织热门的种子细胞[1]。近几十年来,关于 BMSCs 的多向分化特性有了不断深入的研究,在探讨如何将BMSCs 诱导分化为成骨细胞的方法方面做了大量的科学研究。现就 BMSCs 体外定向诱导成骨细胞的方法作一综述,对其研究进展作一回顾。     

兔骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

目的体外诱导兔骨髓基质干细胞（BMSC）向软骨细胞定向分化，并对分化后的细胞进行鉴定。方法选用16周新西兰大白兔，于胫骨或股骨抽取骨髓，经梯度离心、培养、扩增，取第3代BMSC按一定比例种植于6孔板中，并加入含有转化生长因子β1、地塞米松和维生素C的培养液、于不同时间点取材固定，甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴别、结果诱导的软骨样细胞甲苯氨蓝异染性；II型胶原免疫组化阳性。结论在本实验条件下，获取的兔BMSC生长稳定、增殖快，并成功地诱导其向软骨细胞表型转化。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 明确大鼠骨髓间充质干细胞(bone mensenchymal stem cells,BMSCs)在体外全骨髓培养条件下的生物学特性及其向成骨细胞分化的能力,探索更为简便有效的BMSCs体外培养方法.方法 提取大鼠原代BMSCs,用酠EM完全培养基和成骨诱导条件培养基体外培养,倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态;台盼蓝活细胞计数绘制细胞生长曲线;ALP检测试剂盒检测ALP含量变化和von Kossa染色检测细胞矿化结节,以判断细胞是否向成骨细胞分化.结果 全骨髓培养法在体外培养的大鼠原代BMSCs贴壁生长,呈梭形或多角形;使用Dex-SaMEM向成骨诱导后的BMSCs具有与成骨细胞在体外培养时相似的特征,倍增时间延长;合成ALP能力显著增强(P<0.05),von Kossa染色出现阳性的棕褐色或棕黑色团块的钙化结节.结论 全骨髓培养法取材方便,经成骨诱导培养的BMSCs表现出成骨细胞的形态特征和生物学特性,该方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法.     

骨髓间充质干细胞成骨细胞分化研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)的基础研究和临床应用广泛,BMSCs具有良好的成骨分化潜能,同时具有多向分化的能力,可向脂肪、骨、软骨细胞分化。BMSCs在合适的生长因子作用下可以快速地向成骨细胞分化和增殖,并且具有容易取材、容易分离、容易扩增、多谱系转化而不发生明显免疫排斥反应等优点,在骨组织工程领域拥有广泛的应用价值。但是,随着使用增多,存在的问题也日益突出,如生物学特性、分离鉴定、诱导分化和临床应用进展等问题还有待进一步解决。     

体外诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探讨成体骨髓基质干细胞体外定向诱导分化为内皮细胞的可行性，为心血管组织工程提供新的种子细胞来源。方法：骨髓穿刺抽取绵羊骨髓液，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，通过贴壁培养纯化骨髓基质干细胞。以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养原代细胞，并以VEGF诱导骨髓基质干细胞向内皮细胞分化。通过CD34、CD31流式细胞仪分析，免疫组化CD34、CD31、Ⅷ因子相关抗原染色鉴定内皮细胞，UEA结合实验及NO含量测定评价内皮细胞功能。结果：骨髓基质干细胞表达α-SMA，不表达CD34和CD31。体外定向诱导2周后分化为内皮细胞。呈梭形，表达CD34和CD31及Ⅷ因子相关抗原，UEA结合试验阳性，并具有分泌NO的功能。结论：体外培养条件下骨髓基质干细胞能够分化为内皮细胞，并具有成熟内皮细胞的生物学特性和功能。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物特性的观察

目的：观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养的生物学特性和作为组织工程的种子细胞的可能性。方法：将人骨髓MSCs自骨髓中分离、纯化和培养，观察原代和传代培养的增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示，在体外培养条件下人骨髓MSCS有活跃的增殖能力。结论：体外获得的人骨髓MSCs的生物年龄较为年轻，可以为组织工程的进一步研究提供种子细胞。     

人骨髓内皮前体细胞的体外培养和生物学特性

目的:体外分离纯化人骨髓内皮前体干细胞,研究其基本生物学特性.方法:利用密度梯度离心法分离成人骨髓得到单个核细胞,再用内皮细胞条件培养基培养得到内皮前体干细胞,观察细胞生长特性,通过检测细胞血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和透射电镜对培养细胞进行鉴定.结果:原代培养后细胞贴壁生长,7～10 d形成集落或融合呈卵石形,免疫组化荧光染色后结果显示VEGFR-2, Ⅷ/vWF 阳性,透射电镜显示细胞内具有特征性的W-P小体.结论:用密度梯度离心法和条件培养可以从骨髓得到高纯度内皮前体干细胞,该细胞具有与血管内皮细胞共同的特征,可以进一步分化为血管内皮细胞,是理想的组织工程种子细胞.     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性。方法 采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达。结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降。流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性。细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)％,其中s期为(4.12±2.35)％;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)％,说明大部分细胞仍然处于静止期。流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征。结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学性质

目的：建立人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分离培养方法,观察细胞形态,探讨BM-MSCs生物学特征。 方法：从人骨髓中利用Percoll分离有核细胞,培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态。应用流式细胞仪测定细胞周期及细胞表面抗原特征。 结果;BM-MSCs具有纤维样细胞形态特征,独特的表型,即CD29、CD44、CD166和HLA-ABC阳性,CD34、CD45和HLA-DR阴性;细胞周期分析显示：12.8%处于S期,76.4%处于G₀/G₁期;细胞生长倍增时间为2~3 d。 结论：BM-MSC_S是一群均一的单克隆细胞,具有独特的增殖特征及表面标记。     

大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的体外诱导分化

目的 通过体外药物诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化，进一步验证其多能分化特性。方法 分离培养大鼠MSCs，5－脱氧杂氮胞苷（5－Aza－cdR）作用24h后继续培养4wk，电镜超微结构观察，免疫细胞化学染色鉴定。结果 5－Aza-cdR诱导4wk后的部分大鼠骨髓间充质干细胞α-Actinin,Troponin T阳性表达，电镜观察可见横纹样结构形成，核呈卵圆形，位于细胞中央位置，胸质中可见富集的糖原颗粒及大量线粒体。结论 MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞，能在体外条件下经5－Aza-cdR诱导分化成心肌细胞。     

人骨髓基质干细胞克隆的培养及其向神经元样细胞的定向诱导分化

目的探讨人骨髓基质干细胞克隆的体外长期培养方法及其生物学特性。方法贴壁生长的基质干细胞以套环法消化分离,扩增培养,待细胞融合,传代培养。检测细胞的生长曲线、表面标记、克隆形成能力和向神经元定向诱导分化的潜能。结果克隆培养的骨髓基质干细胞能传代20代以上,表达CD13、CD29、CD59,不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA-DR;传代17代时能诱导分化为神经元样细胞。结论该培养条件能有效扩增骨髓基质干细胞,并保持分化潜能;克隆来源的骨髓基质细胞有相同的生物学特性。     

BrdU体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 探讨连续培养的骨髓间充质干细胞(MSCs)的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)最佳标记时间、剂量。方法 差速贴壁法对SD鼠MSCs进行体外传代培养;第6代细胞行流式细胞仪鉴定细胞的表面抗原;以终浓度分别为5、10、15μmol/L的BrdU检测最佳标记剂量;在细胞生长融合前72、48、36、24、12、3h加入BrdU,使终浓度为10μmol/L,并分别孵育至细胞融合,测定BrdU的标记率,找出最佳标记时间;免疫组化分析BrdU标记率。结果 流式细胞仪检测所标记的细胞表达CD29和CD44,不表达CD11b和CD45;终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,并且连续传5代均可检测到。结论 传代后贴壁生长的梭形细胞为MSCs,终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,且可以连续检测到,提示BrdU标记可用于MSCs移植入体内后存活、生长和分化的动态观察。     

成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的 研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞(MSC)在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值。方法 抽取健康成年志愿者骨髓,在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中采用全骨髓培养法,培养传代后改用含地塞米松(1×10^-8 mol/L)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)和维生素C(50 mg/L)的条件培养基培养,在相差显微镜和电镜下观察细胞形态,免疫组化检测Ⅰ型胶原,Gomori钙钴法进行碱性磷酸酶(AP)染色、von Kossa法进行钙结节染色,同时测定细胞内AP(碱性磷酸酶)含量变化,并进行统计学分析。结果 原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养2~3周后,透射电镜下观察见大量扩张的粗面内质网、高尔基体和线粒体,细胞核较为幼稚。Ⅰ型胶原染色、AP及钙结节染色等均为强阳性;AP活性明显增强(P<0.05)。结论 MSC取材安全方便,易于诱导分化为成骨细胞,有望成为理想的骨组织工程种子细胞来源,本实验方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法之一。     

利用软骨细胞外基质来源的多孔支架与骨髓基质干细胞体外长期培养组织工程化软骨的试验研究

研究背景 关节软骨损伤临床常见,但损伤后自我修复能力极差,目前的修复方法均有其局限性。在先前的研究中,我们研制了关节软骨细胞外基质来源的多孔支架（Cartilage ECM-derived porous scaffold, CEDPS）并观察了并在裸鼠体内异位构建软骨。但在进一步可能的临床应用之前,应进一步评估其体外培养组织工程软骨的特点及可行性。 方法 本研究利用关节软骨细胞外基质来源的支架及骨髓基质干细胞体外长时间培养构建软骨组织。粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架。扫描电镜及Micro-CT观察其微观结构,并进行细胞毒性试验,组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖（GAG）、DNA含量,生物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;骨髓基质干细胞经含TGF-β1, bFGF的条件培养基成软骨诱导后鉴定,种植到支架上,荧光显微镜及扫描电镜观察细胞黏附情况,Dead/Live免疫荧光染色观察支架内部细胞活性,体外培养1,3周后观察大体形态和组织学形态变化,同时行II型胶原免疫组织化学分析。 结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测：总胶原含量为708.2?44.7μg/mg,GAG含量为254.7?25.9μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E = 1.226?0.288MPa,覆水后压缩弹性模量E = 0.052?0.007MPa。体外培养的BMSCs-CEDPS复合体形成了类软骨样组织,Dead/Live染色表明支架内部均为活细胞,电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显。组织学结果表明蕃红花“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞外有大量基质分泌。 结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好的生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织。     

In vitro cartilage production using an extracellular matrix-derived scaffold and bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Background Cartilage repair is a challenging research area because of the limited healing capacity of adult articular cartilage.We had previously developed a natural,human cartilage extracellular matrix （ECM）-derived scaffold for in vivo cartilage tissue engineering in nude mice.However,before these scaffolds can be used in clinical applications in vivo,the in vitro effects should be further explored.Methods We produced cartilage in vitro using a natural cartilage ECM-derived scaffold.The scaffolds were fabricated by combining a decellularization procedure with a freeze-drying technique and were characterized by scanning electron microscopy （SEM）,micro-computed tomography （micro-CT）,histological staining,cytotoxicity assay,biochemical and biomechanical analysis.After being chondrogenically induced,the induction results of BMSCs were analyzed by histology and Immunohisto-chemistry.The attachment and viability assessment of the cells on scaffolds were analyzed using SEM and LIVE/DEAD staining.Cell-scaffold constructs cultured in vitro for 1 week and 3 weeks were analyzed using histological and immunohistochemical methods.Results SEM and micro-CT revealed a 3-D interconnected porous structure.The majority of the cartilage ECM was found in the scaffold following the removal of cellular debris,and stained positive for safranin O and collagen Ⅱ.Viability staining indicated no cytotoxic effects of the scaffold.Biochemical analysis showed that collagen content was （708.2±44.7）μg/mg,with GAG （254.7±25.9） μg/mg.Mechanical testing showed the compression moduli （E） were （1.226±0.288） and （0.052±0.007） MPa in dry and wet conditions,respectively.Isolated canine bone marrow-derived stem cells （BMSCs） were induced down a chondrogenic pathway,labeled with PKH26,and seeded onto the scaffold.Immunofluorescent staining of the cell-scaffold constructs indicated that chondrocyte-like cells were derived from seeded BMSCs and excreted ECM.The cell-scaffold constructs contained pink,smooth and translucent cartilage-like tissue after 3 weeks of culture.We observed evenly distributed cartilage ECM proteoglycans and collagen type Ⅱ around seeded BMSCs on the surface and inside the pores throughout the scaffold.Conclusion This study stuggests that a cartilage ECM scaffold holds much promise for in vitro cartilage tissue engineering.