SARS冠状病毒M基因的克隆及序列分析

目的克隆SARS冠状病毒(SARS-CoV)GD322株M基因,并进行序列分析。方法根据GenBank中公布的SARS冠状病毒Tor2株M基因序列,设计一对引物,用RT-PCR法从SARS-CoVGD322株基因组中扩增M基因片段。克隆至pET-32(a)载体,转化大肠杆菌BL-21后测序,利用DNAstar和ClustalX分析所测序列翻译的氨基酸与81株SARS-CoVM基因翻译的氨基酸序列的差异。结果该M基因与Tor2株M基因核苷酸同源性为99.86%;与已收集的81株SARS-CoVM基因所译氨基酸相比,和41株(占50.62%)M蛋白完全同源,37株(占45.68%)仅有一个氨基酸改变,同源性为99.55%,仅与3株(占3.70%)有2个氨基酸差异,同源性为99.10%。结论已获得具有代表性的SARS-CoVM基因重组质粒。     

SARS相关冠状病毒S2基因的克隆及其DNA疫苗的免疫效果

目的：构建抗原基因为SARS相关冠状病毒(severe acute resplratory syndrome coronavtrus，SARS—CoV)S2基因的DNA疫苗，将其接种小鼠后观察病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的S2基因片段克隆至真核表达载体，随之将质粒进行小鼠肌内接种免疫，定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：疫苗接种后第2周就能检测出病毒特异性抗体，随着时间的延续，抗体水平逐步升高，而空质粒对照组未检测出明显的特异性抗体。结论：以S2为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体。     

SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因克隆和变异分析

目的:获得SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因的克隆.方法:将SARS病毒RNA基因组逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行酶切及测序分析,并与Genbank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为1905 bp,与Genbank中另外45株的SARS病毒株的S蛋白S1片段基因比较,共有13个位点发生突变,其中有8处为同义突变,5处为错义突变.结论:成功克隆SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因,为该基因的表达及功能研究奠定了基础.     

SARS相关冠状病毒Spike蛋白定点诱变

目的分析确定SARS-CoV splke蛋白序列中对SARS—CoV的感染能力相关性较强的位点,并进行定点诱变。方法比对不同来源株SAPS-CoV的Spike蛋白的序列,计算其相应位点的突变墒值和突变几率,结合进一步的生物信息学分析,筛选出经预测可能影响spike蛋白与其受体结合进而导致SARS病毒对宿主细胞的膜融合侵染能力的7个位点,对各个位点用重叠延伸PCR法或直接PCR法进行人工定点诱变,获7个突变片段,之后将各片段亚克隆至克隆载体PSP72中。结果经PCR和测序确认各片段点突变成功,并正确插入克隆载体PSP72中。结论成功实施Spike蛋白的定点诱变,获得7个突变片段的重组子,这些突变体可为研究这些突变位点在Spike蛋白与受体结合中的意义,进而可为阐述spike蛋白的结构与功能的关系、揭示Spike蛋白变异与SARS病毒侵入（染）细胞能力的相关性提供坚实的实验基础。     

SARS冠状病毒刺突蛋白编码基因及氨基酸序列的同源性分析

①目的 分析严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)编码基因及氨基酸序列的变异情况，并在GenBank中寻找其同源序列。②方法 将网上公布的具有全基因序列的12株SARS冠状病毒S蛋白的编码基因序列及氨基酸序列应用Clustal W方法对排分析变异情况，并应用GenBank的Blast对排功能寻找被GenBank收录的同源序列。③结果 SARS冠状病毒S蛋白相对比较保守，变异率较低，其氨基酸序列与鼠的肝炎病毒氨基酸序列有较高的同源性，某些核苷酸序列与人的基因组有同源性。④结论 S蛋白编码基因及氨基酸序列相对保守，为预防性疫苗的研发提供了可行性；据其同源基因及蛋白序列可以预测S蛋白的二、三级结构，对推测SARS可能的发病机制有积极作用。     

SARS冠状病毒基因组初步分析

世界卫生组织(WHO)在今年3月12日发出关于非典型肺炎(atypica l pneumonia)的全球性警告 ,经过WHO的组织协调,3月17日成立了一个全球性的合作研究网络,由10个国家和地区的11个顶级实验室组成[1].中国疾病预防控制中心病毒研究所和广东省疾病预防控制中心也于3月28日加入该研究网络[2].该网络启动后,取得了一系列的进展.香港大学最先于 3月22日宣布分离出了引起SARS的一种未知冠状病毒[3].     

鼠冠状病毒S蛋白的研究进展

2003年爆发的严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrorae，sARS)的病原体被确立为一种新的冠状病毒SARS-CoV。世界各国的科学家正努力研究SARS病毒的生物学特征和可能的药物防治靶点及疫苗。     

结核分枝杆菌phoS2基因的克隆及序列分析

目的 扩增结核分枝杆菌phoS2基因,并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析.方法 以结核菌标准菌株H3TRv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌phoS2抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析.结果 成功扩增出结核分枝杆菌phoS2抗原基因,测序表明该片段开放阅读框为927bp,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为81%,推导编码氨基酸序列同源性为87%.结论 成功克隆phoS2基因,为结核病原核表达及相关研究奠定了基础.     

2株SARS相关冠状病毒主要结构蛋白基因的多态性分析

目的:分析2株SARS相关冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus,SARS-CoV)HK21378和BJi04的主要结构蛋白基因序列的多态性以及蛋白质结构变化与功能的关系.方法:提取组织培养物中的SARS-CoV基因组RNA,对RT-PCR产物进行测序;以GZ02为参照序列,对蛋白质编码序列进行基因多态性分析和蛋白质结构与功能关系分析.结果:①与SARS-CoV GZ02株相比较,HK21378和BJi04主要结构蛋白编码序列共有14个变异位点,其中9个变异位点为两者共有,3个变异位点见于HK21378,2个变异位点见于BJ104;与GenBank数据库已发表的103株SARS-CoV基因组数据比较,变异位点22901(T→G)为BJ104特有,未见于已发表的其他SARS-CoV基因组中;在14个多态位点中,有5个多态位点为同义突变,其余9个为非同义突变.②14个变异位点中有11个变异发生在S蛋白编码区,其碱基变异频率为3.7/kb;2个见于M蛋白编码区,其碱基变异频率为3.0/kb;1个见于N蛋白编码区,碱基变异频率为0.8/kb;而E蛋白编码区未见变异位点.结论:SARS-CoV的主要结构蛋白编码区容易发生变异,尤其是膜表面S蛋白和M蛋白编码区.     

SARS冠状病毒N蛋白的真核细胞定位研究

目的:为进一步探讨SARS-CoV核衣壳蛋白(N蛋白)在病毒复制及细胞通路中的作用,观察了核衣壳蛋白不同区段在细胞内的定位.方法:应用核定位序列分析软件分析N蛋白序列,找出其中的核定位信号序列;构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与SARS-CoV不同长度核衣壳蛋白区段融合表达的pEGFP-C1重组载体,对293细胞进行瞬时转染,在荧光显微镜下观察核衣壳蛋白不同区段在细胞内的定位.结果:不同的核定位信号分析软件分析的结果不同,Prosite找到的核定位信号位于N蛋白第373-389或374-390aa,而PredictNLS server找到的核定位信号位于N蛋白第36-44aa;全长核衣壳蛋白及第161-422aa区段均定位于细胞质,第1-187aa区段定位于细胞质和细胞核.结论:SARS-CoV核衣壳蛋白的核定位信号可能位于N蛋白第36-44aa.     

SARS-CoV S1蛋白在甲醇营养型酵母中表达及鉴定

目的获得保持生物学活性、易于纯化、高产量的严重急性呼吸道综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrom coronavirus,SARS-CoV)S1蛋白,以便进一步研究S1蛋白及其抗体的功能.方法将SARS-CoV S1基因重组入酵母表达载体pMETαA,经过酶切和测序鉴定后,通过电穿孔法将重组质粒S1-pMETαA转化入宿主酵母菌株PMAD11,使其在甲醇的诱导下表达目的蛋白.最后用覆盖分析法对重组转化子初步分析,SDS-PAGE和Wesntern blotting法鉴定目的蛋白的表达和特异性.结果酶切鉴定和测序结果证实了S1基因成功地克隆到pMETαA载体中;覆盖分析、SDS-PAGE和免疫印迹法证实S1基因得到正确的表达.结论利用酵母表达系统,成功地克隆和表达了SARS-CoV S1蛋白,为进一步纯化该蛋白和研究其功能奠定了基础.     

SARS冠状病毒PUMC_2株全基因组cDNA分段克隆

目的分段克隆SARS冠状病毒PUMC2株的全基因组cDNA。方法以SARS冠状病毒PUMC2株基因组RNA为模板,用RT-PCR扩增cDNA片段,PCR产物经纯化后,连接入pGEM-T载体中,进行序列测定。结果获得了SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA的分段克隆。结论SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA分段克隆的获得,为SARS冠状病毒基因功能的研究和全长有感染性cDNA的克隆奠定了基础。     

Spike蛋白B-细胞线性表位多肽在SARS-CoV感染过程中作用的体内研究

目的 明确SARS-CoV Spike蛋白来源的不同B细胞免疫多肽在SARS-CoV感染h-ACE2C57转基因小鼠过程中的作用.方法 用不同B细胞表位多肽S471-503,S604-625,S1164-1119及S597-625单独或联合免疫h-ACE2C57转基因小鼠,检测血清抗体滴度,当血清中的抗体达到有效滴度时,用SARS-CoV感染小鼠,感染后4 d处死小鼠,观察SARS-CoV感染靶器官肺组织的组织形态学变化,应用RT-PCR的方法检测肺组织中SARS-CoV病毒表达量的差异.结果 S471-503,S604-625,S1164-1119这三种多肽联合免疫组的小鼠,肺组织的病理性改变要比0.9%NaCl免疫的对照组轻,PCR结果显示SARS-CoV表达情况减弱,S597-625与S604-625相比,其N端增加了7个氨基酸残基,但S597-625多肽单独免疫小鼠其肺组织病理性改变与对照组相比,程度却出现了抗体依赖的增强作用(antibody dependent enhancement,ADE),RT-PCR结果也显示病毒的表达量有所增强.结论 我们的研究表明,Spike蛋白S1结构域27个氨基酸残基的B细胞线形免疫原S597-625抗体的ADE作用是独立于Fcγ受体之外的.这种非经典ADE作用可以提供更多的研究价值.疫苗是有效抵抗各种感染的工具之一,在我们的研究中,这种ADE现象可以减弱或是平衡掉其他中和抗体的作用.因此,对ADE现象进行认真系统的阐述是非常有必要的,它关系着疫苗安全性问题以及新疫苗在生产过程中的工艺实施问题.     

SARS-CoV Spike蛋白来源多肽及其单克隆抗体在SARS-CoV感染过程中的作用

目的 探讨SARS-CoV Spike蛋白来源的B细胞表位多肽及其产生的单克隆抗体在SARS-CoV感染Vero-E6细胞系及h-ACE2ICR转基因小鼠过程中的作用,为SARS-CoV疫苗的筛选奠定初步工作基础.方法 将Vero-E6细胞接种于96孔板上,首先应用两种B细胞表位多肽制备而成的单克隆抗体S471-5034A-10及S604-62511B1进行中和实验,随后在相同的实验中加入相关(S471-503,S604-625)或无关多肽干扰抗体的中和作用,当病毒对照空中70%细胞出现细胞病变时,对活细胞进行中性红染色并计算中和指数以分析抗体的中和水平.应用鉴定有中和保护作用的抗体来源的多肽进行h-ACE2ICR转基因小鼠病毒感染后的治疗实验,进一步确定多肽在SARS-CoV体内感染过程中的保护性作用.结果 两种B细胞表位多肽来源的单克隆抗体均可以在一定程度上中和SARS-CoV对Vero-E6细胞的感染,而且这种中和作用可以被加入的其来源多肽所阻滞,这种阻滞作用的强弱与加入多肽的剂量具有相关性.多肽小鼠体内感染治疗实验表明随着体内注射多肽剂量的增加,受感染小鼠肺组织表现出的急性间质性肺炎程度随之减轻,肺组织内检测的病毒载量也有所下降.结论 目前尚无安全有效的治疗SARS的药物,而疫苗是有效抵抗各种感染的工具之一,表位疫苗是新近发展起来的疫苗形式,安全性好,诱导的免疫针对性强.我们的研究表明,S471-5034A-10及S604-62511B1两种单克隆抗体可以中和SARS-CoV对Vero-E6细胞的感染,同时Spike蛋白来源的S471-503多肽在小鼠的感染治疗实验中也表现出保护性作用,可以作为防治SARS-CoV感染的表位疫苗研制候选肽段.     

SARS恢复猴和灭活疫苗免疫实验猴再次感染SARS-CoV研究

目的研究SARS-CoV实验感染恢复猴，以及灭活疫苗免疫猴对SARS—CoV再次感染的疾病状况。方法动物分四组，分别为SARS感染恢复动物组，灭活疫苗免疫不同时间2组和SARS模型对照组。动物分别接种病毒，1～7d进行病毒检测和血清学检测，7d后安乐处死动物，进行病理检测。结果实验感染SARS-CoV猴和灭活疫苗免疫猴均产生了中和抗体，猴体内SARS-CoV复制得到一定程度的抑制，病理变化也比SARS-CoV模型组轻。结论SARS-CoV感染恢复猴对SARS-CoV再次感染有一定抵抗作用；灭活疫苗免疫是预防实验猴感染SARS—CoV的有效方法。     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

血管紧张素转换酶2在SARS-CoV感染中的功能(第2部分)--SARS-CoV在ACE2表达细胞中的复制和ACE2基因敲除对小鼠SARS-CoV感染的保护作用

目的研究ACE2在SARS-CoV感染中的作用。方法利用表达人类ACE2的小鼠成纤维细胞系和ACE2基因敲除小鼠研究SARS-CoV在小鼠成纤维细胞中的复制和ACE基因剔除小鼠体内的复制。结果SARS-CoV可以感染，并在表达人类小鼠ACE2的小鼠成纤维细胞中的复制，ACE2基因的缺失严重影响了SARS病毒与组织的结合，和SARS病毒在动物体内的复制，ACE2基因剔除对小鼠SARS—CoV感染具有保护作用。结论ACE2是SARS-CoV的主要受体，并且是SARS治疗潜在的靶基因。     

急性传染性非典型肺炎病毒M蛋白片段抗原性鉴定及其B细胞表位分析

目的:鉴定原核表达的重组急性传染性非典型肺炎(SARS)病毒M蛋白N端1～43氨基酸(aa)的抗原性,并筛选其B细胞表位。方法:GlutathioneSepharose4B亲合层析柱纯化M融合蛋白,用SARS患者恢复期血清分别通过间接ELISA方法和Westernblot鉴定M蛋白片段的抗原性。为了定位B细胞表位,进一步将M蛋白片段截短为部分重叠的2段表达,分别表达含M蛋白N端1～28aa、16～43aa的融合蛋白,通过Westernblot检测B细胞表位所在位置。结果:获得了纯化的M融合蛋白;间接ELISA和Westernblot结果均证实,M蛋白片段有很强的抗原性;并进一步明确B细胞表位位于M蛋白N端1～15aa片段中。结论:原核表达的SARS病毒M蛋白片段N端1～15aa含有一个很强的B细胞表位,这将有助于SARS诊断试剂的研制,也可为多肽疫苗的研制提供帮助。     

SARS冠状病毒受体结合域在大肠杆菌中的融合表达和鉴定

目的为了研究SARS冠状病毒感染与免疫和跨种属传播机制,从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒spike蛋白基因中,克隆病毒受体结合域（receptor binding domain,RBD）基因片段,在大肠杆菌中进行表达。方法用PCR方法扩增RBD基因,先经T-A连接,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆测序鉴定,双酶切后进一步亚克隆至质粒pGEX-6p-3,构建原核表达重组质粒,通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21中表达,并用SDS-PAGE和Western-blotting方法检测表达情况。结果扩增了RBD的编码基因并成功构建了其原核表达载体pGEX-6p-3-hsRBD和pGEX-6p-3-csRBD,RBD能够在大肠杆菌中获得良好的表达,表达的融合蛋白相对分子质量约为47000。结论本工作利用基因工程技术表达了两物种来源的SARS冠状病毒的RBD,两者具有高度的同源性,因此我们可通过配基受体结合实验,为进一步研究SARS冠状病毒感染与免疫及跨种属传播机制奠定了基础。